Rilevamento dell'accumulo di amiloide-β mediante colorazione immunofluorescente in un modello murino di Alzheimer

Riepilogo

Nella neuropatologia della malattia di Alzheimer, una delle caratteristiche più cruciali è la deposizione di amiloide-β. In questo protocollo, descriviamo il metodo di colorazione immunofluorescente in topi transgenici 5×FAD per rilevare l'accumulo di amiloide-β nelle placche. Verrà descritto in dettaglio il processo di perfusione, criosezione, colorazione e quantificazione.

Abstract

La malattia di Alzheimer (AD) è una malattia neurodegenerativa che contribuisce al 60-70% delle demenze in tutto il mondo. Uno dei tratti distintivi dell'AD risiede senza dubbio nell'accumulo di amiloide-β (Aβ) nel cervello. L'Aβ è prodotto dalla scissione proteolitica della proteina precursore della beta-amiloide (APP) da parte della β-secretasi e della γ-secretasi. In circostanze patologiche, l'aumento della scissione β dell'APP porta alla sovrapproduzione di Aβ, che si aggrega nelle placche di Aβ. Poiché le placche di Aβ sono una caratteristica della patologia dell'AD, rilevare la quantità di Aβ è molto importante nella ricerca sull'AD. In questo protocollo, introduciamo il metodo di colorazione immunofluorescente per visualizzare la deposizione di Aβ. Il modello murino utilizzato nei nostri esperimenti è il 5×FAD, che porta cinque mutazioni trovate nell'AD familiare umano. I deficit neuropatologici e comportamentali dei topi 5xFAD sono ben documentati, il che lo rende un buon modello animale per studiare la patologia Aβ. Introdurremo la procedura che include la perfusione transcardica, la criosezione, la colorazione immunofluorescente e la quantificazione per rilevare l'accumulo di Aβ nei topi 5×FAD. Con questo protocollo, i ricercatori possono studiare la patologia Aβ in un modello murino di AD.

Introduzione

Il morbo di Alzheimer (AD) è una malattia neurodegenerativa che causa il 60%-70% della demenza in tutto il mondo e costa molte risorse sociali¹. È noto che l'accumulo di amiloide-β (Aβ) è un segno patologico della malattia di Alzheimer. La proteina precursore dell'amiloide (APP) è una proteina integrale di membrana che esiste in molti tessuti. Il peptide Aβ, costituito da 36-42 amminoacidi², è prodotto dalla successiva scissione della β- e della γ-secretasi in APP ^3,4. I cambiamenti nella scissione dell'APP e le mutazioni nel gene APP portano alla sovrapproduzione di Aβ. Le molecole di Aβ possono aggregarsi per formare oligomeri o fibrille, che si ritiene siano neurotossici ^5,6. In studi precedenti, è stato dimostrato che l'accumulo di Aβ è correlato alla morte neuronale nel ^7,8,9 d.C.

I topi transgenici 5×FAD (C57BL/6J) contengono 3 mutazioni in APP e 2 mutazioni in PSEN1. L'accumulo di Aβ intracellulare inizia già a 1,5 mesi di età. L'accumulo extracellulare di Aβ è stato riscontrato circa 2 mesi, nella corteccia e nell'ippocampo. L'accumulo è aumentato rapidamente con l'età di¹⁰ anni. La patologia Aβ ben documentata lo rende un buon modello animale per il nostro protocollo.

L'obiettivo del metodo di colorazione descritto è quello di visualizzare e quantificare la deposizione di Aβ nel cervello del modello di topi AD. Verrà introdotta la procedura che include la perfusione transcardica di paraformaldeide, la criosezione, la colorazione immunofluorescente e la quantificazione per rilevare l'accumulo di Aβ nei topi 5×FAD. Questo protocollo è un metodo affidabile e semplice per studiare la patologia Aβ nel modello murino di AD.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite con l'approvazione del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali della Xuzhou Medical University e in conformità con le linee guida dei regolamenti governativi cinesi per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

1. Perfusione di topi

NOTA: Maggiori dettagli sulla procedura di perfusione possono fare riferimento al video del laboratorio ¹¹ di Wiliam Shain.

