رصد متعدد النظم لتحديد المضبوطات وعدم انتظام ضربات القلب وانقطاع النفس في الأرانب المقيدة الواعية

Summary

باستخدام الفيديو المتزامن-تخطيط كهربية الدماغ-ECG-قياس الأكسدة-capnography، وضعنا منهجية لتقييم قابلية نماذج الأرانب لتطوير عدم انتظام ضربات القلب والنوبات التي أثارت. هذا النظام تسجيل الرواية يؤسس منصة لاختبار فعالية وسلامة العلاجات ويمكن التقاط سلسلة معقدة من الأحداث متعددة النظام التي تبلغ ذروتها في الموت المفاجئ.

Abstract

المرضى الذين يعانون من اعتلال القناة الأيونية معرضون لخطر كبير للإصابة بالنوبات وعدم انتظام ضربات القلب القاتل. هناك انتشار أعلى لأمراض القلب وعدم انتظام ضربات القلب لدى الأشخاص المصابين بالصرع (أي القلب الصرعي). بالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ عن اضطرابات قلبية ولاإرادية حول النوبات. 1:1,000 مريض صرع/سنة يموتون من الموت المفاجئ غير المتوقع في الصرع (SUDEP). ولا تزال آليات البرنامج غير مفهومة فهما كاملا. تخطيط كهربية الدماغ (EEG) وتخطيط القلب (ECG) هما تقنيتان تستخدمان بشكل روتيني في الإعداد السريري للكشف عن الركائز / المشغلات للنوبات وعدم انتظام ضربات القلب ودراسةها. في حين أن العديد من الدراسات والأوصاف لهذه المنهجية موجودة في القوارض ، فإن نشاطها الكهربائي القلبي يختلف بشكل كبير عن البشر. تقدم هذه المقالة وصفا لطريقة غير الغازية لتسجيل الفيديو المتزامن-تخطيط كهربية الدماغ-ECG-oximetry-capnography في الأرانب واعية. كما وظيفة القلب الكهربائية مماثلة في الأرانب والبشر، والأرانب توفر نموذجا ممتازا للدراسات التشخيصية والعلاجية الترجمة. بالإضافة إلى تحديد منهجية الحصول على البيانات ، نناقش النهج التحليلية لفحص الوظيفة الكهربائية العصبية القلبية وعلم الأمراض في الأرانب. ويشمل ذلك الكشف عن عدم انتظام ضربات القلب، والتحليل الطيفي ل تخطيط كهربية الدماغ، ومقياس المضبوطات الذي تم تطويره للأرانب المقيدة.

Introduction

يستخدم تخطيط القلب الكهربائي (ECG) بشكل روتيني في الإعداد السريري لتقييم ديناميكيات التوصيل الكهربائي القلبي وعملية التنشيط والاستعادة الكهربائية. تخطيط القلب مهم للكشف عن, توطين, وتقييم مخاطر عدم انتظام ضربات القلب, نقص التروية, والاحتشاءات. عادة، يتم لصق الأقطاب الكهربائية على صدر المريض وذراعيه وساقيه من أجل توفير رؤية ثلاثية الأبعاد للقلب. يتم إنتاج انحراف إيجابي عندما يكون اتجاه إزالة الاستقطاب عضلة القلب نحو القطب الكهربائي ويتم إنتاج انحراف سلبي عندما يكون اتجاه إزالة الاستقطاب عضلة القلب بعيدا عن القطب الكهربائي. وتشمل المكونات الكهرومغرافية للدورة القلبية إزالة الاستقطاب الأذيني (موجة P)، ومصل البطين الأذيني (الفاصل الزمني P-R)، والإثارة البطينية (مجمع الاستجابة السريعة)، وإعادة الاستقطاب البطيني (موجة T). هناك أوجه تشابه كبيرة في تخطيط القلب والتدابير المحتملة للعمل عبر العديد من الثدييات بما في ذلك البشر والأرانب وال وخنازير غينيا والخنازير والماعز والخيول^1و2و3.

الأرانب هي نموذج مثالي للبحوث القلبية. قلب الأرنب يشبه قلب الإنسان من حيث تكوين القناة الأيونية ، والعمل المحتمل خصائص^2،4،5. وقد استخدمت الأرانب لتوليد الوراثية, المكتسبة, والنماذج الناجمة عن المخدرات من أمراض القلب^2,4,6,7,8. هناك أوجه تشابه كبيرة في تخطيط القلب والاستجابة المحتملة للعمل على المخدرات في البشر والأرانب^7،10،11.

معدل ضربات القلب والقلب الكهربائية تنشيط عملية الانتعاش يختلف كثيرا في القوارض، بالمقارنة مع الأرانب والبشر، وغيرها من الثدييات أكبر^12،13،14. قلب القوارض ينبض ب 10 أضعاف سرعة البشر في المقابل، إلى قطاع ST ISO الكهربائية في ECGs الإنسان والأرنب، لا يوجد أي جزء ST في القوارض^14،15،16. أيضا ، القوارض لديها شكل موجي QRS-r مع موجة T^{مقلوبة 14،15،16}. قياسات الفاصل الزمني QT مختلفة جدا في القوارض مقابل البشر والأرانب^14،15،16. وعلاوة على ذلك، قيم تخطيط القلب العادية هي مختلفة جدا في البشر مقابل القوارض^12،15،16. ويمكن أن تعزى هذه الاختلافات في الأشكال الموجية تخطيط القلب إلى الاختلافات في العمل المورفولوجيا المحتملة والقنوات الأيونية التي تدفع إعادة الاستقطاب القلبي^9،14. في حين أن تيار البوتاسيوم الخارجي العابر هو التيار الرئيسي لإعادة الاستقطاب في التحولات القلبية القصيرة (غير القبة) المحتملة للعمل القلبي في القوارض ، في البشر والأرانب هناك قبة كبيرة للمرحلة 2 على إمكانات العمل ، وتيارات البوتاسيوم التصحيحية المتأخرة (I_Kr و I_KS)هي التيارات الرئيسية لإعادة الاستقطاب في البشر والأرانب⁴و⁹و^13و17. الأهم من ذلك ، فإن التعبير عن أنا_Kr و I_KS غائب / الحد الأدنى في القوارض ، وبسبب الحركية التنشيط الزمنية ل I_Kr و I_KS ، فإنه ليس له دور في التحولات المحتملة للعمل القلبي^9،13. وهكذا، توفر الأرانب نموذجا أكثر ترجمة لتقييم آليات المخدرات الناجمة عن، المكتسبة، ووراثة تشوهات تخطيط القلب وعدم انتظام ضربات القلب^4،7،13. بعد ذلك ، كما أظهرت العديد من الدراسات وجود كل من التشوهات العصبية والقلبية الكهربائية في القلب الأولي (متلازمة QT^{الطويلة 18،19،20)}أو أمراض الخلايا العصبية (الصرع^{21،22،23،24)}، من المهم دراسة الآليات الأساسية في نموذج حيواني يستنسخ علم وظائف الأعضاء البشري عن كثب. في حين أن القوارض قد تكون كافية لنمذجة الدماغ البشري ، والقوارض ليست نموذجا مثاليا لعلم وظائف الأعضاء القلب البشري⁷.

