ניטור רב מערכתי לזיהוי התקפים, הפרעות קצב וקום נשימה בארנבים מאופקים מודעים

Summary

באמצעות וידאו-EEG-א.ק.ג-אוקסימטריה-קפנוגרפיה בו זמנית, פיתחנו מתודולוגיה להערכת הרגישות של מודלים ארנב לפתח הפרעות קצב והתקפים עוררו. מערכת הקלטה חדשנית זו מקימה פלטפורמה לבדיקת היעילות והבטיחות של הטיפולים ויכולה ללכוד את המפל המורכב של אירועים רב מערכתיים שמגיעים לשיאם במוות פתאומי.

Abstract

חולים עם תקשורי יון נמצאים בסיכון גבוה לפתח התקפים והפרעות קצב לב קטלניות. יש שכיחות גבוהה יותר של מחלות לב והפרעות קצב אצל אנשים עם אפילפסיה (כלומר, לב אפילפטי.) בנוסף, דווח על הפרעות לב והפרעות אוטונומיות סביב התקפים. 1:1,000 חולי אפילפסיה / שנה למות ממוות בלתי צפוי פתאומי באפילפסיה (SUDEP). המנגנונים עבור SUDEP נשארים מובנים לחלוטין. אלקטרואנצפלוגרמות (EEG) ואלקטרוקרדיוגרמות (א.ק.ג. ) הן שתי טכניקות המשמשות באופן שגרתי בסביבה הקלינית לגילוי וללמוד את המצעים/הגורמים המפעילים להתקפים ולהפרעות קצב. בעוד מחקרים ותיאורים רבים של מתודולוגיה זו נמצאים מכרסמים, הפעילות החשמלית הלבבית שלהם שונה באופן משמעותי מבני אדם. מאמר זה מספק תיאור של שיטה לא פולשנית להקלטת וידאו-EEG-ECG-אוקסימיטרי-קנפנוגרפיה בו זמנית בארנבים מודעים. כמו תפקוד חשמלי לב דומה ארנבים ובני אדם, ארנבים לספק מודל מצוין של אבחון תרגום ומחקרים טיפוליים. בנוסף לתיאור המתודולוגיה לרכישת נתונים, אנו דנים בגישות האנליטיות לבחינת תפקוד חשמלי נוירו-לבבי ופתולוגיה בארנבים. זה כולל גילוי הפרעות קצב, ניתוח ספקטרלי של EEG וסולם התקפים שפותח עבור ארנבים מאופקים.

Introduction

אלקטרוקרדיוגרפיה (א.ק.ג. ) משמשת באופן שגרתי בסביבה הקלינית כדי להעריך את הדינמיקה של הולכה חשמלית לבבית ואת תהליך ההפעלה החשמלית-התאוששות. א.ק.ג. חשוב לגילוי, לוקליזציה והערכת הסיכון להפרעות קצב, איסכמיה ואוטמים. בדרך כלל, אלקטרודות מודבקות על החזה, הידיים והרגליים של המטופל על מנת לספק תצוגה תלת מימדית של הלב. הסטה חיובית מיוצרת כאשר הכיוון של דפולריזציה שריר הלב הוא לכיוון האלקטרודה הסטה שלילית מיוצרת כאשר הכיוון של דפולריזציה שריר הלב הוא מן האלקטרודה. רכיבים אלקטרוגרפיים של מחזור הלב כוללים דה-פולריזציה של התווכים (גל P), הולכה בין חדרית (מרווח P-R), עירור חדרי (קומפלקס QRS) ורפולריזציה חדרית (גל T). ישנם קווי דמיון גדולים באק"ג ובאמצעי פעולה פוטנציאליים על פני יונקים רבים כולל בני אדם, ארנבים, כלבים, שרקנים, חזירים, עזים וסוסים^1,2,3.

ארנבים הם מודל אידיאלי למחקר תרגום לב. לב הארנב דומה ללב האנושי מבחינת הרכב ערוץ היונים, ותכונות פוטנציאליות פעולה^2,4,5. ארנבים שימשו ליצירת מודלים גנטיים, נרכשים ומושרים על ידי סמים של מחלות לב^2,4,6,7,8. ישנם קווי דמיון גדולים באק"ג הלב ותגובה פוטנציאלית פעולה לסמים בבני אדם וארנבות^7,10,11.

קצב הלב ותהליך ההפעלה החשמלית הלבבית שונה מאוד במכרסמים, בהשוואה לארנבים, בני אדם ויונקים גדולים אחרים^12,13,14. לב המכרסמים פועם במהירות של פי 10 מבני האדם. לעומת זאת, לפלח ST iso-חשמלי באק"ג אנושי וארנב, אין קטע ST במכרסמים^14,15,16. כמו כן, מכרסמים יש צורת גל QRS-r' עם גל T הפוך^14,15,16. מדידות של מרווח QT שונות מאוד מכרסמים לעומת בני אדם וארנבות^14,15,16. יתר על כן, ערכי אק"ג נורמליים שונים מאוד בבני אדם לעומת מכרסמים^12,15,16. הבדלים אלה בצורות הגל של א.ק.ג. ניתן לייחס להבדלים במורפולוגיה הפוטנציאלית של הפעולה ובתעלות היונים המניעות התחדשות לב^9,14. בעוד זרם אשלגן חיצוני חולף הוא זרם repolarizing העיקרי קצר (שאינו כיפה) מורפולוגיה פוטנציאל פעולה לב במכרסמים, בבני אדם וארנבות יש כיפה שלב 2 גדול על פוטנציאל הפעולה, ואת זרמי אשלגן מתקן מעוכב (אני_Kr ו- I_Ks) הם זרמי repolarizing העיקריים בבני אדם וארנבות^4,9,13,17. חשוב לציין, הביטוי של אני_Kr ואני_Ks נעדר / מינימלי מכרסמים, ובשל קינטיקה הפעלה זמנית של אני_Kr ואני_Ks אין לו תפקיד במורפולוגיה פוטנציאל פעולה לב^9,13. לכן, ארנבים מספקים מודל תרגום יותר להערכת המנגנונים עבור סמים המושרה, רכש, וירש חריגות א.ק.ג. הפרעות קצב^4,7,13. לאחר מכן, כפי שמחקרים רבים הראו נוכחות של מומים חשמליים עצביים ולבביים בלב ראשוני (תסמונת QT ארוכה^18,19,20) או מחלות עצביות (אפילפסיה^21,22,23,24), חשוב לחקור את המנגנונים הבסיסיים במודל של בעלי חיים המשחזר מקרוב את הפיזיולוגיה האנושית. בעוד מכרסמים עשויים להיות מספיק כדי מודל המוח האנושי, מכרסמים אינם מודל אידיאלי של פיזיולוגיה לב^{אנושית 7}.

