Surveillance multi-systèmes pour l’identification des crises, des arythmies et de l’apnée chez les lapins retenus conscients

Résumé

Utilisant le vidéo-EEG-ECG-oximetry-capnography simultané, nous avons développé une méthodologie pour évaluer la susceptibilité des modèles de lapin pour développer des arythmies et des saisies provoquées. Ce nouveau système d’enregistrement établit une plate-forme pour tester l’efficacité et l’innocuité des traitements et peut capturer la cascade complexe d’événements multi-systèmes qui culminent dans la mort subite.

Résumé

Les patients atteints de channelopathies ioniques sont à haut risque de développer des convulsions et des arythmies cardiaques mortelles. Il y a une prévalence plus élevée de maladies cardiaques et d’arythmies chez les personnes atteintes d’épilepsie (c.-à-d. cœur épileptique). En plus, des perturbations cardiaques et autonomes ont été rapportées entourant des saisies. 1:1.000 patients d’épilepsie/année meurent de la mort inattendue soudaine dans l’épilepsie (SUDEP). Les mécanismes du SUDEP restent mal compris. Les électroencéphalogrammes (EEG) et les électrocardiogrammes (ECG) sont deux techniques couramment utilisées dans le cadre clinique pour détecter et étudier les substrats/déclencheurs pour des saisies et des arythmies. Bien que de nombreuses études et descriptions de cette méthodologie soient chez les rongeurs, leur activité électrique cardiaque diffère considérablement de celle des humains. Cet article fournit une description d’une méthode non envahissante pour enregistrer le vidéo-EEG-ECG-oximetry-capnography simultané dans les lapins conscients. Comme la fonction électrique cardiaque est similaire chez le lapin et l’homme, le lapin fournit un excellent modèle d’études diagnostiques et thérapeutiques translationnelles. En plus de décrire la méthodologie pour l’acquisition de données, nous discutons les approches analytiques pour examiner la fonction électrique neuro-cardiaque et la pathologie chez les lapins. Ceci inclut la détection d’arythmie, l’analyse spectrale d’EEG et une échelle de saisie développée pour les lapins retenus.

Introduction

L’électrocardiographie (ECG) est systématiquement utilisée dans le cadre clinique pour évaluer la dynamique de la conduction électrique cardiaque et le processus d’activation-récupération électrique. L’ECG est important pour détecter, localiser, et évaluer le risque d’arythmies, d’ischémie, et d’infarctus. Typiquement, des électrodes sont fixées à la poitrine, aux bras, et aux jambes du patient afin de fournir une vue tridimensionnelle du coeur. Une déviation positive est produite lorsque la direction de la dépolarisation myocardique est vers l’électrode et une déviation négative est produite lorsque la direction de la dépolarisation myocardique est éloignée de l’électrode. Les composants électrographiques du cycle cardiaque incluent la dépolarisation auriculaire (onde P), la conduction auriculaire-ventriculaire (intervalle P-R), l’excitation ventriculaire (complexe QRS), et la repolarisation ventriculaire (onde T). Il existe de grandes similitudes dans l’ECG et les mesures potentielles d’action chez de nombreux mammifères, y compris les humains, les lapins, les chiens, les cobayes, les porcs, les chèvres et les chevaux^1,2,3.

Les lapins sont un modèle idéal pour la recherche translationnelle cardiaque. Le cœur de lapin est similaire au cœur humain en termes de composition du canal ionique, et de propriétés potentielles d’action^2,4,5. Les lapins ont été utilisés pour la génération de modèles génétiques, acquis et induits par des médicaments de maladies cardiaques^2,4,6,7,8. Il existe de grandes similitudes dans l’ECG cardiaque et la réponse potentielle d’action aux médicaments chez l’homme et le lapin^7,10,11.

La fréquence cardiaque et le processus d’activation-récupération électrique cardiaque sont très différents chez les rongeurs, par rapport aux lapins, aux humains et à d’autres grands mammifères^12,13,14. Le cœur des rongeurs bat ~ 10 fois plus vite que les humains. En revanche, au segment ST iso-électrique chez les ÉC humains et les lapins, il n’y a pas de segment ST chez les rongeurs^14,15,16. En outre, les rongeurs ont une forme d’onde QRS-r ' avec une onde T inversée^14,15,16. Les mesures de l’intervalle QT sont très différentes chez les rongeurs par rapport aux humains et aux lapins^14,15,16. En outre, les valeurs normales d’ECG sont très différentes chez l’homme par rapport aux rongeurs^12,15,16. Ces différences dans les formes d’onde ECG peuvent être attribuées à des différences dans la morphologie du potentiel d’action et les canaux ioniques qui entraînent la repolarisation cardiaque^9,14. Alors que le courant transitoire de potassium vers l’extérieur est le courant de repolarisation majeur dans la morphologie potentielle d’action cardiaque courte (non dôme) chez les rongeurs, chez les humains et les lapins, il existe un grand dôme de phase 2 sur le potentiel d’action, et les courants de potassium redresseurs retardés (I_Kr et I_Ks)sont les principaux courants de repolarisation chez l’homme et le lapin^4,9,13,17. Il est important de faire remarquer que l’expression de I_Kr et I_Ks est absente/minime chez les rongeurs, et en raison de la cinétique d’activation temporelle de I_Kr et I_Ks, elle n’a pas de rôle dans la morphologie potentielle d’action cardiaque^9,13. Ainsi, les lapins fournissent un modèle plus translationnel pour évaluer les mécanismes des anomalies et des arythmies induites par les médicaments, acquises et héréditaires^{de l’ECG 4,7,13.} Ensuite, comme de nombreuses études ont montré la présence d’anomalies électriques neuronales et cardiaques dans les maladies cardiaques primaires (Syndrome du QT long^18,19,20)ou neuronales (épilepsie^21,22,23,24), il est important d’étudier les mécanismes sous-jacents dans un modèle animal qui reproduit étroitement la physiologie humaine. Bien que les rongeurs puissent suffire à modéliser le cerveau humain, les rongeurs ne sont pas un modèle idéal de la physiologie cardiaque humaine⁷.

