Monitoreo multisistema para la identificación de convulsiones, arritmias y apnea en conejos restringidos conscientes

Resumen

Usando video-EEG-ECG-oximetry-capnography simultáneo, desarrollamos una metodología para evaluar la susceptibilidad de los modelos del conejo para desarrollar arritmias y asimientos provocados. Este novedoso sistema de grabación establece una plataforma para probar la eficacia y seguridad de la terapéutica y puede capturar la compleja cascada de eventos multi-sistema que culminan en la muerte súbita.

Resumen

Los pacientes con canalopatías iónicas tienen un alto riesgo de desarrollar convulsiones y arritmias cardíacas fatales. Hay una mayor prevalencia de enfermedades cardíacas y arritmias en personas con epilepsia (es decir, corazón epiléptico). Además, los disturbios cardiacos y autonómicos se han divulgado que rodeaban asimientos. 1:1.000 pacientes con epilepsia/año mueren de muerte súbita inesperada en epilepsia (SUDEP). Los mecanismos para SUDEP siguen siendo incompleto entendidos. Los electroencefalogramas (EEG) y los electrocardiogramas (ECG) son dos técnicas utilizadas rutinariamente en el ámbito clínico para detectar y estudiar los sustratos/desencadenantes de las convulsiones y las arritmias. Si bien muchos estudios y descripciones de esta metodología se encuentran en roedores, su actividad eléctrica cardíaca difiere significativamente de la de los humanos. Este artículo proporciona una descripción de un método no invasor para la grabación simultánea video-EEG-ECG-oximetry-capnography en conejos conscientes. Como la función eléctrica cardíaca es similar en conejos y humanos, los conejos proporcionan un excelente modelo de estudios diagnósticos y terapéuticos traslacionales. Además de delinear la metodología para la adquisición de datos, discutimos los acercamientos analíticos para examinar la función eléctrica neuro-cardiaca y la patología en conejos. Esto incluye la detección de arritmias, el análisis espectral de EEG y una escala de convulsiones desarrollada para conejos restringidos.

Introducción

La electrocardiografía (ECG) se utiliza rutinariamente en el ámbito clínico para evaluar la dinámica de la conducción eléctrica cardíaca y el proceso de activación-recuperación eléctrica. El ECG es importante para detectar, localizar y evaluar el riesgo de arritmias, isquemia e infartos. Por lo general, los electrodos se fijan al pecho, los brazos y las piernas del paciente para proporcionar una vista tridimensional del corazón. Una desviación positiva se produce cuando la dirección de la despolarización miocárdica es hacia el electrodo y una desviación negativa se produce cuando la dirección de la despolarización miocárdica está lejos del electrodo. Los componentes electrográficos del ciclo cardiaco incluyen la despolarización atrial (onda de P), la conducción atrial-ventricular (intervalo de P-R), la excitación ventricular (complejo de QRS), y la repolarización ventricular (onda de T). Hay grandes similitudes en el ECG y las medidas de potencial de acción en muchos mamíferos, incluidos los seres humanos, conejos, perros, conejillos de Indias, cerdos, cabras y caballos^1,2,3.

Los conejos son un modelo ideal para la investigación traslacional cardíaca. El corazón de conejo es similar al corazón humano en términos de composición de canales iónicos, y propiedades de potencial de acción^2,4,5. Los conejos se han utilizado para la generación de modelos genéticos, adquiridos y droga-inducidos de la enfermedad cardíaca^2,4,6,7,8. Existen grandes similitudes en el ECG cardíaco y en la respuesta potencial de acción a fármacos en humanos y conejos^7,10,11.

La frecuencia cardíaca y el proceso de activación-recuperación eléctrica cardíaca es muy diferente en roedores, en comparación con los conejos, los seres humanos y otros mamíferos más grandes^12,13,14. El corazón de roedor late ~ 10 veces más rápido que los humanos. En contraste, con el segmento ST iso-eléctrico en ecgs humanos y conejos, no hay segmento ST en roedores^14,15,16. Además, los roedores tienen una forma de onda QRS-r' con una onda T invertida^14,15,16. Las mediciones del intervalo QT son muy diferentes en roedores frente a humanos y conejos^14,15,16. Además, los valores normales de ECG son muy diferentes en humanos frente a roedores^12,15,16. Estas diferencias en las formas de onda del ECG pueden atribuirse a diferencias en la morfología del potencial de acción y en los canales iónicos que impulsan la repolarización cardíaca^9,14. Mientras que la corriente de potasio exterior transitoria es la principal corriente de repolarización en la morfología del potencial de acción cardíaco corto (no domo) en roedores, en humanos y conejos hay una gran cúpula de fase 2 en el potencial de acción, y las corrientes de potasio rectificador retardado (I_Kr e I_Ks)son las principales corrientes de repolarización en humanos y conejos^4,9,13,17. Es importante destacar que la expresión de I_Kr e I_Ks está ausente/mínima en roedores, y debido a la cinética de activación temporal de I_Kr e I_Ks no tiene un papel en la morfología del potencial de acción cardíaco^9,13. Así, los conejos proporcionan un modelo más traslacional para evaluar los mecanismos para las anormalidades y las arritmias droga-inducidas, adquiridas, y heredadas de ECG^4,7,13. A continuación, como numerosos estudios han demostrado la presencia de anomalías eléctricas tanto neuronales como cardíacas en enfermedades cardíacas primarias (Síndrome de QT Largo^18,19,20)o neuronales (epilepsia^{21,22, 23,24),}es importante estudiar los mecanismos subyacentes en un modelo animal que reproduzca de cerca la fisiología humana. Mientras que los roedores pueden ser suficientes para modelar el cerebro humano, los roedores no son un modelo ideal de^{la fisiología}cardíaca humana 7 .