אלקטרואנצפלוגרפיה (EEG) משתמשת באלקטרודות, הממוקמות בדרך כלל על הקרקפת או תוך מצחית, כדי לתעד תפקוד חשמלי קליפת המוח. אלקטרודות אלה יכולות לזהות שינויים בקצב הירי ובסינכרוניזציה של קבוצות של נוירונים פירמידליים סמוכים בקליפת המוח²⁵. מידע זה יכול לשמש כדי להעריך את תפקוד המוח ומצב ער / שינה. כמו כן, EEGs שימושיים כדי לוקליזציה פעילות אפילפטית, ולהבחין התקפים אפילפטיים מאירועים שאינם אפילפטיים (למשל, פעילות פסיכוגנית שאינה אפילפטיפורמית ואירועים קרדיוגניים). על מנת לאבחן סוג אפילפסיה, גורמים מעוררים, ומקור ההתקף, חולי אפילפסיה נתונים לתמרונים שונים אשר עלולים להביא להתקף. שיטות שונות כוללות היפרוונטילציה, גירוי פוטיסטי, וחוסר שינה. פרוטוקול זה מדגים את השימוש בגירוי פובי כדי לגרום לסטיות EEG והתקפים בארנבים^26,27,28,29.

הקלטות וידאו-EEG-ECG בו זמנית שימשו בהרחבה בבני אדם ומכרסמים כדי להעריך פעילות התנהגותית, עצבית ולבבית במהלך המצבים הפרה-איטלים, האיקטליים והפוסט-איטלים³⁰. בעוד מספר מחקרים ערכו הקלטות EEG ו- ECG בנפרד ארנבות^4,31,32,33, מערכת לרכישת וניתוח בו זמנית וידאו-EEG-ECG בארנב המאופק המודע אינו מבוסס היטב³⁴. מאמר זה מתאר את העיצוב והיישום של פרוטוקול שיכול להקליט בו זמנית נתוני וידאו-EEG-ECG-capnography-oximetry בארנבים מודעים על מנת להעריך את תפקודי החשמל והנשימה של נוירו-לב. תוצאות שנאספו משיטה זו יכולות להצביע על הרגישות, הגורמים המפעילים, הדינמיקה וההתנשאות בין הפרעות קצב, התקפים, הפרעות נשימה וביטויים פיזיים. היתרון של המערכת הניסיונית שלנו הוא שאנו רוכשים הקלטות מודעות ללא צורך בסם הרגעה. הארנבים נשארים במרסנים במשך ≥5 שעות, עם תנועה מינימלית. כמו הרדמה להטריד עצבי, לב, נשימה, ותפקוד אוטונומי, הקלטות במהלך המצב המודע לספק את הנתונים הפיזיולוגיים ביותר.

מערכת הקלטה זו עשויה בסופו של דבר לספק תובנות מפורטות כדי לקדם את ההבנה של המנגנונים הנוירולוגיים, הלב והנשימה למוות בלתי צפוי פתאומי באפילפסיה (SUDEP). בנוסף ניטור נוירולוגי ולב לעיל, ראיות האחרונות תמכו גם את התפקיד של כשל נשימתי כתרומה פוטנציאלית למוות פתאומי לאחר התקף^35,36. כדי לפקח על מצב הנשימה של הארנבים, אוקסימטריה וקפנוגרפיה יושמו כדי להעריך את מצב מערכת הנשימה לפני, במהלך ואחרי התקף. הפרוטוקול שהוצג כאן תוכנן במטרה להעריך את הסף להתקפי ארנבות הנגרמים על ידי גירויים תרופתיים ופוטטיים. פרוטוקול זה יכול לזהות חריגות EEG ו- ECG עדינות שעלולות שלא לגרום לביטויים פיזיים. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש לבטיחות לב ובדיקות יעילות אנטי הפרעות קצב של תרופות ומכשירים חדשניים.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) והוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של האוניברסיטה הרפואית בצפון המדינה. בנוסף, מתווה של פרוטוקול זה ניתן באיור 1.