يستخدم تخطيط كهربية الدماغ (EEG) أقطاب كهربائية، توضع عادة على فروة الرأس أو داخل الجمجمة، لتسجيل الوظيفة الكهربائية القشرية. يمكن لهذه الأقطاب الكشف عن التغيرات في معدل إطلاق النار والتزامن من مجموعات من الخلايا العصبية الهرمية القريبة في قشرة الدماغ²⁵. يمكن استخدام هذه المعلومات لتقييم الوظيفة الدماغية وحالة الاستيقاظ / النوم. كما أن ال EEGs مفيدة لترجمة نشاط الصرع، والتمييز بين نوبات الصرع والأحداث غير الصرعية (على سبيل المثال، النشاط النفسي غير الصرعي والأحداث القلبية المنشأ). من أجل تشخيص نوع الصرع ، وعوامل استفزاز ، وأصل النوبة ، يتعرض مرضى الصرع لمناورات مختلفة قد تؤدي إلى نوبة. وتشمل الطرق المختلفة فرط التهوية، والتحفيز الفوتي، والحرمان من النوم. يوضح هذا البروتوكول استخدام التحفيز الفوتي للحث على انحرافات ومضبوطات تخطيط كهربية الدماغ في الأرانب^{26و27و28و29}.

وقد استخدمت تسجيلات الفيديو في وقت واحد تخطيط كهربية الدماغ-ECG على نطاق واسع في البشر والقوارض لتقييم النشاط السلوكي والخلايا العصبية والقلب خلال الدول ما قبل ictal، ictal، وما بعد ictal³⁰. في حين أن العديد من الدراسات قد أجريت EEG وتسجيلات تخطيط القلب بشكل منفصل في الأرانب^{4،31،32،33}، نظام للحصول على وتحليل الفيديو في وقت واحد - تخطيط كهربية الدماغ - ECG في الأرنب ضبط النفس واعية ليست راسخة³⁴. تصف هذه الورقة تصميم وتنفيذ بروتوكول يمكنه تسجيل بيانات قياس الأكسدة في الفيديو -EEG-ECG المتزامنة في الأرانب الواعية من أجل تقييم الوظيفة الكهربائية والجهاز التنفسي العصبية القلبية. يمكن أن تشير النتائج التي تم جمعها من هذه الطريقة إلى الحساسية والمحفزات والديناميكيات والتوافق بين عدم انتظام ضربات القلب والنوبات واضطرابات الجهاز التنفسي والمظاهر المادية. ميزة نظامنا التجريبي هو أن نحصل على تسجيلات واعية دون الحاجة إلى مهدئ. الأرانب تبقى في المقيدين لمدة ≥5 ساعة، مع الحد الأدنى من الحركة. كما التخدير اضطراب الخلايا العصبية, القلب, الجهاز التنفسي, ووظيفة اللاإرادي, التسجيلات خلال الدولة واعية توفر البيانات الأكثر الفسيولوجية.

قد يوفر نظام التسجيل هذا في نهاية المطاف رؤى مفصلة لتعزيز فهم الآليات العصبية والقلبية والتنفسية للوفاة المفاجئة غير المتوقعة في الصرع (SUDEP). بالإضافة إلى الرصد العصبي والقلبي أعلاه، دعمت الأدلة الحديثة أيضا دور فشل الجهاز التنفسي كمساهمة محتملة في الوفاة المفاجئة بعد^{النوبة 35،36.} ولرصد الحالة التنفسية للأرانب، تم تنفيذ قياس الأكسدة والكابنوغرافيا لتقييم حالة الجهاز التنفسي قبل النوبة وأثناءها وبعدها. تم تصميم البروتوكول المعروض هنا بهدف تقييم عتبة المضبوطات الناجمة عن الأرانب الدوائية والفوتيتيكية. يمكن لهذا البروتوكول الكشف عن تشوهات تخطيط كهربية الدماغ و ECG الدقيقة التي قد لا تؤدي إلى مظاهر مادية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه الطريقة لسلامة القلب واختبار فعالية مضادة لللامنهجية من الأدوية والأجهزة الجديدة.

Protocol

وقد أجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة واللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها التابعة للجامعة الطبية في شمال الولاية. وبالإضافة إلى ذلك، يتم توفير مخطط تفصيلي لهذا البروتوكول في الشكل 1.