La electroencefalografía (EEG) utiliza electrodos, generalmente colocados en el cuero cabelludo o por vía intracraneal, para registrar la función eléctrica cortical. Estos electrodos pueden detectar cambios en la velocidad de disparo y la sincronicidad de grupos de neuronas piramidales cercanas en la corteza cerebral²⁵. Esta información se puede utilizar para evaluar la función cerebral y el estado despierto/sueño. Además, los EEG son útiles para localizar la actividad epileptiforme y distinguir los ataques epilépticos de los eventos no epilépticos (por ejemplo, la actividad psicógena no epileptiforme y los eventos cardiogénicos). Para diagnosticar el tipo de la epilepsia, los factores que provocan, y el origen del asimiento, sujetan a los pacientes de la epilepsia a las varias maniobras que pueden traer en un asimiento. Varios métodos incluyen la hiperventilación, la estimulación fótica y la privación del sueño. Este protocolo demuestra el uso de la estimulación fótica para inducir aberraciones y convulsiones de EEG en conejos^26,27,28,29.

Las grabaciones simultáneas de video-EEG-ECG han sido ampliamente utilizadas en humanos y roedores para evaluar la actividad conductual, neuronal y cardíaca durante los estados pre-ictal, ictal y post-ictal³⁰. Si bien varios estudios han realizado grabaciones de EEG y ECG por separado en conejos^4,31,32,33,un sistema para adquirir y analizar video-EEG-ECG simultáneo en el conejo consciente restringido no está bien establecido^34. Este trabajo describe el diseño y la implementación de un protocolo que puede grabar datos simultáneos de video-EEG-ECG -capnografía-oximetría en conejos conscientes con el fin de evaluar la función eléctrica y respiratoria neuro-cardíaca. Los resultados recogidos de este método pueden indicar la susceptibilidad, los disparadores, la dinámica y la concordancia entre las arritmias, los asimientos, los disturbios respiratorios, y las manifestaciones físicas. Una ventaja de nuestro sistema experimental es que adquirimos grabaciones conscientes sin la necesidad de un sedante. Los conejos permanecen en los sujetadores durante ≥5 h, con un movimiento mínimo. A medida que los anestésicos perturban la función neuronal, cardíaca, respiratoria y autonómica, las grabaciones durante el estado consciente proporcionan los datos más fisiológicos.

Este sistema de registro puede en última instancia proporcionar penetraciones detalladas para avanzar la comprensión de los mecanismos neurológicos, cardiacos y respiratorios para la muerte inesperada repentina en la epilepsia (SUDEP). Además de la monitorización neurológica y cardíaca anterior, la evidencia reciente también ha apoyado el papel de la insuficiencia respiratoria como una contribución potencial a la muerte súbita después de una convulsión^35,36. Para monitorear el estado respiratorio de los conejos, se implementó oximetría y capnografía para evaluar el estado del sistema respiratorio antes, durante y después de una convulsión. El protocolo presentado aquí fue diseñado con el propósito de determinar el umbral para farmacológico y los asimientos inducidos fótico-estímulos del conejo. Este protocolo puede detectar las anormalidades sutiles de EEG y de ECG que pueden no dar lugar a manifestaciones físicas. Además, este método se puede utilizar para la seguridad cardiaca y la prueba antiarrítmica de la eficacia de drogas y de dispositivos nuevos.

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de salud (NIH) y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica del Norte (IACUC). Además, un esquema de este protocolo se proporciona en la figura 1.