1. הכנת ציוד הקלטה

1. חבר את המחשב למגבר באמצעות תיבת 64 פינים.
   הערה: לכל חיה יש ארבע אלקטרודות סיכת קרקפת תת עורית ישרה (7 או 13 מ"מ) עבור EEGs מארבעת הרבעים של הראש, 3 אלקטרודות סיכת חזה תת עורית מכופפות (13 מ"מ, זוויתשל35מעלות) עבור אק"ג (משולש איינתיובן), אלקטרודה קרקעית סיכה תת עורית מכופפת על רגל ימין, ואלקטרודה סיכת קרקפת תת עורית ישרה במרכז הראש משמשת כנקודת התייחסות.
2. כדי להפוך כל^{סיכה 8} בתיבת הראש לעיון, עדכן את הגדרות תוכנת הרכישה, כרטיסיית הרכישה, כך שאלקטרודה הפניה היא "עצמאית" (כלומר, מצב מחקר).
   הערה: זה מאפשר הקלטות של עד 7 בעלי חיים בו זמנית, כל אחד עם 7 אלקטרודות בתוספת אלקטרודה התייחסות ייעודית ואלקטרודה הקרקע, כל דרך מגבר אחד, דיגיטציה, ומחשב. כל האלקטרודות נרכשות כערוצים חד קוטביים ובהשוואה לעיון (מרכז הראש). ניתן להגדיר תצורות/מונטאז' דו-קוטביות ומוגדלות נוספות במהלך ההקלטה או לאחריה. מכיוון שלהגדרה יש את היכולת להקליט מבעלי חיים מרובים בו זמנית, אלקטרודה קרקעית מכל חיה מחוברת במקביל לקלט הקרקעי במגבר (איור 2).
3. הסר ארנבים מהכלוב שלהם ולשקול אותם כדי לחשב את מינון התרופה המתאים עבור כל בעל חיים. מניחים את הארנבים במוביל תחבורה ומביאים אותם לחדר נפרד על מנת למזער את הלחץ על בעלי חיים שאינם ניסיוניים. במחקר זה נעשה שימוש בארנבים לבנים ממין זכר ונקבה מניו זילנד, ובצאצאיהם הבאים. ניסויים בוצעו על ארנבים > גיל חודש. בזמן הניסוי, ארנבים אלה שקלו בין 0.47 ל 5.00 ק"ג.
   הערה: מכיוון שהארנבים צריכים להיות באותו חדר ולאתר המצלמה, אל תבודדו לחלוטין את הארנבים. קיים פוטנציאל לביטויים חזותיים ושמיעתיים מארנב אחד המדגיש ארנב אחר. לכן, זה אידיאלי שיש ארנב אחד בחדר בכל פעם, אשר נעשה עבור ניסויים גירוי פוטיסטי. עבור כל הניסויים האחרים, הארנבים מרווחים ככל האפשר, תוך שמירה על כולם בתוך התצוגה של מצלמת הווידאו. באופן אידיאלי, מחסומים משמשים או רק חיה אחת נחקרת בכל פעם. זה לא היה קונפונדר גדול כמו קצב הלבשל הארנבים נשאר יציב למדי במהלך הניסויים והייתה נוכחות תכופה של צירי שינה. הקלטות מבעלי חיים מרובים בו זמנית מבטיחות כי הן נתוני בעלי חיים בקרה והן מבחן נרכשים באותם תנאים סביבתיים.