L’électroencéphalographie (EEG) utilise des électrodes, généralement placées sur le cuir chevelu ou intracrânienne, pour enregistrer la fonction électrique corticale. Ces électrodes peuvent détecter des changements dans la vitesse de tir et la synchronicité de groupes de neurones pyramidaux proches dans le cortex cérébral²⁵. Cette information peut être utilisée pour évaluer la fonction cérébrale et l’état éveillé/de sommeil. De plus, les EEG sont utiles pour localiser l’activité épileptiforme et distinguer les crises d’épilepsie des événements non épileptiques (p. ex. activité non épileptiforme psychogène et événements cardiogéniques). Afin de diagnostiquer le type d’épilepsie, provoquant des facteurs, et l’origine de la saisie, des patients d’épilepsie sont soumis à de diverses manoeuvres qui peuvent apporter une saisie. Diverses méthodes incluent l’hyperventilation, la stimulation photique, et la privation de sommeil. Ce protocole démontre l’utilisation de la stimulation photique pour induire des aberrations et des convulsions d’EEG chez les lapins^26,27,28,29.

Des enregistrements vidéo-EEG-ECG simultanés ont été largement utilisés chez l’homme et les rongeurs pour évaluer l’activité comportementale, neuronale et cardiaque pendant les états pré-ictal, ictal et post-ictal^30. Alors que plusieurs études ont mené des enregistrements EEG et ECG séparément chez les lapins^4,31,32,33,un système d’acquisition et d’analyse simultanée de vidéo-EEG-ECG chez le lapin retenu conscient n’est pas bien établi³⁴. Cet article décrit la conception et la mise en œuvre d’un protocole qui peut enregistrer des données simultanées de vidéo-EEG-ECG - capnography-oxymétrie chez les lapins conscients afin d’évaluer la fonction électrique et respiratoire neuro-cardiaque. Les résultats recueillis à partir de cette méthode peuvent indiquer la susceptibilité, les déclencheurs, la dynamique et la concordance entre les arythmies, les convulsions, les troubles respiratoires et les manifestations physiques. Un avantage de notre système expérimental est que nous acquérons des enregistrements conscients sans avoir besoin d’un sédatif. Les lapins restent dans les contentions pendant ≥5 h, avec un mouvement minimal. Comme les anesthésiques perturbent la fonction neuronale, cardiaque, respiratoire et autonome, les enregistrements pendant l’état conscient fournissent les données les plus physiologiques.

Ce système d’enregistrement peut en fin de compte fournir des informations détaillées pour faire progresser la compréhension des mécanismes neurologiques, cardiaques et respiratoires de la mort subite inattendue dans l’épilepsie (SUDEP). En plus de la surveillance neurologique et cardiaque ci-dessus, des preuves récentes ont également soutenu le rôle de l’insuffisance respiratoire comme contribution potentielle à la mort subite après une crise^35,36. Pour surveiller l’état respiratoire des lapins, l’oxymétrie et la capnographie ont été mises en œuvre pour évaluer l’état du système respiratoire avant, pendant et après une crise. Le protocole présenté ici a été conçu dans le but d’évaluer le seuil pour pharmacologiquement et photic-stimulus a induit des saisies de lapin. Ce protocole peut détecter des anomalies subtiles d’EEG et d’ECG qui peuvent ne pas avoir comme conséquence des manifestations physiques. En outre, cette méthode peut être utilisée pour l’innocuité cardiaque et les tests d’efficacité anti-arythmique de nouveaux médicaments et dispositifs.

Protocole

Toutes les expériences ont été menées conformément aux directives des National Institutes of Health (NIH) et au Upstate Medical University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). En outre, un aperçu de ce protocole est fourni à la figure 1.