1. Preparación del aparato de control

1. Conecte la computadora a un amplificador con una caja de cabeza de 64 pines.
   NOTA: Cada animal tiene cuatro electrodos de pasador de cuero cabelludo subdérmico recto (7 o 13 mm) para EEGs de los 4 cuadrantes de la cabeza, 3 electrodos de pasador de tórax subdérmico doblado (13 mm, ángulo de 35°) para ECG (triángulodeEinthoven), 1 electrodo de tierra de pin subdérmico doblado en la pierna derecha, y 1 electrodo de pasador de cuero cabelludo subdérmico recto en el centro de la cabeza sirve como referencia.
2. Para hacer que cada 8^º pin en el headbox sea una referencia, actualice la configuración del software de adquisición, la pestaña de adquisición, para que el Electrodo de Referencia sea "Independiente" (es decir, modo de investigación).
   NOTA: Esto permite grabaciones de hasta 7 animales simultáneamente, cada uno con 7 electrodos más un electrodo de referencia dedicado y un electrodo de tierra, todo a través de un amplificador, digitalizador y computadora. Todos los electrodos se adquieren como canales unipolares y se comparan con la referencia (centro de la cabeza). Se pueden configurar configuraciones/montajes de plomo bipolares y aumentados adicionales durante o después de la grabación. Como la configuración tiene la capacidad de grabar desde múltiples animales simultáneamente, un electrodo de tierra de cada animal está conectado en paralelo a la entrada de tierra en el amplificador (Figura 2).
3. Retire los conejos de su jaula y sopesarlos para calcular la dosis de droga adecuada para cada animal. Coloque los conejos en un transporte y lléelos a una habitación separada para minimizar el estrés a los animales no experimentales. En este estudio, se utilizaron conejos blancos de Nueva Zelanda machos y hembras, y su posterior descendencia. Los experimentos fueron realizados en los conejos > 1 mes de la edad. En el momento del experimento, estos conejos pesaban entre 0,47 y 5,00 kg.
   NOTA: Dado que los conejos deben estar en la misma habitación y a la vista de la cámara, no aísle completamente a los conejos. Existe el potencial de manifestaciones visuales y auditivas de un conejo que estresa a otro conejo. Por lo tanto, es ideal tener un conejo en la habitación a la vez, lo que se hace para los experimentos de estimulación fótica. Para todos los demás experimentos, los conejos se espaciar tanto como sea posible, manteniendo todos ellos dentro de la vista de la cámara de vídeo. Idealmente, se utilizan barreras o solo se estudia un animal a la vez. Esto no fue un factor de confusión importante, ya que las frecuencias cardíacasde los conejos se mantuvieron bastante estables durante los experimentos y hubo la presencia frecuente de husillos del sueño. Las grabaciones de múltiples animales aseguran simultáneamente que tanto los datos de animales de control como los de prueba se adquieran bajo las mismas condiciones ambientales.