1. إعداد معدات التسجيل

1. قم بتوصيل الكمبيوتر بمكبر للصوت مع صندوق رأس 64 دبوس.
   ملاحظة: كل لديه أربعة أقطاب دبوس فروة الرأس تحت الجلد على التوالي (7 أو 13 ملم) لEEGs من 4 أرباع الرأس، 3 عازمة أقطاب دبوس الصدر تحت الجلد (13 ملم، 35درجة زاوية) لECG (مثلث اينتهوفن' ق)، 1 عازمة تحت الجلد دبوس القطب الأرض على الساق اليمنى، و 1 مستقيم القطب دبوس فروة الرأس تحت الجلد على وسط الرأس بمثابة المرجع.
2. لجعل كل دبوس^{8 على} صندوق الرأس مرجعا، تحديث إعدادات البرمجيات اقتناء، علامة التبويب الاستحواذ، لذلك القطب المرجعي هو "مستقل"(أي، وضع البحث).
   ملاحظة: يتيح ذلك التسجيلات من 7 في وقت واحد، كل منها يحتوي على 7 أقطاب كهربائية بالإضافة إلى قطب مرجعي مخصص وقطب كهربائي أرضي، كل ذلك من خلال مكبر صوت واحد وجهاز رقمي وجهاز كمبيوتر. يتم الحصول على جميع الأقطاب الكهربائية كقنوات أحادية القطب ومقارنتها بالمرجع (مركز الرأس).) يمكن إعداد تكوينات/مونتاجات إضافية ذات ثنائي القطب ومعززة للرصاص أثناء التسجيل أو بعده. كما الإعداد لديه القدرة على تسجيل من الحيوانات متعددة في وقت واحد، يتم توصيل قطب أرضي من كل بالتوازي مع مدخلات الأرض على مكبر للصوت(الشكل 2).
3. إزالة الأرانب من قفصهم ووزنها لحساب جرعة الدواء المناسبة لكل. ضع الأرانب في ناقل نقل وأحضرها إلى غرفة منفصلة من أجل تقليل الإجهاد إلى الحيوانات غير التجريبية. في هذه الدراسة، تم استخدام الأرانب البيضاء النيوزيلندية الذكور والإناث، وذريتهم اللاحقة. وأجريت تجارب على الأرانب > شهر واحد من العمر. في وقت التجربة، كان وزن هذه الأرانب يتراوح بين 0.47 - 5.00 كجم.
   ملاحظة: منذ الأرانب تحتاج إلى أن تكون في نفس الغرفة وفي ضوء الكاميرا، لا عزل تماما الأرانب. هناك إمكانية للمظاهر البصرية والسمعية من أرنب واحد مؤكدا أرنب آخر. لذلك ، من المثالي وجود أرنب واحد في الغرفة في وقت واحد ، وهو ما يتم لتجارب التحفيز الصوتي. لجميع التجارب الأخرى ، يتم متباعدة الأرانب إلى أقصى حد ممكن ، مع الاحتفاظ بها جميعا في عرض كاميرا الفيديو. من الناحية المثالية ، يتم استخدام الحواجز أو دراسة واحد فقط في وقت واحد. لم يكن هذا confounder الرئيسية كما ظلت معدلات ضربات القلب الأرانبمستقرة إلى حد ما خلال التجارب وكان هناك وجود متكرر من المغزل النوم. التسجيلات من متعددة في وقت واحد يؤكد أن يتم الحصول على كل من السيطرة واختبار البيانات الحيوانية في ظل نفس الظروف البيئية.