1. Préparation de l’appareil de contrôle

1. Connectez l’ordinateur à un amplificateur avec une boîte de tête à 64 broches.
   REMARQUE: Chaque animal a quatre électrodes sous-cutanées droites de goupille du cuir chevelu (7 ou 13 mm) pour les EEG des 4 quadrants de la tête, 3 électrodes de broche thoracique sous-cutanées pliées (13 mm, angle de 35°) pourl’ECG(triangle d ' Einthoven), 1 électrode de masse de broche sous-cutanée pliante sur la jambe droite, et 1 électrode de goupille sous-cutanée droite du cuir chevelu au centre de la tête sert de référence.
2. Pour faire de chaque 8^e broche sur la headbox une référence, mettez à jour les paramètres du logiciel d’acquisition, onglet acquisition, de sorte que l’électrode de référence soit "Indépendante" (c’est-à-dire en mode recherche).
   REMARQUE: Cela permet d’enregistrer jusqu’à 7 animaux simultanément, chacun avec 7 électrodes plus une électrode de référence dédiée et une électrode de masse, le tout via un amplificateur, un numériseur et un ordinateur. Toutes les électrodes sont acquises en tant que canaux unipolaires et comparées à la référence (centre de la tête.) Des configurations/montages de plomb bipolaires et augmentés supplémentaires peuvent être configurés pendant ou après l’enregistrement. Comme la configuration a la capacité d’enregistrer simultanément à partir de plusieurs animaux, une électrode de masse de chaque animal est connectée en parallèle à l’entrée de masse sur l’amplificateur(Figure 2).
3. Retirez les lapins de leur cage et pesez-les pour calculer la dose de médicament appropriée pour chaque animal. Placez les lapins dans un transporteur et amenez-les dans une pièce séparée afin de minimiser le stress pour les animaux non expérimentaux. Dans cette étude, des lapins blancs de Nouvelle-Zélande mâles et femelles et leur progéniture ultérieure ont été utilisés. Des expériences ont été réalisées sur des lapins > 1 mois. Au moment de l’expérience, ces lapins pesaient entre 0,47 et 5,00 kg.
   REMARQUE: Étant donné que les lapins doivent être dans la même pièce et en vue de la caméra, n’isolez pas complètement les lapins. Il existe un risque de manifestations visuelles et auditives d’un lapin stressant un autre lapin. Par conséquent, il est idéal d’avoir un lapin dans la pièce à la fois, ce qui est fait pour les expériences de stimulation photique. Pour toutes les autres expériences, les lapins sont espacés autant que possible, tout en les gardant tous sous la vue de la caméra vidéo. Idéalement, des barrières sont utilisées ou un seul animal est étudié à la fois. Ce n’était pas un facteur de confusion majeur car la fréquence cardiaquedes lapins est restée assez stable pendant les expériences et il y avait la présence fréquente de fuseaux de sommeil. Les enregistrements de plusieurs animaux garantissent simultanément que les données sur les animaux témoins et d’essai sont acquises dans les mêmes conditions environnementales.