2. השתלת אלקטרודות EEG-ECG וחיבר צגים נשימתיים

1. מוציאים ארנב אחד מנושאת ההובלה ומניחים בחיקו של חוקר יושב.
2. החזק את הארנב אנכית ושמור אותו קרובלגופושל החוקר.
3. מנמיכים את הארנב לתנוחה על-חושית, כשראשהארנבעל ברכיושל החוקר וראשהארנבנמוך משאר גופו.
   הערה: תמרון זה מרגיע את החיה ומצמצם את הסבירות שהיא מנסה לנוע או לברוח תוך הצבת האלקטרודות.
4. כעת, כשהארנב מאובטח בתנוחה על-חושית, בקשו מחוקר שני להפיץ את הפרווה עד שניתן יהיה לזהות ולבודד את העור מהרקמה הבסיסית.
5. הכנס אלקטרודות מכופפות ב-35° באופן תת-קרקעי בכל ציר (איור 3A).
   הערה: יש לדחוף את האלקטרודות כך שהן מחוברות בבטחה לעור, אך אינן חודרות למבנים עמוקים יותר. העובדה שהאלקטרודה נכנסת ואז יוצאת מהעור (דרך ודרך) מפחיתה את הסיכוי שהלידים יסולקו בעת הנחת הארנב במרסן או אם הוא זז במהלך הניסוי (איור 3B). כל האלקטרודות הן סטריליזאות עם 70% אתנול לפני המיקום.
6. המקום מוביל על החזה האחורי ימינה ושמאלה forelimbs ועל הבטן לפני האיבר האחורי השמאלי. הניחו סיכה-אלקטרודה טחונה לפני הגפה האחורית הימנית על הבטן (איור 4A).
7. לאחר שכל מובילי האק"ג ממוקמים כראוי, החזירו את הארנב למצב מועד, כאשר הלידים רצים במעלה צד אחד של בטן הארנב, והעבירו את הארנב למרסן בגודל מתאים (למשל, 6 אינץ' x 18 אינץ' x 6 אינץ').  בעת הנחת הארנב במרסן, משוך את החוט הרופף כלפי מעלה כדי למזער את הארנב מלשלוף את האלקטרודות עם רגליו. הדבק את החוטים לצד המרסן כדי שלא יתפסו מתחת לארנב במהלך הניסוי(איור 4B).
8. אבטחו את הארנב במרסן על ידי הנמכת האיפוק סביב הצוואר ונעילתו למקומו. בנוסף, להזיז את הגפיים האחוריות מתחת לחיה ולאבטח את האיפוק האחורי.
   הערה: אחד צריך להיות מסוגל להתאים 1-2 אצבעות בתוך החלל מתחת לצוואר כדי להבטיח שזה לא הדוק מדי. במיוחד במהלך ניסויים שבהם עשויה להיות תנועה מוטורית, חשוב להדק את האיפוק כדי למזער את התנועה, פציעות אפשריות בעמוד השדרה, נקע בגפיים והיכולת לבעוט את הריסון האחורי (איור 4B). ארנבים נשמרו במרסן במשך ~ 5 שעות ללא בעיות הקשורות לתנועה מוגברת או סימנים של התייבשות.
   1. עבור ארנבים קטנים (למשל, פחות מחודשיים) מניחים כרית זריקת גומי מתחת לחיה כדי להרים את הארנב למעלה, מה שמונע מהארנב להניח את צווארו על תחתית ריסון הראש (איור 4C).
      הערה: ירידה פתאומית בקצב הנשימה והלב עשויה להיות משנית לפגיעה בצוואר. אם זה קורה, לשחרר את מרסן הצוואר ולהרים את ראשושלהארנב ' כדי להקל על כל דחיסת הצוואר.
   2. כאשר האיפוק האחורי אינו עוקב מקרוב אחר הגב / עמוד השדרה של הארנב, למקם מרווח PVC כדי למנוע כל תנועה שעלולה לגרום לפציעות בעמוד השדרה.
      הערה: לדוגמה, ~ 14 ס"מ אורך x 4" צינור PVC בקוטר פנימי, עם התחתון 25-33% הוסר ניתן להציב מעל הארנב עם קצף כדי לספק ריסון מתאים (איור 4C).
9. כעת, כשהארנב ממוקם בבטחה לתוך המרסן, הכנס את אלקטרודות הסיכה הישרות בתת-היבשת בגודל 7.13 מ"מ לקרקפת(איור 3A). באמצעות גישה זווית 45° של הכניסה, להפעיל את החוטים בין האוזניים, באופן רופף לקשור את החוטים למרסן מאחורי הראש כדי לשמור על מיקום עופרת. מיקום 5 EEG מוביל במיקומים הבאים: ימין שני, שמאלי, עורף ימני, עורף שמאלי והפניה מרכזית (Cz) מובילים בנקודה שבין 4 ההפניות האחרות (איור 4D).
   הערה: אלקטרודות ממוקמות כראוי כאשר הם ממוקמים לתוך רקמה תת עורית נגד הגולגולת. מיקום זה ממזער חפץ מהאף, מהאוזניים ומהשרירים הסובבים אותו. חלק מהחפץ מתנועת האף הקצבית הוא בלתי נמנע. מוביל EEG לפני הלידים צריך להיות ממוקם המדיאלי לעיניהארנבולהצביע מראש. הפניות העורפיות צריכות להיות ממוקמות לפני האוזניים ויצביעו על הכיוון המדיאלי. Cz ממוקם במרכז החלק העליון של הראש בנקודה כי הוא בין כל 4 אלקטרודות (באמצע הדרך בין Lambda ו Bregma, לאורך קו התפר). הסיכה של אלקטרודה Cz מצביעה מראש.
   1. מעבירים את חוטי האא"ג בין האוזניים, כדי למנוע מהארנב לנסות לנשוך את החוטים.
10. חבר את plethysmograph אוקסימטר הדופק לאוזנו של הארנב מעל וריד האוזן השולי.
    הערה: ייתכן שיהיה צורך לגלח שיער עודף מהאוזן כדי לשפר את האות או להשתמש קצת גזה כדי לשמור על החיישן במקום.
    1. ודאו שקצב הלב של הפלתיסמוגרפיה תואם לקצב הלב של ה-ECG ושהרוויה בחמצן מוצגת (איור 5C).
11. מניחים בעדינות את מסכת הפנים עם צינורות קפנוגרפיה מעל הפה והאף של הארנב(איור 4H). אבטח את מסכת הפנים באמצעות מחרוזת העוטפת את המסכה וחבר את שני קצות המחרוזת למרסן. חבר את הקצה השני של צינורות הקפנוגרפיה לצג הסימנים החיוניים.
    הערה: חשוב למנוע מהחוט להניח על עיני הארנב במהלך הניסוי. כדי לעשות זאת, הדבק את החוט לאמצע המרסן בין אוזני הארנב. על מנת לשפר את אות הקנוגרפיה, צרו שסתום חד-כיווני באמצעות סרט הדבקה וחתיכת ניטריל דקה שתאפשר לחמצן להיכנס לחתיכת ה-T, ותכניס ישירות את ה-CO2 לצינורות הקפנוגרפיה(איור 4I).