2. زرع أقطاب تخطيط كهربية الدماغ -ECG وربط أجهزة عرض الجهاز التنفسي

1. إزالة أرنب واحد من الناقل النقل ومكان في حضن محقق يجلس.
2. أمسك الأرنب عموديا وأبقه قريبا منجثةالمحقق
3. خفض الأرنب في موقف supine ، مع رأس الأرنب'فيالركبتين المحقق،ورأس الأرنب'أقلمن بقية جسمه.
   ملاحظة: هذه المناورة يرتاح الحيوان ويقلل من احتمال أنه يحاول التحرك أو الهروب أثناء وضع الأقطاب الكهربائية.
4. الآن بعد أن تم تأمين الأرنب في وضع ية ، اطلب من محقق ثان نشر الفراء حتى يمكن التعرف على الجلد وعزله عن الأنسجة الأساسية.
5. إدراج 35° عازمة الأقطاب subdermally في كل أكسيلا (الشكل 3A).
   ملاحظة: يجب دفع الأقطاب الكهربائية من خلال بحيث يتم التوصيل بشكل آمن في الجلد، ولكن لا تخترق هياكل أعمق. وجود القطب دخول ثم الخروج من الجلد (من خلال وعبر) يقلل من فرصة يؤدي تصبح طرد عند وضع الأرنب في المقيد أو إذا كان يتحرك أثناء التجربة(الشكل 3B). يتم تعقيم جميع الأقطاب الكهربائية بالإيثانول بنسبة 70٪ قبل وضعها.
6. يؤدي المكان على الصدر الخلفي إلى الأطراف الأمامية اليمنى واليسرى وعلى الجزء الأمامي من البطن إلى الطرف الخلفي الأيسر. ضع دبوس الأرض القطب الأمامي إلى الطرف الخلفي الأيمن على البطن (الشكل 4A).
7. مرة واحدة يتم وضع جميع يؤدي تخطيط القلب بشكل صحيح، والعودة الأرنب إلى موقف عرضة، مع يؤدي تشغيل ما يصل جانب واحد من بطن الأرنب، ونقل الأرنب إلى كبح جماح الحجم المناسب (على سبيل المثال، 6 "× 18" × 6").  عند وضع الأرنب في المقيد، سحب السلك فضفاضة صعودا لتقليل الأرنب من سحب الأقطاب الكهربائية مع ساقيه. الشريط الأسلاك إلى جانب من التقييد بحيث لا تحصل اشتعلت تحت الأرنب أثناء التجربة (الشكل 4B).
8. تأمين الأرنب في المقيد عن طريق خفض ضبط النفس حول الرقبة وقفل عليه في مكانه. بالإضافة إلى ذلك، تحريك الأطراف الخلفية إلى أعلى تحت الحيوان وتأمين ضبط النفس الخلفي.
   ملاحظة: ينبغي للمرء أن يكون قادرا على احتواء 1-2 أصابع داخل الفضاء تحت الرقبة لضمان أنها ليست ضيقة جدا. خاصة خلال التجارب التي قد تكون هناك حركة الحركة الحركية، من المهم تشديد ضبط النفس لتقليل الحركة، وإصابات العمود الفقري المحتملة، وخلع الأطراف، والقدرة على طرد ضبط النفس الخلفي(الشكل 4B). وقد تم الحفاظ على الأرانب في المقيد ل ~ 5 ساعة دون أي قضايا تتعلق بزيادة الحركة أو علامات الجفاف.
   1. للأرانب الصغيرة (على سبيل المثال، أقل من 2 أشهر) وضع وسادة معززة المطاط تحت الحيوان لرفع الأرنب، مما يمنع الأرنب من يستريح رقبته على الجزء السفلي من ضبط النفس الرأس(الشكل 4C).
      ملاحظة: قد يكون الانخفاض المفاجئ في الجهاز التنفسي ومعدل ضربات القلب ثانويا لقصور الرقبة. إذا حدث هذا، وتخفيف تقييد الرقبة ورفع رأس الأرنبلتخفيفأي ضغط الرقبة.
   2. عندما لا تتبع ضبط النفس الخلفي عن كثب ظهر / العمود الفقري من الأرنب، ضع فاصل PVC لمنع أي حركة يمكن أن تسبب إصابات العمود الفقري.
      ملاحظة: على سبيل المثال، يمكن وضع ~ 14 سم طويلة × 4 "أنبوب PVC القطر الداخلي، مع أقل 25-33٪ إزالتها فوق الأرنب مع رغوة لتوفير ضبط النفس المناسبة (الشكل 4C).
9. الآن أن يتم وضع الأرنب بشكل آمن في المقيد، إدراج 7-13 مم تحت الجلد مباشرة دبوس الأقطاب الكهربائية في فروة الرأس(الشكل 3A). باستخدام نهج زاوية 45درجة من الدخول ، تشغيل الأسلاك بين الأذنين ، وربط الأسلاك بشكل فضفاض إلى المقيد خلف الرأس للحفاظ على وضع الرصاص. ضع 5 EEG يؤدي في المواقف التالية: الأمامي الأيمن، الأمامي الأيسر، القذالي الأيمن، القذالي الأيسر والمرجع المركزي (Cz) يؤدي عند النقطة بين الآخرين 4 يؤدي(الشكل 4D).
   ملاحظة: يتم وضع الأقطاب الكهربائية بشكل صحيح عندما يتم وضعها في أنسجة تحت الجلد ضد الجمجمة. يقلل هذا الموضع من القطع الأثرية من الأنف والأذنين والعضلات المحيطة الأخرى. بعض القطع الأثرية من حركة الأنف الإيقاعي أمر لا مفر منه. وينبغي وضع يؤدي تخطيط كهربية الدماغ الأمامية وسيطة إلى عيون الأرنبونقطةالأمامية. يجب وضع خيوط القذالي الأمامية إلى الأذنين وسوف تشير في الاتجاه الوسيط. يتم وضع Cz في وسط الجزء العلوي من الرأس عند نقطة بين جميع الأقطاب الكهربائية 4 (في منتصف الطريق بين لامبدا وبريغما، على طول خط خياطة). دبوس القطب Cz نقاط الأمامية.
   1. تمرير الأسلاك تخطيط كهربية الدماغ بين الأذنين، لتجنب الأرنب في محاولة لدغة الأسلاك.
10. قم بتوصيل مقياس أكسدة النبض بأذن الأرنب فوق وريد الأذن الهامشي.
    ملاحظة: قد يكون من الضروري حلق الشعر الزائد من الأذن لتحسين الإشارة أو استخدام بعض الشاش للحفاظ على جهاز الاستشعار في مكانه.
    1. تأكد من أن معدل ضربات القلب على plethysmography يرتبط مع معدل ضربات القلب من تخطيط القلب وأن يتم عرض تشبع الأكسجين(الشكل 5C).
11. ضع قناع الوجه برفق مع أنابيب الكبناوغرافيا فوق فم الأرنب وأنفه(الشكل 4H). تأمين قناع الوجه مع سلسلة ملفوفة حول القناع وإرفاق طرفي السلسلة إلى المقيد. إرفاق الطرف الآخر من أنابيب capnography إلى مراقبة العلامات الحيوية.
    ملاحظة: من المهم منع السلسلة من وضع على عيون الأرنب أثناء التجربة. للقيام بذلك، الشريط السلسلة إلى منتصف المقيد بين آذان الأرنب. من أجل تحسين إشارة capnography، وخلق صمام في اتجاه واحد باستخدام الشريط وقطعة رقيقة من النتريل التي من شأنها أن تسمح للأوكسجين لدخول تي قطعة، وسوف توجه الزفير CO2 في أنابيب capnography (الشكل 4I).