2. Implantation d’électrodes EEG-ECG et fixation de moniteurs respiratoires

1. Retirez un lapin du transporteur et placez-le sur les genoux d’un enquêteur assis.
2. Tenez le lapin verticalement et gardez-le près du corpsde l’enquêteur.
3. Abaissez le lapin en décubitus dorsal, avec la têtedulapin aux genoux del’enquêteur,et la têtedulapin plus bas que le reste de son corps.
   REMARQUE: Cette manœuvre détend l’animal et minimise la probabilité qu’il essaie de se déplacer ou de s’échapper tout en plaçant les électrodes.
4. Maintenant que le lapin est fixé en décubitus dorsal, demandez à un deuxième investigateur de répandre la fourrure jusqu’à ce que la peau puisse être identifiée et isolée du tissu sous-jacent.
5. Insérer des électrodes pliée à 35° par voie subdermique dans chaque aisselle(figure 3A).
   REMARQUE: Les électrodes doivent être poussées à travers de sorte qu’elles soient solidement accrochées à la peau, mais ne pénètrent pas dans des structures plus profondes. Le fait que l’électrode entre puis sorte de la peau (à travers et à travers) réduit le risque que les fils se délogent lors du placement du lapin dans le dispositif de retenue ou s’il se déplace pendant l’expérience(figure 3B). Toutes les électrodes sont stérilisé avec de l’éthanol à 70% avant la mise en place.
6. Placer les fils sur la poitrine postérieure aux membres antérieurs droit et gauche et sur l’abdomen antérieur au membre postérieur gauche. Placer une électrode à goupille de masse antérieure au membre postérieur droit sur l’abdomen(figure 4A).
7. Une fois que tous les fils d’ECG sont correctement placés, ramenez le lapin en position couchée, les fils s’élevant d’un côté de l’abdomen du lapin, et transférez le lapin dans un dispositif de retenue de taille appropriée (p. ex. 6 po x 18 po x 6 po).  Lorsque vous placez le lapin dans le dispositif de retenue, tirez le fil lâche vers le haut pour empêcher le lapin de retirer les électrodes avec ses pattes. Collez les fils sur le côté du dispositif de retenue afin qu’ils ne soient pas pris sous le lapin pendant l’expérience(figure 4B).
8. Fixez le lapin dans le dispositif de retenue en abaissant le dispositif de retenue autour du cou et en le verrouillant en place. De plus, déplacez les membres postérieurs sous l’animal et fixez le dispositif de retenue arrière.
   REMARQUE: On devrait être capable d’installer 1-2 doigts dans l’espace sous le cou pour s’assurer qu’il n’est pas trop serré. En particulier lors d’expériences où il peut y avoir un mouvement moteur, il est important de resserrer la retenue pour minimiser les mouvements, les blessures potentielles à la colonne vertébrale, la luxation des membres et la capacité de chasser le dispositif de retenue arrière(figure 4B). Les lapins ont été maintenus dans le dispositif de retenue pendant environ 5 h sans aucun problème lié à un mouvement accru ou à des signes de déshydratation.
   1. Pour les petits lapins (p. ex., moins de 2 mois), placez un tampon d’appoint en caoutchouc sous l’animal pour élever le lapin, ce qui empêche le lapin de reposer son cou sur le bas de l’appuie-tête(figure 4C).
      REMARQUE: Une baisse soudaine de la fréquence respiratoire et cardiaque peut être secondaire à l’impact du cou. Si cela se produit, desserrez le dispositif de retenue du cou et soulevez la têtedulapin pour soulager toute compression du cou.
   2. Lorsque le dispositif de retenue arrière ne trace pas de près le dos ou la colonne vertébrale du lapin, placez une entretoise en PVC pour empêcher tout mouvement qui pourrait causer des lésions de la colonne vertébrale.
      REMARQUE: Par exemple, un tuyau en PVC d’environ 14 cm de long x 4 po de diamètre intérieur, avec les 25 à 33 % inférieurs enlevés, peut être placé sur le lapin avec de la mousse pour fournir une retenue appropriée(figure 4C).
9. Maintenant que le lapin est solidement placé dans le dispositif de retenue, insérez les électrodes droites sous-cutanées de 7 à 13 mm dans le cuir chevelu(figure 3A). En utilisant une approche d’angle d’entrée de 45°, exécutez les fils entre les oreilles et attachez lâchement les fils au dispositif de retenue derrière la tête pour maintenir le placement du plomb. Placez 5 pistes EEG dans les positions suivantes : antérieure droite, antérieure gauche, occipitale droite, occipitale gauche et une piste de référence centrale (Cz) au point entre les 4 autres pistes(figure 4D).
   REMARQUE: Les électrodes sont correctement placées lorsqu’elles sont positionnées dans le tissu sous-cutané contre le crâne. Ce placement minimise l’artefact du nez, des oreilles et d’autres muscles environnants. Certains artefacts du mouvement rythmique du nez sont inévitables. Les fils EEG antérieurs doivent être placés médial sur les yeux du lapin et pointés versl’avant. Les fils occipitaux doivent être placés antérieurement aux oreilles et pointeront dans la direction médiale. Cz est placé au centre du haut de la tête en un point qui se trouve entre les 4 électrodes (à mi-chemin entre Lambda et Bregma, le long de la ligne de suture). La broche de l’électrode Cz pointe vers l’avant.
   1. Passez les fils EEG entre les oreilles, pour éviter que le lapin n’essaie de mordre les fils.
10. Fixez le pléthysmographe de l’oxymètre de pouls à l’oreille du lapin sur la veine marginale de l’oreille.
    REMARQUE: Il peut être nécessaire de raser l’excès de cheveux de l’oreille pour améliorer le signal ou d’utiliser de la gaze pour maintenir le capteur en place.
    1. Assurez-vous que la fréquence cardiaque sur la pléthysmographie est en corrélation avec la fréquence cardiaque de l’ECG et que la saturation en oxygène est affichée(Figure 5C).
11. Placez délicatement le masque facial avec un tube de capnographie sur la bouche et le nez du lapin (Figure 4H). Fixez le masque facial avec une ficelle enroulée autour du masque et fixez les deux extrémités de la ficelle au dispositif de retenue. Fixez l’autre extrémité du tube de capnographie au moniteur des signes vitaux.
    REMARQUE: Il est important d’empêcher la ficelle de poser sur les yeux du lapin pendant l’expérience. Pour ce faire, collez la ficelle au milieu du dispositif de retenue entre les oreilles du lapin. Afin d’améliorer le signal de capnographie, créez une vanne à sens unique à l’aide de ruban adhésif et d’un mince morceau de nitrile qui permettra à l’oxygène de pénétrer dans la pièce en T et dirigera le CO2 expiré dans le tube de capnographie(figure 4I).