2. Implantación de electrodos de EEG-ECG y fijación de monitores respiratorios

1. Retire un conejo del transportista y colócale en el regazo de un investigador sentado.
2. Sostenga el conejo verticalmente y manténgalo cercadelcuerpo del investigador.
3. Baje el conejo en una posición supina, con la cabezadelconejo en las rodillasdelinvestigador, y la cabezadelconejo más baja que el resto de su cuerpo.
   NOTA: Esta maniobra relaja al animal y minimiza la probabilidad de que intente moverse o escapar mientras coloca los electrodos.
4. Ahora que el conejo está asegurado en una posición supina, pida a un segundo investigador que extienda el pelaje hasta que la piel pueda ser identificada y aislada del tejido subyacente.
5. Insertar electrodos dobladosa 35° subdérmicamente en cada axila (Figura 3A).
   NOTA: Los electrodos deben ser empujados a través de modo que estén firmemente enganchados a la piel, pero no penetren en estructuras más profundas. Hacer que el electrodo entre y luego salga de la piel (de paso a través) reduce la posibilidad de que los cables se desalojan al colocar el conejo en el sujetador o si se mueve durante el experimento (Figura 3B). Todos los electrodos se esteriliza con etanol al 70% antes de su colocación.
6. Coloque los plomos en el pecho posterior a las extremidades anteriores derecha e izquierda y en el abdomen anterior a la extremidad posterior izquierda. Coloque un electrodo de alfiler de tierra anterior a la extremidad posterior derecha en el abdomen (Figura 4A).
7. Una vez que todos los cables de ECG estén colocados correctamente, devuelva el conejo a una posición decúbito prono, con los cables corriendo por un lado del abdomen del conejo, y transfiera el conejo a un sujeción de tamaño adecuado (por ejemplo, 6 "x 18" x 6").  Al colocar el conejo en el sujeción, tire del cable suelto hacia arriba para minimizar que el conejo saque los electrodos con sus patas. Pegue los cables al lado del sujetador para que no sean atrapados debajo del conejo durante el experimento (Figura 4B).
8. Asegure el conejo en el sujeción bajando la sujeción alrededor del cuello y bloqueándolo en su lugar. Además, mueva las extremidades traseras hacia arriba debajo del animal y asegure la sujeción trasera.
   NOTA: Uno debe ser capaz de caber 1-2 dedos dentro del espacio debajo del cuello para asegurar que no es demasiado apretado. Particularmente durante los experimentos donde puede haber movimiento motor, es importante apretar la sujeción para minimizar el movimiento, las posibles lesiones espinales, la dislocación de las extremidades y la capacidad de eliminar la sujeción trasera (Figura 4B). Los conejos se han mantenido en el sujetador durante ~ 5 h sin ningún problema relacionado con el aumento del movimiento o signos de deshidratación.
   1. Para los conejos pequeños (por ejemplo, menos de 2 meses) coloque una almohadilla de refuerzo de goma debajo del animal para criar al conejo, lo que evita que el conejo descanse su cuello en la parte inferior del reposacabezas (Figura 4C).
      NOTA: Una caída repentina en el ritmo respiratorio y cardíaco puede ser secundaria al choque del cuello. Si esto ocurre, afloje el sujeción del cuello y levante la cabezadelconejo para aliviar cualquier compresión del cuello.
   2. Cuando la sujeción trasera no rastrea de cerca la espalda/columna vertebral del conejo, coloque un espaciador de PVC para evitar cualquier movimiento que pueda causar lesiones en la columna vertebral.
      NOTA: Por ejemplo, ~ 14 cm de largo x 4 "tubo de PVC de diámetro interior, con el 25-33% inferior eliminado se puede colocar sobre el conejo con espuma para proporcionar la restricción adecuada (Figura 4C).
9. Ahora que el conejo está colocado firmemente en el sujeción, inserte los electrodos de clavijas rectas subdérmicas de 7-13 mm en el cuero cabelludo (Figura 3A). Usando un enfoque de ángulo de entrada de 45°, ejecute los cables entre las orejas y ate los cables libremente al sujetador detrás de la cabeza para mantener la colocación del plomo. Coloque 5 cables de EEG en las siguientes posiciones: anterior derecho, anterior izquierdo, occipital derecho, occipital izquierdo y un cable de referencia central (Cz) en el punto entre los otros 4 cables (Figura 4D).