3. تسجيل الفيديو-تخطيط كهربية الدماغ-ECG

1. قم بإجراء تسجيل فيديو تخطيط كهربية الدماغ ECG باستخدام برنامج تخطيط كهربية الدماغ المتاحة تجاريا.
   ملاحظة: يتم تأمين العملاء المتوقعين والفيديو الحيويين لربط الإشارات الكهربائية والفيديو لاحقا (على سبيل المثال ، ارتفاع تخطيط كهربية الدماغ مع رعشة ميوكليونيك).
2. تأكد من الاتصال الأمثل، مع عدم وجود انحراف خط الأساس، لا ضوضاء كهربائية 60 هرتز، وارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء. على وجه التحديد، تأكد من أن كل مرحلة من مراحل شكل الموجة القلبية يمكن تصورها على تخطيط القلب وأن الدلتا وال ثيتا وموجات ألفا لا تحجب بصريا بسبب الضوضاء عالية التردد على تخطيط كهربية الدماغ.
   1. إذا كانت جميع الأقطاب الكهربائية تنتج كميات مفرطة من الضوضاء ، فقم بضبط الرصاص المرجعي المركزي. إذا كان قطب كهربائي واحد فقط صاخبا بشكل مفرط ، فادفع هذا القطب إلى عمق الجلد أو قم بإعادة وضعه حتى لا يكون هناك معدن مكشوف.
3. ضبط الفيديو بحيث يمكن رؤية جميع الأرانب في وقت واحد، والذي يسمح للارتباط النشاط الحركي مع النتائج EEG (الشكل 5A).
   ملاحظة: يستوعب النظام تسجيلات تخطيط كهربية الدماغ/تخطيط كهربية القلب/قياس الأكسدة/الكبناوغرافيا المتزامنة من 7 أرانب.
4. بدء تسجيل خط الأساس من كل لمدة لا تقل عن 10-20 دقيقة أو حتى يستقر معدل ضربات القلب إلى حالة استرخاء هادئة (200-250 bpm) والأرانب لا تظهر حركات كبيرة لمدة 5 دقائق على الأقل. الحصول على بيانات كهربائية كاملة النطاق الترددي دون أي مرشحات. من أجل تصور أفضل للبيانات تعيين مرشح التردد المنخفض (= مرشح تمرير عالية) في 1 هرتز ومرشح التردد العالي (= مرشح تمرير منخفض) في 59 هرتز.
   ملاحظة: علامة أخرى على أن الأرنب هو استرخاء هو بداية مغزل النوم تخطيط كهربية الدماغ (نوقشت في وقت لاحق).
5. أضف ملاحظات مقفلة زمنيا أثناء التجربة في الوقت الفعلي للإشارة إلى توقيت التدخلات (على سبيل المثال، تسليم الأدوية) والأحداث العصبية القلبية (على سبيل المثال، ارتفاع تخطيط كهربية الدماغ، والنوبات الحركية، والنبض خارج الرحم، وعدم انتظام ضربات القلب)، والتحف الحركية/المحققة.
   ملاحظة: نظرا للتواتر الذي يحتاج إليه المحقق لتطبيق تدخل (مثل التحفيز الصوتي، تسليم المخدرات)، لتقليل إجهاد المحقق الذي يدخل الغرفة ويخرج منها ويفتح الباب/ يغلقه، يبقى المحقق على الجانب الآخر من الغرفة طوال التجربة. المحقق يجلس بعيدا عن الحيوان ممكن، ويبقى لا يزال وهادئا للحد من احتمال إزعاج الحيوانات.

4. بروتوكولات تجريبية

ملاحظة: يتم تنفيذ كل من التجارب التالية في أيام منفصلة إذا تم تنفيذها على نفس animal. هناك تأخير لمدة أسبوعين بين الاختبارات الفموية مجمع دراسات المخدرات، ودراسة المخدرات الحادة الطرفية الموالية للتشنج. عند الضرورة ، يتم إجراء تجربة التحفيز الصوتي ، تليها 30 دقيقة انتظار ، ثم دراسة المخدرات PTZ.