3. הקלטה של וידאו-EEG-אק"ג

1. בצע הקלטת וידאו-EEG-ECG באמצעות תוכנת EEG הזמינה מסחרית.
   הערה: הלידים הביופוטנטיים והווידאו נעולים זמן כדי לתאם מאוחר יותר את אותות החשמל והווידאו (למשל, ספייק EEG עם אידיוט מיוקלוני).
2. אשר קישוריות אופטימלית, ללא נדידת בסיס, ללא רעש חשמלי של 60 הרץ ויחס אות לרעש גבוה. באופן ספציפי, ודא כי כל שלב של צורת הגל הלב יכול להיות חזותי על א.ק.ג. וכי הדלתא, תטא, וגלי אלפא אינם מוסתרים חזותית על ידי רעש בתדר גבוה על EEG.
   1. אם כל האלקטרודות מייצרות כמויות מוגזמות של רעש, התאם את עופרת הייחוס המרכזית. אם רק אלקטרודה אחת רועשת יתר על המידה, אז לדחוף את האלקטרודה עמוק יותר לתוך העור או למקם אותו מחדש עד שאין מתכת חשופה.
3. התאימו את הסרטון כך שניתן יהיה לראות את כל הארנבים בו זמנית, מה שמאפשר מתאם של פעילות מוטורית עם ממצאי EEG (איור 5A).
   הערה: המערכת מכילה הקלטות EEG/ECG/oximetry/capnography בו זמנית של עד 7 ארנבים.
4. התחל את ההקלטה הבסיסית מכל בעל חיים למשך 10-20 דקות לפחות או עד שקצב הלב יתייצב למצב רגוע ורגוע (200-250 לדקה) והארנבים אינם מציגים תנועות גדולות לפחות 5 דקות. השג נתונים אלקטרוגרפיים ברוחב פס מלא ללא מסננים. כדי להמחיש טוב יותר את ערכת הנתונים של מסנן התדר הנמוך (=מסנן מעבר גבוה) ב- 1 הרץ ואת מסנן התדר הגבוה (=מסנן מעבר נמוך) ב- 59 הרץ.
   הערה: סימן נוסף לכך שהארנב רגוע הוא הופעת צירי השינה של EEG (שנדונו מאוחר יותר).
5. הוסף הערות נעולות בזמן במהלך הניסוי בזמן אמת כדי לציין את העיתוי של התערבויות (למשל, אספקת סמים) ואירועי נוירו-לב (למשל, ספייק EEG, התקפים מוטוריים, פעימה חוץ רחמית והפרעות קצב), וחפצי מנוע/חוקר.
   הערה: בשל התדירות כי החוקר צריך ליישם התערבות (למשל, גירוי photic, אספקת סמים), כדי למזער את הלחץ של חוקר נכנס ויוצא מהחדר ופתיחת / סגירת הדלת, החוקר נשאר בצד השני של החדר לאורך כל הניסוי. החוקר יושב רחוק ככל האפשר מהחיה, ונשאר דומם ושקט כדי למזער את פוטנציאל ההפרעה לבעלי החיים.

4. פרוטוקולים ניסיוניים

הערה: כל אחד מהניסויים הבאים מבוצע בימים נפרדים אם הם מבוצעים על אותה חיה. יש עיכוב של שבועיים בין מחקרי התרופות תרכובת בדיקות אוראלי, ואת מחקר סמים פרו עוויתות סופני חריף. בעת הצורך, הניסוי photic-גירוי מבוצע, ואחריו לחכות 30 דקות, ולאחר מכן את המחקר סמים PTZ.