   NOTA: Los electrodos se colocan correctamente cuando se colocan en el tejido subcutáneo contra el cráneo. Esta colocación minimiza el artefacto de la nariz, las orejas y otros músculos circundantes. Algún artefacto del movimiento rítmico de la nariz es inevitable. Los cables de EEG anteriores deben colocarse medialmente a los ojosdelconejo y apuntarse anterior. Los cables occipitales deben colocarse antes de las orejas y apuntarán en la dirección medial. Cz se coloca en el centro de la parte superior de la cabeza en un punto que está entre los 4 electrodos (a medio camino entre Lambda y Bregma, a lo largo de la línea de sutura). El perno del electrodo Cz señala anterior.
   1. Pase los cables EEG entre las orejas, para evitar que el conejo intente morder los cables.
10. Conecte el pletismógrafo del oxímetro de pulso a la oreja del conejo sobre la vena marginal del oído.
    NOTA: Puede ser necesario afeitar el exceso de vello de la oreja para mejorar la señal o usar alguna gasa para mantener el sensor en su lugar.
    1. Asegúrese de que la frecuencia cardíaca en la pletismografía se correlacione con la frecuencia cardíaca del ECG y que se muestre la saturación de oxígeno (Figura 5C).
11. Coloque suavemente la mascarilla con tubos de capnografía sobre la boca y la nariz del conejo (Figura 4H). Asegure la mascarilla con una cuerda envuelta alrededor de la máscara y coloque ambos extremos de la cuerda al sujetador. Coloque el otro extremo del tubo de capnografía al monitor de signos vitales.
    NOTA: Es importante evitar que la cuerda se tenda sobre los ojos del conejo durante el experimento. Para hacer esto, pegue la cuerda en el centro del sujetador entre las orejas del conejo. Con el fin de mejorar la señal de capnografía, crear una válvula unidireccional utilizando cinta adhesiva y un trozo delgado de nitrilo que permitirá que el oxígeno entre en la pieza en T, y dirigirá el CO2 exhalado en el tubo de capnografía (Figura 4I).

3. Grabación de video-EEG-ECG

1. Realice la grabación video-EEG-ECG usando un software EEG disponible en el comercio.
   NOTA: Los cables biopotenciales y el video están bloqueados en el tiempo para correlacionar más tarde las señales eléctricas y de video (por ejemplo, pico de EEG con un tirón mioclónico).
2. Confirme una conectividad óptima, sin deriva de línea de base, sin ruido eléctrico de 60 Hz y una alta relación señal/ruido. Específicamente, asegúrese de que cada fase de la forma de onda cardiaca se pueda visualizar en el ECG y que el delta, el theta, y las ondas alfa no sean visualmente obscurecidos por el ruido de alta frecuencia en el EEG.
   1. Si todos los electrodos están produciendo cantidades excesivas de ruido, ajuste el plomo de referencia central. Si solo un electrodo es excesivamente ruidoso, empuje ese electrodo más profundamente en la piel o reposicionarlo hasta que no haya metal expuesto.
3. Ajuste el video para que todos los conejos puedan ser vistos simultáneamente, lo que permite la correlación de la actividad motora con los hallazgos de EEG (Figura 5A).
   NOTA: El sistema acomoda grabaciones simultáneas de EEG/ECG/oximetría/capnografía de hasta 7 conejos.
4. Iniciar el registro basal de cada animal durante un mínimo de 10-20 min o hasta que la frecuencia cardíaca se estabilice a un estado relajado y tranquilo (200-250 lpm) y los conejos no presenten grandes movimientos durante al menos 5 min. Adquiera datos electrográficos de ancho de banda completo sin filtros. Con el fin de visualizar mejor los datos, establezca el filtro de baja frecuencia (= filtro de paso alto) a 1 Hz y el filtro de alta frecuencia (= filtro de paso bajo) a 59 Hz.
   NOTA: Otra señal de que el conejo está relajado es la aparición de husillos de sueño EEG (discutidos más adelante).
5. Agregue notas con tiempo bloqueado durante el experimento en tiempo real para indicar el momento de las intervenciones (por ejemplo, administración de fármacos) y los eventos neuro-cardíacos (por ejemplo, pico de EEG, convulsiones motoras, latidos ectópicos y arritmias) y artefactos motores/investigadores.
   NOTA: Debido a la frecuencia con la que el investigador necesita aplicar una intervención (por ejemplo, estimulación fótica, administración de fármacos), para minimizar el estrés de un investigador que entra y sale de la habitación y abre/cierra la puerta, el investigador permanece en el lado opuesto de la habitación durante todo el experimento. El investigador se sienta lo más lejos posible del animal, y permanece quieto y en silencio para minimizar la posibilidad de perturbar a los animales.