1. لتمكين الأرانب من التأقلم في القيود وللمحققين لتأكيد موضوعي استقرار معدلات القلب والجهاز التنفسي، الصك جميع الأرانب مع أجهزة الاستشعار القلبية التنفسية والخلايا العصبية وإجراء رصد الفيديو المستمر لمدة > 1 ساعة، 1-3 مرات لكل.
2. تجربة التحفيز الفوتي
   1. بالإضافة إلى الطريقة المذكورة أعلاه، ضع مصدر ضوء مع عاكس دائري 30 سم أمام الأرنب على مستوى العين، مع ضبط كثافة الفلاش إلى الحد الأقصى (16 كانديلا)²⁹. يشير مصدر الضوء إلى نقطة بيضاء في الشكل 4E.
      ملاحظة: يجب استخدام غرفة مضاءة بشكل خافت للحصول على استجابة حساسة للضوء³⁷.
   2. كما عيون الأرنب'هيعلى جانب الرأس بدلا من الجزء الأمامي من رأسه (كما هو الحال في البشر)، ووضع 2 المرايا على جانبي الأرنب، و 1 وراء الأرنب بحيث يدخل الضوء عيونالأرنب.
      ملاحظة: مرآة مسطحة التي ≥ 20 سم طويل القامة، من قبل ≥ 120 سم طويلة يخلق الضميمة الثلاثي حول الأرنب لضمان أن الضوء الساطع يدخل عيونالأرنب،كما رأينا في الشكل 4E.
   3. قم بتوصيل مصدر الضوء بوحدة تحكم لها معدل قابل للتعديل وشدته ومدته.
   4. تسجيل الفيديو باستخدام كاميرا مع الضوء الأحمر وقدرات تسجيل الأشعة تحت الحمراء.
   5. تعريض الأرانب لكل تردد لمدة 30 ق مع عيونهم مفتوحة ومن ثم آخر 30 ق مع قناع الجراحية التي تغطي وجوههم لمحاكاة أو تسبب إغلاق العين في كل تردد.
      ملاحظة: أظهرت الدراسات السابقة أن إغلاق العين هو المناورة الأكثر استفزازا للحصول على الحساسية للضوء للاستيلاء²⁹. بالإضافة إلى ذلك ، فإن 10٪ من المرضى الحساسين للضوء يظهرون فقط علامات كهربية الدماغ بينما عيونهم مغلقة^29. يمكن التعرف على النوبة سريريا من خلال مراقبة وجود الهزات العضلية الرأس والجسم كله ، أو الكلونوس ، أو حالة منشط. يتم تحليل تسجيل تخطيط كهربية الدماغ بشكل أكثر شمولا للارتباط الكهربائي الدماغي (على سبيل المثال ، المسامير ، المسامير المتعددة ، والتفريغ الإيقاعي) مع المظاهر الحركية للتشخيص النهائي لنشاط النوبة. وينبغي مراجعة الحركات التي يتم حجب تخطيط كهربية الدماغ من قبل قطعة أثرية العضلات أو موجات من الصرع غير محدد من قبل طبيب الصرع لتأكيد.
   6. زيادة تردد المحفز الصوتي من 1 هرتز إلى 25 هرتز بزيادات 2 هرتز. ثم تنفيذ نفس بروتوكول التحفيز الصورة، ولكن هذه المرة تقليل التردد من 60 هرتز إلى 25 هرتز في زيادات 5 هرتز.
      ملاحظة: إذا كان أرنب لديه نوبة، يجب إيقاف التجربة. استمر في مراقبة الأرنب لمدة 30 دقيقة. ثم العودة الأرنب إلى غرفة السكن ورصد كل 1 ساعة لمدة 3 ساعة للتعافي الكامل. ومع ذلك ، إذا كان التحفيز photic يحفز استجابة photoparoxysmal ، ثم يتم تخطي ما تبقى من الترددات التصاعدية ويتم بدء السلسلة مرة أخرى عن طريق النزول من 60 هرتز حتى يحدث استجابة أخرى photoparoxysmal. وهذا سيسمح لتحديد عتبات التحفيز الفوتي العلوي والسفلي. لا يلزم أي تأخير لأن الاستجابة photoparoxysmal ستتوقف بعد توقف التحفيز الفوتوني. إذا كان من غير الواضح ما إذا كان قد حدث استجابة photoparoxysmal، يتكرر التردد بعد تأخير 10 ق³⁸.
   7. بعد الانتهاء من التجربة، قم بإزالة تخطيط كهربية الدماغ وECG يؤدي من الأرنب وإعادته إلى قفص المنزل للحصول على الرعاية الروتينية من قبل موظفي تربية.
3. عن طريق الفم من الأدوية
   1. كما يتم أخذ العديد من الأدوية عن طريق الفم، وإعداد المركبات عن طريق الفم عن طريق الاختلاط مع صلصة التفاح الغذاء الصف. مزيج 0.3 ملغ / كغ من E-4031 في 3 مل من صلصة التفاح وتحميلها في حقنة 3 مل عن طريق الفم / الري دون إبرة.
      ملاحظة: يمكن إعطاء العديد من الأدوية بهذه الطريقة بما في ذلك مركبات الاختبار والأدوية المعروفة بتغيير مدة QT (moxifloxacin أو E-4031) ، والتحكم السلبي أو السيارة. بعض الأدوية غير متوفرة في تركيبة وريدية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم وصف العديد من الأدوية في تركيبة فموية ، وبالتالي قد يكون للإدارة الوريدية أهمية سريرية أقل.
   2. رفع الشفاه العليا والشريحة غيض من حقنة عن طريق الفم في جانب من فم الأرنب،والتي هي دون عائق من قبل الأرنب'الأسنان ، وحقن كل من الدواء وصلصة التفاح في فمالأرنب.
   3. مواصلة تسجيل الفيديو تخطيط كهربية الدماغ ل 2 ساعة ومن ثم العودة الحيوان إلى قفص منزله للرعاية الروتينية.
   4. في اليوم التجريبي 2 و 3، ربط الأرنب إلى الفيديو-تخطيط كهربية الدماغ-ECG، سجل 10-20 دقيقة من خط الأساس، ثم حقن نفس الدواء وسجل لمدة 2 ساعة.
   5. بعد أسبوع واحد من الاغتسال، قم بإجراء 10-20 دقيقة من خط الأساس، ثم أعطي كل أرنب جرعة واحدة من الدواء الوهمي لمدة 3 أيام متتالية وسجل لمدة 2 ساعة.
      ملاحظة: قد تصمم إدارة الأدوية الفموية كدراسة كروس، حيث يتم إعطاء الدواء الوهمي خلال الأسبوع 1 والدواء في الأسبوع 2.
4. تجربة الدواء عن طريق الوريد (بنتيلينتيترازول، PTZ)
   1. من أجل تصور الوريد الأذن هامشية، حلق السطح الخلفي للأذن الأرنب'ق. استخدم مسح الإيثانول بنسبة 70٪ لتطهير الموقع وتمدد وريد الأذن الهامشي. ويشار إلى ذلك من قبل البيضاوي متقطعة سوداء في الشكل 4F.
   2. عند هذه النقطة، يكون أحد المجرب تغطية وجه الأرنب'معأيديهم من أجل تقليل الإجهاد من الإجراء إلى الأرنب. مجرب الثاني cannulates بعناية الوريد الأذن هامشية مع العقيمة 25-G angiocatheter.
   3. بمجرد أن تكون القسطرة في الوريد، ضع قابس حقن معقم في نهاية القسطرة بحيث يمكن للإبرة إدخال الدواء عن طريق الوريد. يشار إلى موقع المكونات حقن من قبل دائرة زرقاء في الشكل 4G.
   4. جعل جبيرة عن طريق التفاف 4 × 4 بوصة شاش مع الشريط بحيث يشكل شكل أنبوب ووضعه داخل الأذن الأرنب'ق. ثم الشريط جبيرة إلى الأذن بحيث يتم تأمين القسطرة في مكان وتبقى تستقيم، على غرار الأذن غير القسطرة.
   5. حقن 1 مل من 10 وحدات USP لكل مل من المالحة الهيبارينية.
      ملاحظة: يجب تطهير القسطرة والأوعية بشكل واضح من الهواء وتبقى براءة اختراع. إذا لم تكن القسطرة في الوعاء ، فلن تدفع الحقنة بسهولة وسيكون هناك تراكم للمحلول الملحي في الأنسجة تحت الجلد.
   6. إعطاء الأرانب جرعات إضافية من PTZ عن طريق الوريد من 1 ملغم / كغ إلى 10 ملغ / كغ في 1 ملغ / كغ زيادات كل 10 دقيقة. دون ملاحظة في بداية كل جرعة للإشارة إلى الحيوان الذي يتم حقنه وتركيز الدواء.
      ملاحظة: يتيح هذا إجراء تقييمات للآثار الحادة والمضافة لإدارة PTZ. بدلا من ذلك، لمواصلة تقييم الآثار المزمنة للجرعة المنخفضة PTZ، يتم إعطاء الأرنب جرعات متكررة في كل تركيز جرعة منخفضة، 7 جرعات في 2 ملغ/كغ، 3 جرعات في 5 ملغ/كغ، ثم 3 جرعات في 10 ملغ/كغ، يتم فصل كل جرعة من قبل 10 دقيقة.
   7. بعد كل جرعة، مراقبة بعناية الفيديو-تخطيط كهربية الدماغ-ECG-capnography-oximetry لأي تشوهات كهربائية وتنفسية عصبية القلب والأدلة البصرية للنشاط الصرع. لاحظ هذه التغييرات في الوقت الحقيقي وأثناء التحليل اللاحق.
      ملاحظة: غالبا ما يبدأ نشاط الضبط في غضون 60 s من إدارة PTZ.