1. כדי לאפשר לארנבים להתאקלם במרסנים ולחוקר לאשר באופן אובייקטיבי ייצוב של שיעורי הלב וכלי טיס, מכשיר כל הארנבים עם חיישנים cardiorespiratory ו עצביים ולבצע ניטור וידאו מתמשך במשך > 1 שעה, 1 - 3 פעמים לכל בעל חיים.
2. ניסוי גירוי פוטי
   1. בנוסף לשיטה המתוארת לעיל, מניחים מקור אור עם רפלקטור עגול 30 ס"מ מול הארנב בגובה העיניים, כאשר עוצמת הפלאש מוגדרת למקסימום (16 קנדלה)²⁹. מקור האור מצוין בנקודה לבנה באיור 4E.
      הערה: יש להשתמש בחדר מואר באפלולית כדי לעורר את התגובה רגישה³⁷.
   2. כשעיניהארנבנמצאות בצד הראש במקום בקדמת ראשו (כמו בבני אדם), הניחו 2 מראות משני צדי הארנב, ו-1 מאחורי הארנב, כך שהאור נכנס לעיניהארנב.
      הערה: מראה שטוחה שגובהה ≥ 20 ס"מ, באורך ≥ 120 ס"מ יוצרת מארז משולש סביב הארנב כדי להבטיח שהאור המהבהב ייכנס לעיניהארנב,כפי שניתן לראות באיור 4E.
   3. חבר את מקור האור לבקר בעל קצב, עוצמה ומשך מתכווננים.
   4. הקלט וידאו באמצעות מצלמה עם אור אדום ויכולות הקלטת אינפרא-אדום.
   5. לחשוף את הארנבים לכל תדר במשך 30 s בעיניים פקוחות ולאחר מכן עוד 30 s עם מסכה כירורגית מכסה את פניהם כדי לדמות או לגרום לסגירת עיניים בכל תדירות.
      הערה: מחקרים קודמים הראו כי סגירת העין היא התמרון הפרובוקטיבי ביותר לתביעת רגישות לתפיסה²⁹. בנוסף, 10% מהחולים רגישים לאור מפגינים רק סימנים אלקטרואנצפלוגרפיים בעוד עיניהם עצומות²⁹. התקף יכול להיות מזוהה קלינית על ידי התבוננות בנוכחות של מטומטמים מיוקלוניים בראש ובגוף שלם, clonus, או מצב טוניק. הקלטת EEG מנותחת ביסודיות רבה יותר עבור מתאם אלקטרואנצפלוגרפי (למשל, קוצים, קוצים פולי ופריקות קצביות) עם ביטויים מוטוריים לאבחון סופי של פעילות התקף. תנועות שבהן EEG מוסתר על ידי חפץ שריר או גלים של אפילפטוגניות לא מוגדרת צריך להיבדק על ידי אפילפטולוג לאישור.
   6. הגדל את תדר הגירוי הפוטיסטי מ- 1 הרץ ל- 25 הרץ במרווחים של 2 הרץ. לאחר מכן בצע את אותו פרוטוקול גירוי תמונה, אך הפעם להקטין את התדירות מ 60 הרץ ל 25 הרץ במרווחים 5 הרץ.
      הערה: אם לארנב יש התקף, יש להפסיק את הניסוי. המשך לפקח על הארנב במשך 30 דקות. ואז להחזיר את הארנב לחדר הדיור ולפקח כל 1 שעה במשך 3 שעות להחלמה מלאה. עם זאת, אם הגירוי הפובי גורם לתגובה פוטו-פרוקסימלית, המערכת מדלגת על שאר התדרים העולים והסדרה מופעלת שוב על ידי ירידה מ- 60 הרץ עד שמתרחשת תגובה פוטו-פרוקסימלית נוספת. זה יאפשר קביעת סף הגירוי הפובי העליון והתחתון. אין צורך בעיכוב מכיוון שהתגובה הפוטו-חמצןית תיפסק לאחר הפסקת הגירוי הפוטי. אם לא ברור אם תגובה פוטו-אוקסימלית התרחשה, התדירות חוזרת על עצמה לאחר עיכוב של 10 שניות³⁸.
   7. לאחר השלמת הניסוי, להסיר EEG ו- ECG מוביל מן הארנב ולהחזיר אותו לכלוב הבית שלה לטיפול שגרתי על ידי צוות הבעלות.
3. מתן תרופות דרך הפה
   1. כמו תרופות רבות נלקחים דרך הפה, להכין תרכובות אוראלי על ידי ערבוב עם רוטב תפוחים כיתה מזון. מערבבים 0.3 מ"ג/ק"ג של E-4031 ב 3 מ"ל של רוטב תפוחים לטעון לתוך 3 מ"ל אוראלי / מזרק השקיה ללא מחט.
      הערה: מספר תרופות ניתן לתת בצורה זו כולל, תרכובות בדיקה, תרופות הידועות לשנות את משך QT (moxifloxacin או E-4031), ושליטה שלילית או רכב. תרופות מסוימות אינן זמינות בניסוח תוך ורידי. בנוסף, תרופות רבות ניתנות ניסוח אוראלי ולכן ממשל תוך ורידי עשוי להיות פחות רלוונטיות קלינית.
   2. הרם את השפתיים העליונות והחלק את קצה המזרק האוראלי לצדפיושל הארנב, אשר אינו מופרע על ידי שיניהארנב,והזרק את כל התרופות ורוטב התפוחים לתוךפיושל הארנב.
   3. המשך את הקלטת וידאו-EEG-ECG במשך 2 שעות ולאחר מכן להחזיר את החיה לכלוב הבית שלה לטיפול שגרתי.
   4. ביום הניסוי 2 ו -3, לחבר את הארנב וידאו-EEG-ECG, להקליט 10-20 דקות של בסיס, ואז להזריק את אותה תרופה שיא עבור 2 שעות.
   5. לאחר שבוע אחד של שטיפה, לבצע 10-20 דקות של בסיס, ולאחר מכן לתת לכל ארנב מנה אחת של פלצבו במשך 3 ימים רצופים שיא עבור 2 שעות.
      הערה: מתן תרופות דרך הפה עשוי להיות מתוכנן כמחקר קרוסאובר, שבו הפלצבו ניתן במהלך השבוע 1 ואת התרופה בשבוע 2.
4. ניסוי תרופתי תוך ורידי (Pentylenetetrazol, PTZ)
   1. על מנת לדמיין את וריד האוזן השולי, לגלח את פני השטחהאחורייםשל אוזן הארנב . השתמשו במגבון אתנול של 70% כדי לחטא את האתר ולהטמיע את וריד האוזן השולי. זה מצוין על ידי אליפסה מקווקו שחור באיור 4F.
   2. בשלב זה, יש ניסוי אחד לכסות את פניושלהארנב עם היד שלהם על מנת להפחית את הלחץ של ההליך לארנב. ניסוי שני מקנוס בזהירות את וריד האוזן השולי עם אנגיוקטטר סטרילי של 25-G.
   3. לאחר הקטטר הוא בווריד, מניחים תקע הזרקה סטרילי בסוף הקטטר, כך מחט יכול להציג תרופות דרך הווריד. מיקום תקע ההזרקה מצוין בעיגול כחול באיור 4G.
   4. הפוך קיבוע על ידי גלישת 4 x 4 אינץ גזה עם קלטת, כך שהוא יוצר צורת צינור ומניח אותו בתוך האוזן של הארנב. לאחר מכן הדבק את הסד לאוזן כך שהקטטר מאובטח במקום ונשאר זקוף, בדומה לאוזן הלא צנתורה.
   5. להזריק 1 מ"ל של 10 יחידות USP לכל מ"ל של מלוחים הפריניזציה.
      הערה: הקטטר וכלי השיט צריכים להיות נקיים בעליל מהאוויר ולהישאר פטנט. אם הקטטר אינו בכלי, המזרק לא ידחוף בקלות ויהיה הצטברות של מלוחים ברקמה התת עורית.
   6. תן ארנבים מינונים מצטברים של PTZ תוך ורידי מ 1 מ"ג / קילוגרם ל 10 מ"ג / קילוגרם במרווחים 1 מ"ג / קילוגרם כל 10 דקות. שים לב בתחילת כל מנה כדי לציין איזו חיה מוזרקת ואת ריכוז התרופה.
      הערה: הדבר מאפשר הערכות של ההשפעות החריפות והתוספות של הנהלת PTZ. לחלופין, כדי להעריך עוד יותר את ההשפעות הכרוניות של PTZ במינון נמוך, הארנב מקבל מינונים חוזרים ונשנים בכל ריכוז במינון נמוך, 7 מנות ב 2 מ"ג / קילוגרם, 3 מנות ב 5 מ"ג / קילוגרם, אז 3 מנות ב 10 מ"ג / קילוגרם, כל מנה מופרדת על ידי 10 דקות.
   7. לאחר כל מנה, נטר בזהירות את וידאו-EEG-אק"ג-קנפנוגרפיה-אוקסימיטריה עבור כל חריגות חשמליות ונשימה נוירו-לב וראיות חזותיות לפעילות אפילפטיפורם. שים לב לשינויים אלה בזמן אמת ובמהלך הניתוח שלאחר הניתוח.
      הערה: פעילות התקפים מתחילה לעתים קרובות בתוך 60 s של ממשל PTZ.