4. Protocolos experimentales

NOTA: Cada uno de los siguientes experimentos se realizan en días separados si se realizan en el mismo animal. Hay un retraso de 2 semanas entre los estudios de fármacos compuestos de pruebas orales y el estudio de fármacos proconvulsivos terminales agudos. Cuando es necesario, se realiza el experimento de estimulación fótica, seguido de una espera de 30 minutos, y luego el estudio de fármacos PTZ.

1. Para permitir que los conejos se aclimaten en los sujetadores y para que el investigador confirme objetivamente la estabilización de las tasas cardiorrespiratorias, instrumente a todos los conejos con los sensores cardiorrespiratorios y neuronales y realice un monitoreo de video continuo durante > 1 hora, 1 - 3 veces por animal.
2. Experimento de estimulación fótica
   1. Además del método descrito anteriormente, coloque una fuente de luz con un reflector circular de 30 cm delante del conejo a la altura de los ojos, con la intensidad del flash establecida en el máximo (16 candela)^29. La fuente de luz se indica mediante un punto blanco en la Figura 4E.
      NOTA: Se debe utilizar una habitación poco iluminada para provocar la respuesta fotosensible³⁷.
   2. Como los ojosdelconejo están en el lado de la cabeza en lugar de la parte delantera de su cabeza (como en los humanos), coloque 2 espejos a cada lado del conejo, y 1 detrás del conejo para que la luz entre en los ojosdelconejo.
      NOTA: Un espejo plano que mide ≥ 20 cm de alto, ≥ 120 cm de largo crea un recinto triangular alrededor del conejo para asegurar que la luz parpadeante entre en los ojosdelconejo, como se ve en la Figura 4E.
   3. Conecte la fuente de luz a un controlador que tenga una velocidad, intensidad y duración ajustables.
   4. Grabe video usando una cámara con una luz roja y capacidades de grabación infrarroja.
   5. Exponer a los conejos a cada frecuencia durante 30 s con los ojos abiertos y luego otros 30 s con una máscara quirúrgica que cubre su cara para simular o causar el cierre del ojo en cada frecuencia.
      NOTA: Estudios anteriores han demostrado que el cierre ocular es la maniobra más provocativa para provocar fotosensibilidad a la convulsión²⁹. Además, el 10% de los pacientes fotosensibles sólo presentan signos electroencefalográficos mientras sus ojos están cerrados²⁹. Un asimiento se puede identificar clínico observando la presencia de tirones mioclónicos de la cabeza y del entero-cuerpo, clonus, o un estado tónico. La grabación de EEG se analiza más a fondo para la correlación electroencephalographic (e.g., puntos, poli-puntos, y descargas rítmicas) con las manifestaciones del motor para una diagnosis definitiva de la actividad de asimiento. Los movimientos en los cuales el EEG es obscurecido por el artefacto del músculo o las ondas del epileptogenicity indeterminante se deben repasar por un epileptologist para la confirmación.
   6. Aumente la frecuencia del estimulador fótico de 1 Hz a 25 Hz en incrementos de 2 Hz. A continuación, realice el mismo protocolo de fotoestimulación, pero esta vez disminuir la frecuencia de 60 Hz a 25 Hz en incrementos de 5 Hz.
      NOTA: Si un conejo tiene una convulsión, el experimento debe detenerse. Continúe monitoreando el conejo durante 30 min. A continuación, devolver el conejo a la sala de alojamiento y supervisar cada 1 h durante 3 h para la recuperación completa. Sin embargo, si la estimulación fótica induce una respuesta fotoparoxismal, entonces el resto de las frecuencias ascendentes se omiten y la serie se inicia de nuevo descendiendo desde 60 Hz hasta que se produce otra respuesta fotoparoxismal. Esto permitirá la determinación de los umbrales de estimulación fótica superior e inferior. No es necesario ningún retraso, ya que la respuesta fotoparoxismal cesará después de que se suspenda la estimulación fótica. Si no está claro si se ha producido una respuesta fotoparoxismal, la frecuencia se repite después de un retraso de 10 s³⁸.
   7. Después de que se complete el experimento, retire los cables de EEG y ECG del conejo y devuélvalo a su jaula doméstica para el cuidado de rutina por parte del personal de la cría.
3. Administración oral de medicamentos
   1. Como muchos medicamentos se toman por vía oral, prepare compuestos orales mezclándolos con salsa de manzana de grado alimenticio. Mezcle 0,3 mg/kg de E-4031 en 3 ml de salsa de manzana y cárguela en una jeringa oral/de riego de 3 ml sin aguja.
      NOTA: Varios medicamentos se pueden administrar de esta manera, incluyendo, compuestos de prueba, medicamentos que se sabe que alteran la duración del intervalo QT (moxifloxacina o E-4031), y un control negativo o vehículo. Algunos fármacos no están disponibles en una formulación intravenosa. Además, muchos medicamentos se prescriben en una formulación oral y, por lo tanto, una administración intravenosa puede tener menos relevancia clínica.
   2. Levante los labios superiores y deslice la punta de la jeringa oral en el lado de la bocadelconejo, que no está obstruido por los dientesdelconejo, e inyecte todo el medicamento y la salsa de manzana en la bocadelconejo.
   3. Continúe con la grabación de video-EEG-ECG durante 2 h y luego devuelva al animal a su jaula doméstica para el cuidado de rutina.
   4. En el día experimental 2 y 3, conecte el conejo al video-EEG-ECG, registre 10-20 minutos de la línea de fondo, después inyecte la misma medicación y registre para 2 h.
   5. Después de 1 semana de lavado, realice 10-20 minutos de la línea de fondo, y después dé a cada conejo una dosis sola del placebo por 3 días consecutivos y registre para 2 h.
      NOTA: La administración de medicamentos orales puede diseñarse como un estudio cruzado, en el que el placebo se administra durante la semana 1 y el medicamento en la semana 2.
4. Experimento de medicación intravenosa (Pentylenetetrazol, PTZ)
   1. Para visualizar la vena marginal de la oreja, afeite la superficie posterior de la orejadelconejo. Use una toallita de etanol al 70% para desinfectar el sitio y dilatar la vena marginal del oído. Esto se indica mediante el óvalo discontinuo negro en la Figura 4F.
   2. En este punto, haga que un experimentador cubra la caradelconejo con su mano para disminuir el estrés del procedimiento al conejo. Un segundo experimentador cannula cuidadosamente la vena marginal del oído con un angiocatheter estéril 25-G.
   3. Una vez que el catéter esté en la vena, coloque un tapón de inyección estéril en el extremo del catéter para que una aguja pueda introducir el medicamento por vía intravenosa. La ubicación del tapón de inyección se indica mediante un círculo azul en la Figura 4G.
   4. Haga una férula envolviendo una gasa de 4 x 4 pulgadas con cinta adhesiva para que forme una forma de tubo y colocándola dentrodela oreja del conejo. Luego pegue la férula a la oreja para que el catéter esté asegurado en su lugar y permanezca en posición vertical, similar a la oreja no cateterizada.
   5. Inyecte 1 mL de 10 unidades usp por mL de solución salina heparinizada.
      NOTA: El catéter y el vaso deben estar visiblemente despejados de aire y permanecer patentados. Si el catéter no está en el vaso, la jeringa no empujará fácilmente y habrá acumulación de solución salina en el tejido subcutáneo.
   6. Dé a los conejos dosis incrementales de PTZ por vía intravenosa de 1 mg/kg a 10 mg/kg en incrementos de 1 mg/kg cada 10 min. Tome nota al comienzo de cada dosis para indicar qué animal se está inyectando y la concentración del medicamento.
      NOTA: Esto permite evaluaciones de los efectos agudos y aditivos de la administración de PTZ. Alternativamente, para evaluar más a fondo los efectos crónicos de la dosis baja de PTZ, el conejo se da dosis repetidas en cada concentración de dosis baja, 7 dosis en 2 mg/kg, 3 dosis en 5 mg/kg, entonces 3 dosis en 10 mg/kg, cada dosis es separada por 10 minutos.
   7. Después de cada dosis, vigile cuidadosamente el video-EEG-ECG-capnography-oximetry para cualquier anormalidad eléctrica y respiratoria neuro-cardiaca y evidencia visual de la actividad epileptiforme. Tenga en cuenta estos cambios en tiempo real y durante el post-análisis.
      NOTA: La actividad convulsiva a menudo comienza dentro de los 60 s de la administración de PTZ.