3. Enregistrement de la vidéo-EEG-ECG

1. Effectuez un enregistrement vidéo-EEG-ECG à l’aide d’un logiciel EEG disponible dans le commerce.
   REMARQUE: Les fils biopotentiels et la vidéo sont verrouillés dans le temps pour corréler plus tard les signaux électriques et vidéo (par exemple, le pic EEG avec une secousse myoclonique).
2. Confirmez une connectivité optimale, sans dérive de base, sans bruit électrique de 60 Hz et avec un rapport signal/bruit élevé. Plus précisément, assurez-vous que chaque phase de la forme d’onde cardiaque peut être visualisée sur l’ECG et que les ondes delta, thêta et alpha ne sont pas visuellement obscurcies par le bruit à haute fréquence sur l’EEG.
   1. Si toutes les électrodes produisent des quantités excessives de bruit, ajustez le fil de référence central. Si une seule électrode est excessivement bruyante, poussez cette électrode plus profondément dans la peau ou repositionnez-la jusqu’à ce qu’il n’y ait pas de métal exposé.
3. Ajustez la vidéo afin que tous les lapins puissent être vus simultanément, ce qui permet la corrélation de l’activité motrice avec les résultats de l’EEG (Figure 5A).
   REMARQUE: Le système prend en charge les enregistrements simultanés EEG / ECG / oxymétrie / capnographie de jusqu’à 7 lapins.
4. Commencez l’enregistrement de base de chaque animal pendant un minimum de 10-20 min ou jusqu’à ce que la fréquence cardiaque se stabilise à un état calme et détendu (200-250 bpm) et que les lapins ne présentent pas de grands mouvements pendant au moins 5 min. Acquérir des données électrographiques à bande passante complète sans aucun filtre. Afin de mieux visualiser les données, définissez le filtre basse fréquence (= filtre passe-haut) à 1 Hz et le filtre haute fréquence (= filtre passe-bas) à 59 Hz.
   REMARQUE: Un autre signe que le lapin est détendu est l’apparition des fuseaux de sommeil EEG (discuté plus tard).
5. Ajouter des notes verrouillées pendant l’expérience en temps réel pour indiquer le moment des interventions (p. ex. administration de médicaments) et des événements neuro-cardiaques (p. ex. pic d’EEG, convulsions motrices, battements ectopiques et arythmies), ainsi que des artefacts moteurs/investigateurs.
   NOTA : En raison de la fréquence à laquelle l’investigateur doit appliquer une intervention (p. ex. stimulation photique, administration de médicaments), afin de minimiser le stress d’un investigateur entrant et sortant de la pièce et ouvrant/fermant la porte, l’investigateur reste du côté opposé de la pièce tout au long de l’expérience. L’enquêteur s’assoit le plus loin possible de l’animal et reste immobile et silencieux afin de minimiser les risques de dérangement des animaux.

4. Protocoles expérimentaux

REMARQUE : Chacune des expériences suivantes est effectuée à des jours distincts si elle est effectuée sur le même animal. Il y a un délai de 2 semaines entre les études de médicaments composés de tests oraux et l’étude de médicaments proconvulsants terminaux aigus. Si nécessaire, l’expérience de stimulation photique est réalisée, suivie d’une attente de 30 minutes, puis de l’étude du médicament PTZ.