5.סיום ניסויים שאינם הישרדות.

1. אם הארנב לא חווה מוות פתאומי במהלך הניסוי PTZ, לנהל 1mL של 390 מ"ג / מ"ל של נתרן pentobarbital עבור כל 4.54 ק"ג של משקל גוף (או 1.5 מ"ל לכל הארנבים), ואחריו סומק 1 מ"ל של מלוחים רגילים. לפקח על א.ק.ג. כדי לוודא שהארנב עובר דום לב.
2. לאחר הארנב חווה דום לב, במהירות לבצע necropsy כדי לבודד טרי איברים שונים, כולל הלב, הריאות, הכבד, המוח, שריר השלד, וכל רקמה אחרת הדרושה לניתוחים מולקולריים / ביוכימיים הבאים.
3. להשליך את הארנב בהתאם למדיניות המוסדית.

6. ניתוח של א.ק.ג.

1. השתמש בתוכנת ניתוח א.ק.ג. זמינה מסחרית כדי לבדוק חזותית את ה-ECG, ולזהות תקופות של טכיקרדיה, ברדיקרדיה, פעימות חוץ רחמיות והפרעות קצב אחרות(איור 6). כדי להפחית את כמות הנתונים לסקירה, צור טכוגרם, אשר יגדיל את הקלות שבה תקופות של טכיקרדיה, ברדיקרדיה, או אי סדרים של מרווח RR ניתן לזהות.
   הערה: חריגות א.ק.ג. (למשל, הארכת QT_c) והפרעות קצב מזוהות ידנית על ידי סקירת האק"ג עבור חריגות בקצב (למשל, בריידי-/טאצ'י-הפרעות קצב), קצב (למשל, מתחמי פרוזדורים/חדריים מוקדמים), הולכה (למשל, בלוק חדרי אטריו) וצורת גל (למשל, טכיקרדיה פרוזדורים/חדריים שאינם סינוסים ופרפור.) הפרעות קצב ניתן לזהות על ידי סקירת tachogram עבור אי סדרים במרווח RR. טכיקרדיה ניתן לזהות על ידי חלקים של טכוגרם שבו קצב הלב הוא מעל 300 פעימות לדקה. ברדיקרדיה מזוהה כאשר קצב הלב הוא פחות מ 120 פעימות לדקה על טכוגרם.
2. באמצעות תוכנת ניתוח א.ק.ג. זמינה מסחרית, בצע מדידות אק"ג סטנדרטיות (דופק, מרווחי מחזור לב) בבסיס ובהתגרות (למשל, חוקר המתמרן את החיה, ניהול סוכני בדיקה ושינויי א.ק.ג. הנגרמים מהתקפים).

7. ניתוח וידאו-EEG

1. גלול באופן חזותי בין מעקב הווידאו וה-EEG באמצעות תוכנה מסחרית זמינה לזיהוי האות הבסיסי (איור 7)והנוכחות של הפרשות EEG צפויות כגון צירי שינה (איור 8) וגלי קודקוד (איור 9).
   הערה: למרות שנתונים אלקטרוגרפיים ברוחב פס מלא נרכשים ללא מסננים, יש להציג נתונים עם מסנן התדר הנמוך (כלומר,מסנן מעבר גבוה) המוגדר על 1 הרץ, ובהתבסס על משפט נייקוויסט, מסנן התדר הגבוה (כלומר, מסנן מעבר נמוך) מוגדר על 120 הרץ כדי למנוע החמצת אות. ניתן לכוונן את המסננים כך שיאפשרו תצוגה חזותית טובה יותר והפחתת רעשים (לדוגמה, 1-59 הרץ) בעת סקירת פעילות EEG בתדר נמוך יותר (<25 הרץ).
2. בנוסף צורות גל קפנוגרפיה, להשתמש חפץ תנועת האף על EEG כדי לקבוע את הנוכחות לעומת היעדר נשימה. זה יכול להיות גם בקורלציה עם תנועות האף לראות על הקלטת וידאו.
3. גלול באופן חזותי בין מעקב הווידאו וה-EEG באמצעות תוכנה מסחרית זמינה כדי להבחין בין תנועות אפילפטיות לעומת תנועות לא אפילפטיות (למשל, מודעות) למשך דקה אחת לפחות לאחר כל מנה של PTZ (איור 10). יש לסרוק הפרשות אפילפטיות בין-משרדיות ולשינויי EEG לפני, במהלך ואחרי התקפים. התקף יכול להיות מזוהה קלינית על ידי התבוננות בנוכחות של מטומטמים מיוקלוניים בראש ובגוף שלם, clonus, או מצב טוניק עם מתאם EEG. שינויי ה-EEG עשויים לכלול קוצים EEG, קוצים פולי, ופריקות קצביות.
   הערה: תנועות שבהן האא"ג מוסתר על ידי חפץ שרירים או גלים של אפילפטוגניות לא מוגדרת צריך להיבדק על ידי נוירולוג לאישור. זה עשוי להיות יתרון למקד את הווידאו על ארנב אחד כדי להציג את התנהגותו, כמו גם הקלטות EEG ו- ECG שלה, מקרוב יותר (איור 5B).
4. ציון וידאו-EEG עבור התקפים המבוססים על סוג וחומרת ביטויים מוטוריים, אשר מתרחשים בדרך כלל בתוך 1 דקות לאחר הזרקת PTZ (טבלה 1).
5. לאחר ניסוי גירוי photic, לנתח את הלידים העורפיים של EEG לנוכחות והיעדר קצב הנהיגה העורפי על ידי יצירת עלילה ניתוח ספקטרלי בתוכנת ניתוח EEG זמין מסחרית. קצב הנהיגה העורפי ייצור שיא בניתוח הספקטרלי התואם את תדירות הממריץ הפוטי (איור 11).
   הערה: גירוי Photic עשוי לייצר פסגות תדר הרמוני בנוסף לשיא התדר הבסיסי.