5. Conclusión de experimentos de no supervivencia.

1. Si el conejo no experimentó muerte súbita durante el transcurso del experimento PTZ, administre 1 mL de 390 mg/mL de pentobarbital sódico por cada 4,54 kg de peso corporal (o 1,5 mL a todos los conejos), seguido de una descarga de 1 mL de solución salina normal. Monitoree el ECG para asegurarse de que el conejo sufre un paro cardíaco.
2. Una vez que el conejo experimenta un paro cardíaco, realice rápidamente una necropsia para aislar recientemente varios órganos, incluidos el corazón, los pulmones, el hígado, el cerebro, el músculo esquelético y cualquier otro tejido necesario para los análisis moleculares / bioquímicos posteriores.
3. Desechar el conejo de acuerdo con las políticas institucionales.

6. Análisis del ECG

1. Utilice el software de análisis de ECG disponible en el mercado para inspeccionar visualmente el ECG e identificar períodos de taquicardia, bradicardia, latidos ectópicos y otras arritmias (Figura 6). Para reducir la cantidad de datos a revisar, cree un tacograma, que aumentará la facilidad con la que se pueden identificar períodos de taquicardia, bradicardia o irregularidades del intervalo RR.
   NOTA: Las anomalías del ECG (por ejemplo, prolongación del intervalo QT_c) y las arritmias se identifican manualmente mediante la revisión del ECG para determinar si hay anomalías en la tasa (p. ej., arritmias brady/taqui-arritmias), el ritmo (p. ej., complejos auriculares/ventriculares prematuros), la conducción (p. ej., el bloqueo atriorculoventricular) y la forma de onda (por ejemplo, taquicardia auricular/ventricular no sinusal y fibrilación). Las arritmias se pueden detectar revisando el tacograma para detectar irregularidades en el intervalo RR. La taquicardia se puede identificar por secciones del tacograma en las que la frecuencia cardíaca está por encima de 300 latidos por minuto. La bradicardia se identifica cuando la frecuencia cardíaca es inferior a 120 latidos por minuto en el tacograma.
2. Utilizando el software de análisis de ECG disponible en el mercado, realice mediciones estándar de ECG (frecuencia cardíaca, intervalos del ciclo cardíaco) al inicio y tras la provocación (por ejemplo, el investigador manipulando el animal, la administración de agentes de prueba y los cambios de ECG inducidos por convulsiones).

7. Análisis de video-EEG

1. Desplácese visualmente por el vídeo y el trazado de EEG utilizando software disponible comercialmente para identificar la señal de referencia (Figura 7) y la presencia de descargas de EEG esperadas, como husillos de sueño (Figura 8) y ondas de vértice (Figura 9).
   NOTA: Aunque los datos electrográficos de ancho de banda completo se adquieren sin ningún filtro, los datos deben mostrarse con el filtro de baja frecuencia (es decir, filtro de paso alto) establecido en 1 Hz, y basado en el teoremadeNyquist, el filtro de alta frecuencia (es decir, filtro de paso bajo) se establece en 120 Hz para evitar perder cualquier señal. Los filtros se pueden ajustar para permitir una mejor visualización y reducción de ruido (por ejemplo, 1-59 Hz) al revisar la actividad de EEG de frecuencia más baja (<25 Hz).
2. Además de las formas de onda de capnografía, utilice el artefacto de movimiento de la nariz en el EEG para determinar la presencia frente a la ausencia de respiración. Esto también se puede correlacionar con los movimientos de la nariz que se ven en la grabación de video.
3. Desplácese visualmente por el video y el rastreo de EEG utilizando software disponible comercialmente para distinguir los movimientos epilépticos frente a los no epilépticos (por ejemplo, conscientes) durante al menos 1 minuto después de cada dosis de PTZ(Figura 10). Explora para las descargas epilépticas interictales y para los cambios de EEG antes, durante, y después de asimientos. Un asimiento se puede identificar clínico observando la presencia de tirones mioclónicos de la cabeza y del entero-cuerpo, clonus, o un estado tónico con un correlativo de EEG. Los cambios de EEG pueden incluir los puntos de EEG, los poli-puntos, y las descargas rítmicas.
   NOTA: Los movimientos en los cuales el EEG es obscurecido por el artefacto del músculo o las ondas del epileptogenicity indeterminante se deben repasar por un neurólogo para la confirmación. Puede ser ventajoso enfocar el video en un conejo para ver su comportamiento, así como sus grabaciones de EEG y ECG, más de cerca (Figura 5B).
4. Puntuar el video-EEG para las convulsiones en función del tipo y la gravedad de las manifestaciones motoras, que normalmente ocurren dentro de 1 minuto después de la inyección de PTZ (Tabla 1).
5. Después de un experimento de estimulación fótica, analice los cables occipitales del EEG para detectar la presencia y ausencia del ritmo de conducción occipital mediante la creación de una gráfica de análisis espectral en el software de análisis de EEG disponible en el mercado. El ritmo de conducción occipital creará un pico en el análisis espectral que corresponde a la frecuencia del estimulador fótico (Figura 11).
   NOTA: La estimulación fótica puede producir picos de frecuencia armónicos además del pico de la frecuencia fundamental.