1. Anestetizzare topi transgenici 5×FAD (C57BL/6J) con pentobarbital sodico all'1% (50 mg/kg di peso corporeo) mediante iniezione intraperitoneale^12,13. La perdita di risposta al pizzicamento della zampa posteriore indica una corretta anestesia. Non iniziare la perfusione prima che il topo sia stato adeguatamente anestetizzato.
2. Usa quattro perni per fissare gli arti sulla tavola di polyfoam. Posizionare l'addome del topo anestetizzato verso l'alto, con gli arti adeguatamente distesi. Usa un paio di forbici per l'iride per praticare un'incisione nel processo xifoideo. Quindi il diaframma sarà esposto.
3. Utilizzare le forbici chirurgiche per praticare un'incisione sul diaframma e continuare con cautela l'incisione del diaframma fino al limite superiore della gabbia toracica. Tagliare le costole e i muscoli toracici, sezionare i tessuti attaccati per esporre il cuore.
4. Trova l'atrio destro del mouse. Taglia l'atrio destro usando le forbici per iris.
5. Iniettare 20 ml di PBS a 37 °C (0,01 M, pH 7,2-7,4) dal ventricolo sinistro del cuore per eliminare il sangue. Quindi iniettare lentamente 20 ml di PFA al 4% a temperatura ambiente dal ventricolo sinistro per fissare i tessuti. La velocità di iniezione di PBS e PFA al 4% è di circa 5 ml/min. I tremori di fissazione dovrebbero essere osservati in pochi secondi.
   ATTENZIONE: Il 4% di PFA può irritare gli occhi e le vie respiratorie e può provocare reazioni allergiche. Questo passaggio deve essere eseguito in luoghi ventilati e l'operatore deve indossare occhiali di sicurezza e maschere facciali.
6. Usa le forbici chirurgiche per tagliare la testa e rimuovi con cura il cranio, usa una pinza da dissezione ed estrai il cervello. Quindi immergere il cervello in 4 mL di PFA al 4% in una provetta di plastica da 5 mL per 12-24 ore a 4 °C.

2. Inclusione e criosezione

1. Dopo la fissazione in PFA al 4%, trasferire il cervello in 4 mL di saccarosio al 15% in una provetta di plastica da 5 mL a 4 °C. Dopo 12-24 ore, il cervello dovrebbe sprofondare sul fondo.
2. Trasferire il cervello in 4 mL di saccarosio al 30% in una provetta di plastica da 5 mL a 4 °C per 12-24 ore. Quindi il cervello è pronto per l'incorporamento. Lo scopo dell'ammollo graduale del saccarosio al 15% e al 30% è quello di disidratare il cervello, evitando la formazione di cristalli di ghiaccio all'interno delle cellule durante l'inclusione e la criosezione. Il cervello disidratato può essere conservato a 4°C per una settimana.
3. Lasciare circa 1 ml di saccarosio con il cervello nella provetta. Quindi aggiungere il composto della stessa temperatura di taglio ottimale (OCT) nel tubo e mescolare correttamente. Questo aiuta il composto OCT ad avvolgere il cervello in modo più sufficiente.
4. Montare uno spesso strato di composto OCT sulla superficie della manopola e congelare a -21 °C prima della criosezione. Tagliare il cervello agittalmente dal centro; Utilizzare una delle due metà per il sezionamento in un criostato.
5. Dopo che il composto OCT si è solidificato, montare la manopola sulla testa del campione e tagliarla su una superficie della piattaforma. Appoggia una metà del cervello sulla superficie tagliata con il lato centrale rivolto verso il basso.
6. Metti un anello di carta stagnola attorno al cervello per evitare perdite di composto OCT, quindi riempi l'anello con il composto OCT fino a quando il cervello non è sommerso. Quando l'incorporamento del composto OCT si solidifica, è pronto per il sezionamento.
7. Impostare lo spessore della sezione a 20 μm. Impostare la temperatura della camera a -21 °C e la temperatura della testa del campione a -19 °C. Sezionare il cervello dall'estremità rostrale all'estremità caudale.
8. Spennellare un po' di PBS sui vetrini. Pre-rivestire i vetrini con polilisina per evitare che le sezioni si stacchino. Attacca la sezione al vetrino. Se la sezione è piegata, utilizzare una spazzola morbida per aprire le sezioni con PBS.
9. Asciugare le sezioni per una notte a temperatura ambiente e conservare a -20 °C. Le sezioni possono essere mantenute a -20 °C fino a un mese prima della colorazione Aβ.