5.Conclusion التجارب غير البقاء على قيد الحياة.

1. إذا لم يتعرض الأرنب للموت المفاجئ أثناء تجربة PTZ ، فطبق 1 مل من 390 ملغم / مل من بنتوباربيتال الصوديوم لكل 4.54 كجم من وزن الجسم (أو 1.5 مل لجميع الأرانب) ، يليه تدفق 1 مل من المالحة العادية. مراقبة تخطيط القلب لضمان أن الأرنب يخضع لسكتة قلبية.
2. بمجرد أن يتعرض الأرنب لسكتة قلبية ، قم بسرعة بإجراء تشريح لعزل الأعضاء المختلفة حديثا ، بما في ذلك القلب والرئتين والكبد والدماغ والعضلات الهيكلية وأي أنسجة أخرى ضرورية للتحليلات الجزيئية / الكيميائية الحيوية اللاحقة.
3. التخلص من الأرنب وفقا للسياسات المؤسسية.

6. تحليل تخطيط القلب

1. استخدام برامج تحليل تخطيط القلب المتاحة تجاريا لفحص بصريا تخطيط القلب، وتحديد فترات عدم انتظام دقات القلب، بطء القلب، يدق خارج الرحم وغيرها من عدم انتظام ضربات القلب(الشكل 6). لتقليل كمية البيانات التي يجب مراجعتها، قم بإنشاء مخطط تاتشوجرام، مما سيزيد من سهولة تحديد فترات عدم انتظام دقات القلب أو بطء القلب أو مخالفات الفاصل الزمني ل RR.
   ملاحظة: يتم تحديد تشوهات تخطيط القلب (مثل إطالة QT_c) وعدم انتظام ضربات القلب يدويا من خلال مراجعة تخطيط القلب بحثا عن تشوهات في المعدل (على سبيل المثال، برادي/تاشي-عدم انتظام ضربات القلب)، والإيقاع (على سبيل المثال، المجمعات الأذينية/البطينية المبكرة)، التوصيل (على سبيل المثال، كتلة البطين الأذيني)، والموجة (على سبيل المثال، عدم انتظام دقات القلب الأذيني/البطيني غير الجيوب الأنفية والرجفان).) يمكن الكشف عن عدم انتظام ضربات القلب من خلال مراجعة التتشوجرام للمخالفات في الفاصل الزمني RR. يمكن تحديد عدم دقات القلب من خلال أقسام من التتشوجرام حيث يكون معدل ضربات القلب أعلى من 300 نبضة في الدقيقة. يتم تحديد بطء القلب عندما يكون معدل ضربات القلب أقل من 120 نبضة في الدقيقة على التاتشوجرام.
2. باستخدام برامج تحليل تخطيط القلب المتاحة تجاريا، قم بإجراء قياسات تخطيط القلب القياسية (معدل ضربات القلب، وفترات دورة القلب) عند خط الأساس وعند الاستفزاز (على سبيل المثال، المحقق التلاعب بالحيوان، وإدارة عوامل الاختبار، والتغيرات الناجمة عن المضبوطات تخطيط القلب).

7. تحليل الفيديو EEG

1. التمرير بصريا من خلال الفيديو وتتبع تخطيط كهربية الدماغ باستخدام البرامج المتاحة تجاريا لتحديد إشارة خط الأساس(الشكل 7)ووجود تصريفات تخطيط كهربية الدماغ المتوقعة مثل مغزل النوم(الشكل 8)وموجات الرأس(الشكل 9).
   ملاحظة: على الرغم من الحصول على بيانات إلكتروجرافيك عرض النطاق الترددي الكامل دون أي مرشحات، يجب عرض البيانات مع مرشح التردد المنخفض (أي مرشح تمرير عالية) تعيين في 1 هرتز، واستنادا إلى نظريةNyquist'، يتم تعيين مرشح التردد العالي (أي، مرشح تمرير منخفض) في 120 هرتز لتجنب فقدان أي إشارة. يمكن تعديل المرشحات للسماح بتحسين التصور وتقليل الضوضاء (على سبيل المثال، 1-59 هرتز) عند مراجعة نشاط تخطيط كهربية الدماغ منخفض التردد (<25 هرتز).
2. بالإضافة إلى الأشكال الموجية capnography، استخدم قطعة أثرية حركة الأنف على تخطيط كهربية الدماغ لتحديد وجود مقابل عدم وجود التنفس. ويمكن أيضا أن يرتبط هذا مع حركات الأنف ينظر على تسجيل الفيديو.
3. التمرير بصريا من خلال الفيديو وتتبع تخطيط كهربية الدماغ باستخدام البرامج المتاحة تجاريا للتمييز بين الصرع مقابل حركات غير الصرع (على سبيل المثال، واعية) لمدة 1 دقيقة على الأقل بعد كل جرعة من PTZ (الشكل 10). مسح للتخلص من الصرع بين الصرع وللتغيرات في تخطيط كهربية الدماغ قبل وأثناء وبعد النوبات. يمكن التعرف على النوبة سريريا من خلال مراقبة وجود الهزات العضلية الرأس والجسم كله ، أو الكلونوس ، أو حالة منشط مع ارتباط تخطيط كهربية الدماغ. قد تتضمن تغييرات تخطيط كهربية الدماغ مسامير تخطيط كهربية الدماغ، والمسامير المتعددة، والتصريفات الإيقاعية.
   ملاحظة: يجب مراجعة الحركات التي يحجب فيها تخطيط كهربية الدماغ بواسطة قطعة أثرية عضلية أو موجات من الصرع غير المحدد من قبل طبيب أعصاب للتأكيد. قد يكون من المفيد أن تركز الفيديو على أرنب واحد لعرض سلوكها، فضلا عن EEG وتسجيلات تخطيط القلب، عن كثب(الشكل 5B).
4. تسجيل الفيديو-تخطيط كهربية الدماغ للمضبوطات على أساس نوع وشدة المظاهر الحركية، والتي تحدث عادة في غضون 1 دقيقة بعد حقن PTZ (الجدول 1).
5. بعد تجربة التحفيز الصوتي، قم بتحليل الخيوط القذالية ل تخطيط كهربية الدماغ لوجود وغياب إيقاع القيادة القذالي من خلال إنشاء مؤامرة تحليل طيفية في برنامج تحليل تخطيط كهربية الدماغ المتاح تجاريا. فإن إيقاع القيادة القذالي خلق ذروة في التحليل الطيفي الذي يتوافق مع وتيرة المحفز photic(الشكل 11).
   ملاحظة: قد ينتج التحفيز الصوتي قمم تردد متناسقة بالإضافة إلى ذروة التردد الأساسي.