7. Análisis de la función respiratoria

1. Revise la salida del monitor de signos vitales (Figura 4I) y exporte la señal para un análisis posterior.
2. Tenga en cuenta el cambio en el patrón respiratorio durante una convulsión y después de una convulsión, especialmente el punto de tiempo cuando comienza la apnea.

Resultados

El método descrito anteriormente es capaz de detectar anomalías en el sistema de conducción eléctrica del cerebro y el corazón, así como alteraciones respiratorias. Se utiliza un software de adquisición de datos para evaluar la morfología del ECG y detectar cualquier frecuencia cardíaca anormal, alteraciones de la conducción o ritmos de ECG (latidos ectópicos auriculares/ventriculares y arritmias brady/taqui) (Figura 6). Además de visualizar la mo...

Discusión

Esta configuración experimental facilita grabaciones y análisis detallados de video-EEG-ECG-oximetría-capnografía simultánea en conejos, particularmente en modelos de enfermedades cardíacas y /o neuronales. Los resultados de este artículo demuestran que este método es capaz de detectar asimientos y arritmias y de distinguirlos de artefactos electrográficos. Los resultados esperados fueron obtenidos al dar a conejos un proconvulsivo, que indujo asimientos. Los datos obtenidos de las grabaciones video-EEG podían ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP - Flexible Container	PFIZER (HOSPIRA)	7983-09	Dilutant
10cc Luer Lock syringe with 20G x 1" Needle	Sur-Vet	SS-10L2025	Used as a flush after drug injection
4x4 gauze sponges	Fisher Scientific	22-415-469	Rolled in a tube to splint ear with angiocatheter
Apple Sauce	Kirkland	897971	Vehicle for oral medications
Computer	Dell	Optiplex 5040	Acquisition computer
E-4031	Tocris	1808	Agent known to prolong the QT interval
ECG Electrode	RhythmLink	RLSND116-2.5	13mm 35-degree bent (0.4 mm diameter) subdermal pin electrodes
EEG Electrode	RhythmLink	RLSP513	5-twist 13mm straight (0.4mm diameter) subdermal pin electrodes
EEGLAB (2020)	Swartz Center for Computational Neuroscience	Open Access	Can perform spectral analysis of EEG
Ethernet-to-ethernet adapter	Linksys	USB3G16	Adapter for connecting the camera to the computer
Euthanasia-III Solution	Med-Pharmex	ANADA 200-280	Contains pentobarbital sodium and phenytoin sodium, controlled substance
Foam padding	Generic	N/A	Reduces pressure applied to the neck of small rabbits by the restrainer in order to prevent the adverse cardiorespiratory effects of neck compression
Heparin Lock Flush	Medline	EMZ50051240	To maintain patency of angiocatheter
IR Light	Bosch	EX12LED-3BD-8W	Facilitates recordings in the dark
LabChart Pro (2019, Version 8.1.16)	ADInstruments	N/A	ECG Analysis
JELCO PROTECTIV Safety I.V. Catheters, 25 gauge	Smiths Medical	3060	Used to catherize marginal ear vein
MATLAB (R2019b, Update 5)	MathWorks	N/A	Required to run EEGLAB
Microphone	Sony Stereo	ECM-D570P	Recording of audible manifestions of seizures
Micropore Medical Tape, Paper, White	3M	1530-1	Used to secure wires and create ear splint
Natus NeuroWorks	Natus	LC101-8	Acquisition and review software
Pentylenetetrazol (1 - 10 mg/kg always in 1mL volume)	Sigma-Aldrich	88580	Dilutions prepared in saline
Photic Stimulator	Grass	PS22	Stimulator to control frequency, delay, duration, intensity of the light pulses
Plastic wire organizer / bundler	12Vwire.com	LM-12-100-BLK	Bundle wires to cut down on noise
PS 22 Photic Stimulator	Grass Instruments	BZA641035	Strobe light with adjustable flash frequency, delay, and intensity
PVC pipe	Generic	N/A	Prevents small rabbits from kicking their hind legs and causing spinal injury
Quantum Amplifier	Natus	13926	Amplifier / digitizer
Quantum HeadBox Amplifier	Natus	22134	64-pin breakout box
Rabbit Restrainer	Plas-Labs	501-TC	Various size rabbit restrainers are available. 6" x 18" x 6" in this study.
Rubber pad (booster)	Generic	N/A	Raises small rabbits up in the restrainer to prevent neck compression
SpO2 ear clip	NONIN	61000	PureSAT/SpO2
SpO2 sensor adapter	NONIN	13931	XPOD PureSAT/SpO2
SRG-X120 1080p PTZ Camera with HDMI, IP & 3G-SDI Output	Sony	SRG-X120	Impela Camera
Terumo Sur-Vet Tuberculin Syringe 1cc 25G X 5/8" Regular Luer	Sur-Vet	13882	Used to inject intravenous medications
Veterinary Injection Plug Luer Lock	Sur-Vet	SRIP2V	Injection plug for inserting the needle for intravenous medication
Webcol Alcohol Prep, Sterile, Large, 2-ply	Covidien	5110	To prepare ear vein before catheterization