3. Procedura di colorazione Aβ

1. Riscaldare le sezioni a temperatura ambiente, asciugare la superficie del vetrino e utilizzare una penna idrofobica per disegnare un cerchio attorno alla sezione per l'incubazione degli anticorpi.
2. Immergere il vetrino in PBS in una scatola di plastica da 30 ml per lavare via il composto OCT. Utilizzare almeno 20 ml di PBS.
3. Aggiungere 100 μl di soluzione di recupero dell'antigene 1x per sezioni congelate sul vetrino. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
4. Lavare la soluzione di recupero con almeno 20 ml di PBS a temperatura ambiente per 3 volte (5 minuti per ciascuna).
5. Aggiungere l'anticorpo primario diluito (6E10) sulle sezioni e incubare a 4 °C per 16-24 ore in una scatola umida e scura (soluzione di diluizione dell'anticorpo primario: 1% BSA, 0,3% Triton X-100, 0,01% sodio azide in PBS, diluizione 1:500). BSA funziona come agente bloccante.
6. Lavare le sezioni con PBS per 3 volte, 5 minuti ogni volta.
   NOTA: Eseguire i passaggi 3.7, 3.8 e 3.9 in un luogo buio.
7. Incubare le sezioni in una soluzione di anticorpi secondari (Goat anti-Mouse IgG (H+L) Alexa Flour 594, diluita con PBS 1:200) per 1 ora a temperatura ambiente in una scatola umida e buia.
8. Lavare via l'anticorpo secondario dalle sezioni con almeno 20 ml di PBS per 3 volte, 5 minuti ogni volta.
   NOTA: Non versare il PBS sulle sezioni durante il lavaggio per evitare che le sezioni si stacchino. Mantieni le sezioni bagnate.
9. Assorbire il liquido intorno alle sezioni e aggiungere una goccia di mezzo di montaggio su ciascuna sezione. Sigillare le sezioni con il vetro di copertura, evitando la formazione di bolle.
10. Osservare le sezioni colorate con un microscopio a fluorescenza. Mantenere coerenti i parametri di imaging per evitare derivazioni. Conservare i vetrini a 4°C in un luogo buio. Analizza le sezioni entro una settimana, poiché la colorazione svanirà con il tempo.

4. Imaging e quantificazione dell'accumulo di Aβ mediante ImageJ

1. Acquisisci immagini con un microscopio a fluorescenza collegato a una fotocamera digitale e a un software di imaging. Abbiamo utilizzato il software Image Pro Plus e il parametro di imaging è stato impostato come segue: Exp Pvw: 450 ms, Exp Acq: 450 ms; Pvw: 1 × 1, Acq: 1 × 1; Risoluzione Pvw: Larghezza 1 × Altezza 1, Risoluzione Acq: Larghezza 1 × Altezza 1; Profondità di acquisizione: mono a 8 bit; Guadagno: Pvw: 13, Acq: 13, Gamma: Pvw: 1, Acq: 1, Offse: Pvw: -700, Acq: -700.
2. In ImageJ Fiji 2.0.0 (https://imagej.net/Fiji), selezionare Plug-in | Cucitura | MosaicJ nel menu. Quindi seleziona File | Apri Sequenza immagini per aprire le immagini da unire (Figura 1A).
3. Tutte le immagini selezionate verranno visualizzate in basso. Dopo aver unito le immagini manualmente, selezionare File | Crea mosaico (Figura 1B, C, D).
4. Seleziona immagine | Regola | Luminosità/Contrasto ..., e regolare la luminosità e il contrasto dell'immagine (Figura 3A). Quindi l'immagine può essere salvata (Figura 1E).
5. Per quantificare l'accumulo di Aβ, aprire l'immagine tramite File | Aperto... nel menu (Figura 2A).
6. Seleziona immagine | Tipologia | 8 bit per regolare l'immagine a 8 bit. Quindi scegliere l'area da contare utilizzando la selezione poligonale (Figura 2B).
7. Seleziona immagine | Regola | Soglia per selezionare la soglia corretta dei segnali. La soglia può essere regolata trascinando le barre di scorrimento o modificando i numeri direttamente nella casella di testo (massimo: 255, minimo: 0). Quando tutti i segnali Aβ nella sezione sono diventati rossi, la soglia è appropriata per la misurazione (Figura 2C). Assicurati che la casella Sfondo scuro sia selezionata.
8. Selezione di Analizza | Imposta misura... nel menu per scegliere i parametri che verranno mostrati nei risultati. Verificare che l'opzione Densità integrata e limite alla soglia sia selezionata. La densità integrata (intensità totale) è l'obiettivo della misurazione (Figura 2D).
9. Seleziona Analizza | Misura per ottenere i risultati. I risultati saranno visualizzati e pronti per l'analisi statistica (Figura 2E).