1. Pour permettre aux lapins de s’acclimater dans les soigneurs et pour que l’investigateur confirme objectivement la stabilisation des taux cardiorespiratoires, instrumentez tous les lapins avec les capteurs cardiorespiratoires et neuronaux et effectuez une surveillance vidéo continue pendant > 1 heure, 1 à 3 fois par animal.
2. Expérience de stimulation photique
   1. En plus de la méthode décrite ci-dessus, placez une source lumineuse avec un réflecteur circulaire de 30 cm devant le lapin au niveau des yeux, avec l’intensité du flash réglée au maximum (16 candela)²⁹. La source lumineuse est indiquée par un point blanc à la figure 4E.
      REMARQUE: Une pièce faiblement éclairée doit être utilisée pour obtenir la réponse photosensible³⁷.
   2. Comme les yeuxdulapin sont sur le côté de la tête au lieu de l’avant de sa tête (comme chezl’homme),placez 2 miroirs de chaque côté du lapin, et 1 derrière le lapin afin que la lumière pénètre dans les yeux du lapin.
      REMARQUE: Un miroir plat de ≥ 20 cm de haut,d'≥120 cm de long crée une enceinte triangulaire autour du lapin pour s’assurer que la lumière clignotante pénètre dans les yeux du lapin, comme on le voit à la figure 4E.
   3. Connectez la source lumineuse à un contrôleur qui a une vitesse, une intensité et une durée réglables.
   4. Enregistrez des vidéos à l’aide d’une caméra avec une lumière rouge et des capacités d’enregistrement infrarouge.
   5. Exposer les lapins à chaque fréquence pendant 30 s avec leurs yeux ouverts, puis 30 s de plus avec un masque chirurgical couvrant leur visage pour simuler ou provoquer la fermeture des yeux à chaque fréquence.
      REMARQUE: Des études antérieures ont montré que la fermeture des yeux est la manœuvre la plus provocante pour obtenir la photosensibilité à la saisie^29. De plus, 10% des patients photosensibles ne présentent que des signes électroencéphalographiques alors que leurs yeux sont fermés²⁹. Une saisie peut être identifiée médicalement en observant la présence des secousses myocloniques de tête et de corps entier, du clonus, ou d’un état tonique. L’enregistrement d’EEG est plus complètement analysé pour la corrélation electroencephalographic (par exemple, pointes, poly-pointes, et décharges rythmiques) avec des manifestations de moteur pour un diagnostic définitif d’activité de saisie. Des mouvements dans lesquels l’EEG est obscurci par l’objet façonné de muscle ou les vagues de l’epileptogenicity indéterminant devraient être passés en revue par un épileptologue pour la confirmation.
   6. Augmentez la fréquence du stimulateur photique de 1 Hz à 25 Hz par incréments de 2 Hz. Ensuite, effectuez le même protocole de photostimulation, mais diminuez cette fois la fréquence de 60 Hz à 25 Hz par incréments de 5 Hz.
      REMARQUE: Si un lapin a une crise, l’expérience doit être arrêtée. Continuez à surveiller le lapin pendant 30 min. Ensuite, retournez le lapin dans la salle de logement et surveillez toutes les 1 h pendant 3 h pour une récupération complète. Cependant, si la stimulation photique induit une réponse photoparoxysmale, alors le reste des fréquences ascendantes sont sautées et la série est recommencée en descendant de 60 Hz jusqu’à ce qu’une autre réponse photoparoxysmale se produise. Cela permettra de déterminer les seuils supérieurs et inférieurs de stimulation photique. Aucun délai n’est nécessaire car la réponse photoparoxysmale cessera après l’arrêt de la stimulation photique. S’il n’est pas clair si une réponse photoparoxystique s’est produite, la fréquence est répétée après un retard de 10 s³⁸.
   7. Une fois l’expérience terminée, retirez les fils eEG et ECG du lapin et retournez-le dans sa cage d’origine pour des soins de routine par le personnel d’élevage.
3. Administration orale de médicaments
   1. Comme de nombreux médicaments sont pris par voie orale, préparez des composés oraux en les mélangeant avec de la sauce aux pommes de qualité alimentaire. Mélanger 0,3 mg/kg d’E-4031 dans 3 mL de sauce aux pommes et charger dans une seringue orale/d’irrigation de 3 mL sans aiguille.
      REMARQUE: Plusieurs médicaments peuvent être administrés de cette manière, y compris les composés d’essai, les médicaments connus pour modifier la durée du QT (moxifloxacine ou E-4031), et un témoin ou un véhicule négatif. Certains médicaments ne sont pas disponibles dans une formulation intraveineuse. De plus, de nombreux médicaments sont prescrits dans une formulation orale et, par conséquent, une administration intraveineuse peut avoir moins de pertinence clinique.
   2. Soulevez les lèvres supérieures et glissez le bout de la seringue buccale sur le côté de la bouche du lapin, quin’estpas obstrué par les dents du lapin, et injectez tous les médicaments et la sauce aux pommes dans la bouchedulapin.
   3. Continuez l’enregistrement vidéo-EEG-ECG pendant 2 h, puis retournez l’animal dans sa cage d’origine pour des soins de routine.
   4. Le jour expérimental 2 et 3, connectez le lapin à la vidéo-EEG-ECG, enregistrez 10-20 minutes de ligne de base, puis injectez le même médicament et enregistrez pendant 2 h.
   5. Après 1 semaine d’affouillement, effectuez 10-20 minutes de ligne de base, puis donnez à chaque lapin une dose unique de placebo pendant 3 jours consécutifs et enregistrez pendant 2 h.
      REMARQUE : L’administration de médicaments oraux peut être conçue comme une étude croisée, dans laquelle le placebo est administré au cours de la semaine 1 et le médicament au cours de la semaine 2.
4. Expérience médicamenteuse intraveineuse (Pentylenetetrazol, PTZ)
   1. Afin de visualiser la veine marginale de l’oreille, rasez la surface postérieure del’oreilledu lapin. Utilisez une lingette à l’éthanol à 70 % pour désinfecter le site et dilater la veine marginale de l’oreille. Ceci est indiqué par l’ovale pointillé noir de la figure 4F.
   2. À ce stade, demandez à un expérimentateurdecouvrir le visage du lapin avec sa main afin de diminuer le stress de la procédure pour le lapin. Un deuxième expérimentateur canule soigneusement la veine marginale d’oreille avec un angiocathéter stérile de 25 G.
   3. Une fois que le cathéter est dans la veine, placez un bouchon d’injection stérile à l’extrémité du cathéter afin qu’une aiguille puisse introduire des médicaments par voie intraveineuse. L’emplacement du bouchon d’injection est indiqué par un cercle bleu sur la figure 4G.
   4. Faites une attelle en enveloppant de la gaze de 4 x 4 pouces avec du ruban adhésif afin qu’elle forme une forme de tube et en la plaçant à l’intérieur del’oreilledu lapin. Ensuite, collez l’attelle sur l’oreille afin que le cathéter soit fixé en place et reste debout, comme l’oreille non cathétérisée.
   5. Injecter 1 mL de 10 unités USP par mL de solution saline héparinisée.
      REMARQUE: Le cathéter et le vaisseau doivent être visiblement débr omgés de l’air et rester brevetés. Si le cathéter n’est pas dans le vaisseau, la seringue ne poussera pas facilement et il y aura une accumulation de solution saline dans le tissu sous-cutané.
   6. Donnez aux lapins des doses supplémentaires de PTZ par voie intraveineuse de 1 mg/kg à 10 mg/kg par incréments de 1 mg/kg toutes les 10 minutes. Prenez note au début de chaque dose pour indiquer quel animal est injecté et la concentration du médicament.
      NOTA : Cela permet d’évaluer les effets aigus et additifs de l’administration de PTZ. Alternativement, pour évaluer davantage les effets chroniques de la faible dose de PTZ, le lapin reçoit des doses répétées à chaque faible concentration, 7 doses à 2 mg/kg, 3 doses à 5 mg/kg, puis 3 doses à 10 mg/kg, chaque dose est séparée par 10 min.
   7. Après chaque dose, surveillez attentivement la vidéo-EEG-ECG-capnographie-oxymétrie pour toute anomalie électrique et respiratoire neuro-cardiaque et preuve visuelle de l’activité épileptiforme. Notez ces changements en temps réel et pendant la post-analyse.
      REMARQUE: L’activité de saisie commence souvent dans les 60 s suivant l’administration de PTZ.

5.Conclusion des expériences de non-survie.