7. تحليل وظيفة الجهاز التنفسي

1. راجع المخرجات من جهاز مراقبة العلامات الحيوية(الشكل 4I)واصدر الإشارة لمزيد من التحليل.
2. لاحظ التغير في نمط الجهاز التنفسي أثناء النوبة وبعد النوبة، وخاصة النقطة الزمنية عندما يبدأ انقطاع النفس.

النتائج

الطريقة المذكورة أعلاه قادرة على الكشف عن تشوهات في نظام التوصيل الكهربائي للدماغ والقلب وكذلك اضطرابات الجهاز التنفسي. ويستخدم برنامج الحصول على البيانات لتقييم مورفولوجيا تخطيط القلب والكشف عن أي معدلات ضربات القلب غير طبيعية، واضطرابات التوصيل، أو إيقاعات تخطيط ال...

Discussion

يسهل هذا الإعداد التجريبي تسجيلات وتحليلات الفيديو المتزامنة المفصلة -EEG-ECG-oximetry-capnography في الأرانب ، خاصة في نماذج أمراض القلب و / أو الخلايا العصبية. تظهر نتائج هذه المقالة أن هذه الطريقة قادرة على اكتشاف النوبات وعدم انتظام ضربات القلب والتمييز بينها وبين القطع الأثرية الكهربائية. تم الح?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP - Flexible Container	PFIZER (HOSPIRA)	7983-09	Dilutant
10cc Luer Lock syringe with 20G x 1" Needle	Sur-Vet	SS-10L2025	Used as a flush after drug injection
4x4 gauze sponges	Fisher Scientific	22-415-469	Rolled in a tube to splint ear with angiocatheter
Apple Sauce	Kirkland	897971	Vehicle for oral medications
Computer	Dell	Optiplex 5040	Acquisition computer
E-4031	Tocris	1808	Agent known to prolong the QT interval
ECG Electrode	RhythmLink	RLSND116-2.5	13mm 35-degree bent (0.4 mm diameter) subdermal pin electrodes
EEG Electrode	RhythmLink	RLSP513	5-twist 13mm straight (0.4mm diameter) subdermal pin electrodes
EEGLAB (2020)	Swartz Center for Computational Neuroscience	Open Access	Can perform spectral analysis of EEG
Ethernet-to-ethernet adapter	Linksys	USB3G16	Adapter for connecting the camera to the computer
Euthanasia-III Solution	Med-Pharmex	ANADA 200-280	Contains pentobarbital sodium and phenytoin sodium, controlled substance
Foam padding	Generic	N/A	Reduces pressure applied to the neck of small rabbits by the restrainer in order to prevent the adverse cardiorespiratory effects of neck compression
Heparin Lock Flush	Medline	EMZ50051240	To maintain patency of angiocatheter
IR Light	Bosch	EX12LED-3BD-8W	Facilitates recordings in the dark
LabChart Pro (2019, Version 8.1.16)	ADInstruments	N/A	ECG Analysis
JELCO PROTECTIV Safety I.V. Catheters, 25 gauge	Smiths Medical	3060	Used to catherize marginal ear vein
MATLAB (R2019b, Update 5)	MathWorks	N/A	Required to run EEGLAB
Microphone	Sony Stereo	ECM-D570P	Recording of audible manifestions of seizures
Micropore Medical Tape, Paper, White	3M	1530-1	Used to secure wires and create ear splint
Natus NeuroWorks	Natus	LC101-8	Acquisition and review software
Pentylenetetrazol (1 - 10 mg/kg always in 1mL volume)	Sigma-Aldrich	88580	Dilutions prepared in saline
Photic Stimulator	Grass	PS22	Stimulator to control frequency, delay, duration, intensity of the light pulses
Plastic wire organizer / bundler	12Vwire.com	LM-12-100-BLK	Bundle wires to cut down on noise
PS 22 Photic Stimulator	Grass Instruments	BZA641035	Strobe light with adjustable flash frequency, delay, and intensity
PVC pipe	Generic	N/A	Prevents small rabbits from kicking their hind legs and causing spinal injury
Quantum Amplifier	Natus	13926	Amplifier / digitizer
Quantum HeadBox Amplifier	Natus	22134	64-pin breakout box
Rabbit Restrainer	Plas-Labs	501-TC	Various size rabbit restrainers are available. 6" x 18" x 6" in this study.
Rubber pad (booster)	Generic	N/A	Raises small rabbits up in the restrainer to prevent neck compression
SpO2 ear clip	NONIN	61000	PureSAT/SpO2
SpO2 sensor adapter	NONIN	13931	XPOD PureSAT/SpO2
SRG-X120 1080p PTZ Camera with HDMI, IP & 3G-SDI Output	Sony	SRG-X120	Impela Camera
Terumo Sur-Vet Tuberculin Syringe 1cc 25G X 5/8" Regular Luer	Sur-Vet	13882	Used to inject intravenous medications
Veterinary Injection Plug Luer Lock	Sur-Vet	SRIP2V	Injection plug for inserting the needle for intravenous medication
Webcol Alcohol Prep, Sterile, Large, 2-ply	Covidien	5110	To prepare ear vein before catheterization