Risultati

Abbiamo utilizzato le procedure di colorazione immunofluorescente sopra descritte per studiare la deposizione di accumulo di Aβ in topi 5×FAD di età diversa. La Figura 3 rappresenta i risultati tipici e i risultati non ottimali utilizzando il nostro protocollo. Fette di cervello di topi transgenici eterozigoti 5×FAD di 5 e 8 mesi e di controllo wild-type da 4 a 6 mesi sono state colorate con anticorpi 6E10 e rilevate al microscopio a fluorescenza.

Discussione

La colorazione immunofluorescente con anticorpi 6E10 può rilevare in modo specifico l'accumulo di Aβ nel cervello, che è facile da quantificare con l'immagine J. Ciò che vale la pena notare è che alcuni passaggi cruciali di questo protocollo possono influenzare i risultati.

Per evitare che le fette si stacchino o si rompano mostrate nella Figura 3C, è necessario notare alcuni punti chiave. La perfusione dovrebbe procedere ra...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetia
Injection syringe	KLMEDICAL		1 mL
Pentobarbitual sodium	Sigma-Aldrich	P3761	1% in saline for i.p. injection
Thoracotomy:
IRIS-Fine Straight iris scissors (~11.5 cm)	RWD	S12010-11
Sharp curved surgical scissors(11.5 cm)	RWD	S14016-11
Straight dissecting forceps (~10.5 cm)	RWD	F12010-10
Perfusion
Centrifugal tube (5 mL)	Biosharp
Injection syringe	KLMEDICAL		20 mL
Paraformaldehyde	Vicmed	VIH100
PBS 0.01M (PH7.2-7.4) powder	Vicmed	VC2001P	Add deionized water to make solution
Fixation, Dehydration and Cryosectioning
Adhesion microscope slides	CITOTEST	188105	76.2 mm × 25.4 mm
Microtome Cryostat	LEICA	CM1950
Optimal cutting temperature compound (OCT)	Sakura Finetek	4583
Sucrose	VETEC	V900116
Immunofluorescence staining
Fluorescence microscope	OLYMPUS	IX-81
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	A-11005	200X
Image-Pro Plus 7.0C	Media Cybernetics		Scientific graphing and data analysis software
Immunohistochemical Wet Box (black)	Sinylab	Customized	300 mm × 100 mm × 38 mm, groove depth 27 mm, can contain 10 standard slides
Pipet	Thermo Scientific
Pipette tips	Well-offer
Plastic staining box	Sinylab	Customized	30 mL, can contain 5 standard slides
Primary Antibody Dilution Buffer	made in our lab		1% BSA 1g, 0.3% Triton X-100 300ul, 0.01% sodium azide 10mg in 100ml PBS
Purified anti beta amyloid,1-16 antibody (6E10)	Biolegend	SIG-39320	500X
Quick Antigen Retrieval Solution for Frozen Sections	KeyGEN BioTECH	KGIHC005	5X
Quantification
Graphpad Prism 8.0.1	Graphpad		Medical mapping software
Image J Fiji 2.0.0	National Institute of Health		Scientific graphing and data analysis software