1. Si le lapin n’a pas connu de mort subite au cours de l’expérience PTZ, administrer 1 ml de 390 mg/mL de pentobarbital de sodium pour chaque 4,54 kg de poids corporel (ou 1,5 mL à tous les lapins), suivi d’une chasse d’eau saline normale de 1 mL. Surveillez l’ECG pour vous assurer que le lapin subit un arrêt cardiaque.
2. Une fois que le lapin subit un arrêt cardiaque, effectuez rapidement une nécropsie pour isoler fraîchement divers organes, y compris le cœur, les poumons, le foie, le cerveau, le muscle squelettique et tout autre tissu nécessaire aux analyses moléculaires / biochimiques ultérieures.
3. Disposer du lapin selon les politiques institutionnelles.

6. Analyse de l’ECG

1. Utiliser un logiciel d’analyse d’ECG disponible dans le commerce pour inspecter visuellement l’ECG et pour identifier les périodes de tachycardie, de bradycardie, de battements ectopiques et d’autres arythmies (Figure 6). Pour réduire la quantité de données à examiner, créez un tachygraphe, qui augmentera la facilité avec laquelle les périodes de tachycardie, de bradycardie ou d’irrégularités de l’intervalle RR peuvent être identifiées.
   REMARQUE : Les anomalies de l’ECG (p. ex., prolongation de l’intervalle QT_c) et les arythmies sont identifiées manuellement en examinant l’ECG pour les anomalies du taux (p. ex., brady-/tachy-arythmies), du rythme (p. ex., complexes auriculaires/ventriculaires prématurés), de la conduction (p. ex., bloc atrio-ventriculaire) et de la forme d’onde (p. ex., tachycardie auriculaire/ventriculaire non sinusale et fibrillation).) Les arythmies peuvent être détectées en examinant le tachygraphe pour des irrégularités dans l’intervalle RR. La tachycardie peut être identifiée par des sections du tachygraphe dans lesquelles la fréquence cardiaque est supérieure à 300 battements par minute. La bradycardie est identifiée lorsque la fréquence cardiaque est inférieure à 120 battements par minute sur le tachygraphe.
2. À l’aide d’un logiciel d’analyse d’ECG disponible dans le commerce, effectuer des mesures d’ECG standard (fréquence cardiaque, intervalles de cycle cardiaque) au départ et lors de la provocation (p. ex. manipulation de l’animal par l’enquêteur, administration d’agents d’essai et changements d’ECG induits par les crises).

7. Analyse de la vidéo-EEG

1. Faites défiler visuellement la vidéo et le traçage EEG à l’aide d’un logiciel disponible dans le commerce pour identifier le signal de base(Figure 7)et la présence de décharges EEG attendues telles que des fuseaux de sommeil(Figure 8)et des ondes de sommet(Figure 9).
   REMARQUE: Bien que les données électrographiques à bande passante complète soient acquises sans aucun filtre, les données doivent être affichées avec le filtre basse fréquence (c’est-à-dire le filtre passe-haut) réglé à 1 Hz, et basé sur le théorèmedeNyquist, le filtre haute fréquence (c’est-à-dire le filtre passe-bas) est réglé à 120 Hz pour éviter de manquer tout signal. Les filtres peuvent être ajustés pour permettre une meilleure visualisation et une meilleure réduction du bruit (p. ex., 1-59 Hz) lors de l’examen de l’activité EEG de fréquence inférieure (<25 Hz).
2. En plus des formes d’onde de capnographie, utilisez l’artefact de mouvement du nez sur l’EEG pour déterminer la présence par rapport à l’absence de respiration. Cela peut également être corrélé avec les mouvements du nez vus sur l’enregistrement vidéo.
3. Faites défiler visuellement la vidéo et le traçage EEG à l’aide d’un logiciel disponible dans le commerce pour distinguer les mouvements épileptiques des mouvements non épileptiques (p. ex. conscients) pendant au moins 1 minute après chaque dose de PTZ(figure 10). Scan pour les décharges épileptiques interictal et pour des changements d’EEG avant, pendant, et après des saisies. Une saisie peut être identifiée médicalement en observant la présence des secousses myocloniques de tête et de corps entier, du clonus, ou d’un état tonique avec un corrélat d’EEG. Les changements d’EEG peuvent inclure des pointes d’EEG, des poly-pointes, et des décharges rythmiques.
   REMARQUE: Les mouvements dans lesquels l’EEG est obscurci par l’artefact de muscle ou les vagues de l’epileptogenicity indéterminant devraient être passés en revue par un neurologue pour confirmation. Il peut être avantageux de concentrer la vidéo sur un lapin pour voir de plus près son comportement, ainsi que ses enregistrements EEG et ECG (Figure 5B).
4. Noter le video-EEG pour les crises en fonction du type et de la gravité des manifestations motrices, qui se produisent généralement dans les 1 min suivant l’injection de PTZ(tableau 1).
5. Après une expérience de stimulation photique, analyser les fils occipitaux de l’EEG pour la présence et l’absence du rythme de conduite occipital en créant un tracé d’analyse spectrale dans le logiciel d’analyse EEG disponible dans le commerce. Le rythme de conduite occipital va créer un pic dans l’analyse spectrale qui correspond à la fréquence du stimulateur photique (Figure 11).
   REMARQUE: La stimulation photique peut produire des pics de fréquence harmonique en plus du pic de la fréquence fondamentale.