7. ניתוח תפקוד הנשימה

1. סקור את הפלט מצג הסימנים החיוניים (איור 4I) וייצא את האות לניתוח נוסף.
2. שים לב לשינוי בדפוס הנשימה במהלך התקף ואחרי התקף, במיוחד נקודת הזמן שבה מתחיל דום נשימה.

תוצאות

השיטה המתוארת לעיל מסוגלת לזהות ליקויים במערכת ההולכה החשמלית של המוח והלב, כמו גם הפרעות נשימה. תוכנה לרכישת נתונים משמשת להערכת מורפולוגיה של א.ק.ג ולזיהוי קצב לב חריג, הפרעות הולכה או מקצבי אק"ג (פעימות חוץ רחמיות פרוזדוריות/חדריות, ובריידי/טכי-הפרעות קצב)(א?...

Discussion

התקנה ניסיונית זו מאפשרת הקלטות וניתוחים מפורטים בו זמנית של וידאו-EEG-ECG-oximetry-capnography בארנבים, במיוחד במודלים של מחלות לב ו/או נוירונים. תוצאות מאמר זה מראות כי שיטה זו מסוגלת לזהות התקפים והפרעות קצב ולהבדיל אותם מחפצים אלקטרוגרפיים. התוצאות הצפויות התקבלו בעת מתן ארנבים פרוקונסנט, אשר גרם ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP - Flexible Container	PFIZER (HOSPIRA)	7983-09	Dilutant
10cc Luer Lock syringe with 20G x 1" Needle	Sur-Vet	SS-10L2025	Used as a flush after drug injection
4x4 gauze sponges	Fisher Scientific	22-415-469	Rolled in a tube to splint ear with angiocatheter
Apple Sauce	Kirkland	897971	Vehicle for oral medications
Computer	Dell	Optiplex 5040	Acquisition computer
E-4031	Tocris	1808	Agent known to prolong the QT interval
ECG Electrode	RhythmLink	RLSND116-2.5	13mm 35-degree bent (0.4 mm diameter) subdermal pin electrodes
EEG Electrode	RhythmLink	RLSP513	5-twist 13mm straight (0.4mm diameter) subdermal pin electrodes
EEGLAB (2020)	Swartz Center for Computational Neuroscience	Open Access	Can perform spectral analysis of EEG
Ethernet-to-ethernet adapter	Linksys	USB3G16	Adapter for connecting the camera to the computer
Euthanasia-III Solution	Med-Pharmex	ANADA 200-280	Contains pentobarbital sodium and phenytoin sodium, controlled substance
Foam padding	Generic	N/A	Reduces pressure applied to the neck of small rabbits by the restrainer in order to prevent the adverse cardiorespiratory effects of neck compression
Heparin Lock Flush	Medline	EMZ50051240	To maintain patency of angiocatheter
IR Light	Bosch	EX12LED-3BD-8W	Facilitates recordings in the dark
LabChart Pro (2019, Version 8.1.16)	ADInstruments	N/A	ECG Analysis
JELCO PROTECTIV Safety I.V. Catheters, 25 gauge	Smiths Medical	3060	Used to catherize marginal ear vein
MATLAB (R2019b, Update 5)	MathWorks	N/A	Required to run EEGLAB
Microphone	Sony Stereo	ECM-D570P	Recording of audible manifestions of seizures
Micropore Medical Tape, Paper, White	3M	1530-1	Used to secure wires and create ear splint
Natus NeuroWorks	Natus	LC101-8	Acquisition and review software
Pentylenetetrazol (1 - 10 mg/kg always in 1mL volume)	Sigma-Aldrich	88580	Dilutions prepared in saline
Photic Stimulator	Grass	PS22	Stimulator to control frequency, delay, duration, intensity of the light pulses
Plastic wire organizer / bundler	12Vwire.com	LM-12-100-BLK	Bundle wires to cut down on noise
PS 22 Photic Stimulator	Grass Instruments	BZA641035	Strobe light with adjustable flash frequency, delay, and intensity
PVC pipe	Generic	N/A	Prevents small rabbits from kicking their hind legs and causing spinal injury
Quantum Amplifier	Natus	13926	Amplifier / digitizer
Quantum HeadBox Amplifier	Natus	22134	64-pin breakout box
Rabbit Restrainer	Plas-Labs	501-TC	Various size rabbit restrainers are available. 6" x 18" x 6" in this study.
Rubber pad (booster)	Generic	N/A	Raises small rabbits up in the restrainer to prevent neck compression
SpO2 ear clip	NONIN	61000	PureSAT/SpO2
SpO2 sensor adapter	NONIN	13931	XPOD PureSAT/SpO2
SRG-X120 1080p PTZ Camera with HDMI, IP & 3G-SDI Output	Sony	SRG-X120	Impela Camera
Terumo Sur-Vet Tuberculin Syringe 1cc 25G X 5/8" Regular Luer	Sur-Vet	13882	Used to inject intravenous medications
Veterinary Injection Plug Luer Lock	Sur-Vet	SRIP2V	Injection plug for inserting the needle for intravenous medication
Webcol Alcohol Prep, Sterile, Large, 2-ply	Covidien	5110	To prepare ear vein before catheterization