7. Analyse de la fonction respiratoire

1. Passez en revue les résultats du moniteur des signes vitaux (Figure 4I) et exportez le signal pour une analyse plus approfondie.
2. Notez le changement de schéma respiratoire pendant une crise et après une crise, en particulier le point de temps où l’apnée commence.

Résultats

La méthode décrite ci-dessus est capable de détecter des anomalies dans le système de conduction électrique du cerveau et du cœur ainsi que des troubles respiratoires. Un logiciel d’acquisition de données est utilisé pour évaluer la morphologie de l’ECG et détecter toute fréquence cardiaque anormale, perturbation de conduction ou rythmes de l’ECG (battements ectopiques auriculaires/ventriculaires et arythmies brady/tachy) (Figure 6). En plus ...

Discussion

Cette configuration expérimentale facilite les enregistrements et analyses vidéo-EEG-ECG-oxymétrie-capnographie simultanés détaillés chez le lapin, en particulier dans les modèles de maladies cardiaques et/ou neuronales. Les résultats de cet article montrent que cette méthode est capable de détecter des saisies et des arythmies et de les différencier des objets façonné électrographiques. Les résultats attendus ont été obtenus en donnant aux lapins un proconvulsivant, ce qui a induit des convulsions. Les ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP - Flexible Container	PFIZER (HOSPIRA)	7983-09	Dilutant
10cc Luer Lock syringe with 20G x 1" Needle	Sur-Vet	SS-10L2025	Used as a flush after drug injection
4x4 gauze sponges	Fisher Scientific	22-415-469	Rolled in a tube to splint ear with angiocatheter
Apple Sauce	Kirkland	897971	Vehicle for oral medications
Computer	Dell	Optiplex 5040	Acquisition computer
E-4031	Tocris	1808	Agent known to prolong the QT interval
ECG Electrode	RhythmLink	RLSND116-2.5	13mm 35-degree bent (0.4 mm diameter) subdermal pin electrodes
EEG Electrode	RhythmLink	RLSP513	5-twist 13mm straight (0.4mm diameter) subdermal pin electrodes
EEGLAB (2020)	Swartz Center for Computational Neuroscience	Open Access	Can perform spectral analysis of EEG
Ethernet-to-ethernet adapter	Linksys	USB3G16	Adapter for connecting the camera to the computer
Euthanasia-III Solution	Med-Pharmex	ANADA 200-280	Contains pentobarbital sodium and phenytoin sodium, controlled substance
Foam padding	Generic	N/A	Reduces pressure applied to the neck of small rabbits by the restrainer in order to prevent the adverse cardiorespiratory effects of neck compression
Heparin Lock Flush	Medline	EMZ50051240	To maintain patency of angiocatheter
IR Light	Bosch	EX12LED-3BD-8W	Facilitates recordings in the dark
LabChart Pro (2019, Version 8.1.16)	ADInstruments	N/A	ECG Analysis
JELCO PROTECTIV Safety I.V. Catheters, 25 gauge	Smiths Medical	3060	Used to catherize marginal ear vein
MATLAB (R2019b, Update 5)	MathWorks	N/A	Required to run EEGLAB
Microphone	Sony Stereo	ECM-D570P	Recording of audible manifestions of seizures
Micropore Medical Tape, Paper, White	3M	1530-1	Used to secure wires and create ear splint
Natus NeuroWorks	Natus	LC101-8	Acquisition and review software
Pentylenetetrazol (1 - 10 mg/kg always in 1mL volume)	Sigma-Aldrich	88580	Dilutions prepared in saline
Photic Stimulator	Grass	PS22	Stimulator to control frequency, delay, duration, intensity of the light pulses
Plastic wire organizer / bundler	12Vwire.com	LM-12-100-BLK	Bundle wires to cut down on noise
PS 22 Photic Stimulator	Grass Instruments	BZA641035	Strobe light with adjustable flash frequency, delay, and intensity
PVC pipe	Generic	N/A	Prevents small rabbits from kicking their hind legs and causing spinal injury
Quantum Amplifier	Natus	13926	Amplifier / digitizer
Quantum HeadBox Amplifier	Natus	22134	64-pin breakout box
Rabbit Restrainer	Plas-Labs	501-TC	Various size rabbit restrainers are available. 6" x 18" x 6" in this study.
Rubber pad (booster)	Generic	N/A	Raises small rabbits up in the restrainer to prevent neck compression
SpO2 ear clip	NONIN	61000	PureSAT/SpO2
SpO2 sensor adapter	NONIN	13931	XPOD PureSAT/SpO2
SRG-X120 1080p PTZ Camera with HDMI, IP & 3G-SDI Output	Sony	SRG-X120	Impela Camera
Terumo Sur-Vet Tuberculin Syringe 1cc 25G X 5/8" Regular Luer	Sur-Vet	13882	Used to inject intravenous medications
Veterinary Injection Plug Luer Lock	Sur-Vet	SRIP2V	Injection plug for inserting the needle for intravenous medication
Webcol Alcohol Prep, Sterile, Large, 2-ply	Covidien	5110	To prepare ear vein before catheterization