Monitoramento multissuso para identificação de convulsões, arritmias e apneia em coelhos conscientes contidos

Resumo

Utilizando vídeo simultâneo EEG-ECG-oximetria-capnografia, desenvolvemos uma metodologia para avaliar a suscetibilidade de modelos de coelhos para desenvolver arritmias provocadas e convulsões. Este novo sistema de gravação estabelece uma plataforma para testar a eficácia e a segurança da terapêutica e pode capturar a complexa cascata de eventos multi-sistemas que culminam em morte súbita.

Resumo

Pacientes com canalopatias de íons têm alto risco de desenvolver convulsões e arritmias cardíacas fatais. Há maior prevalência de doenças cardíacas e arritmias em pessoas com epilepsia (ou seja, coração epiléptico.) Além disso, distúrbios cardíacos e autônomos foram relatados em torno de convulsões. 1:1.000 pacientes com epilepsia/ano morrem de morte inesperada súbita na epilepsia (SUDEP). Os mecanismos para a SUDEP permanecem incompletamente compreendidos. Eletroencefalogramas (EEG) e eletrocardiogramas (ECG) são duas técnicas rotineiramente utilizadas no cenário clínico para detectar e estudar os substratos/gatilhos para convulsões e arritmias. Embora muitos estudos e descrições dessa metodologia estejam em roedores, sua atividade elétrica cardíaca difere significativamente dos humanos. Este artigo fornece uma descrição de um método não invasivo para gravação simultânea de vídeo-EEG-ECG-oximetria-capnografia em coelhos conscientes. Como a função elétrica cardíaca é semelhante em coelhos e humanos, os coelhos fornecem um excelente modelo de estudos diagnósticos e terapêuticos translacionais. Além de delinear a metodologia de aquisição de dados, discutimos as abordagens analíticas para o exame da função elétrica neuro-cardíaca e da patologia em coelhos. Isso inclui detecção de arritmia, análise espectral do EEG e uma escala de convulsão desenvolvida para coelhos contidos.

Introdução

A eletrocardiografia (ECG) é rotineiramente utilizada no cenário clínico para avaliar a dinâmica da condução elétrica cardíaca e o processo de ativação-recuperação elétrica. O ECG é importante para detectar, localizar e avaliar o risco de arritmias, isquemias e infartos. Normalmente, os eletrodos são afixados no peito, braços e pernas do paciente, a fim de fornecer uma visão tridimensional do coração. Uma deflexão positiva é produzida quando a direção da despolarização do miocárdio é para o eletrodo e uma deflexão negativa é produzida quando a direção da despolarização do miocárdio está longe do eletrodo. Os componentes eletrográficos do ciclo cardíaco incluem despolarização atrial (onda P), condução arrial-ventricular (intervalo P-R), excitação ventricular (complexo QRS) e repolarização ventricular (onda T). Há grandes semelhanças no ECG e medidas potenciais de ação em muitos mamíferos, incluindo humanos, coelhos, cães, cobaias, porcos, cabras e cavalos^1,2,3.

Coelhos são um modelo ideal para pesquisa translacional cardíaca. O coração do coelho é semelhante ao coração humano em termos de composição do canal de íons, e propriedades potenciais de ação^2,4,5. Coelhos têm sido usados para a geração de modelos genéticos, adquiridos e induzidos por drogas de doenças cardíacas^2,4,6,7,8. Há grandes semelhanças no ECG cardíaco e resposta potencial de ação a drogas em humanos e coelhos^7,10,11.

A frequência cardíaca e o processo de ativação elétrica cardíaca é muito diferente em roedores, em comparação com coelhos, humanos e outros mamíferos maiores^12,13,14. O coração de roedor bate ~10 vezes mais rápido que os humanos. Em contrapartida, para o segmento ISO-elétrico ST em ECGs humanos e coelhos, não há segmento ST em roedores^14,15,16. Além disso, os roedores têm uma forma de onda QRS-r com uma onda T invertida^14,15,16. As medições do intervalo QT são muito diferentes em roedores vs. humanos e coelhos^14,15,16. Além disso, os valores normais de ECG são muito diferentes em humanos vs. roedores^12,15,16. Essas diferenças nas formas de onda do ECG podem ser atribuídas a diferenças na morfologia potencial de ação e nos canais de íons que impulsionam a repolarização cardíaca^9,14. Enquanto a corrente transitória de potássio externo é a maior corrente de repolarização na morfologia potencial de ação cardíaca curta (não-cúpula) em roedores, em humanos e coelhos há uma grande cúpula fase-2 sobre o potencial de ação, e as correntes de potássio retificadora atrasadas (I_Kr e I_Ks) são as principais correntes repolarizantes em humanos e coelhos^4,9,13,17. É importante ressaltar que a expressão de I_Kr e I_Ks é ausente/mínima em roedores, e devido à ativação temporal cinética de I_Kr e I_Ks não tem um papel na ação cardíaca potencial morfologia^9,13. Assim, os coelhos fornecem um modelo mais translacional para avaliar os mecanismos de anormalidades e arritmias induzidas, adquiridas e herdadas de drogas^4,7,13. Em seguida, como inúmeros estudos têm mostrado a presença de anormalidades elétricas neuronais e cardíacas em doenças cardíacas primárias (Síndrome de QT Longo^18,19,20) ou doenças neuronais (epilepsia^21,22,23,24), é importante estudar os mecanismos subjacentes em um modelo animal que reproduz de perto a fisiologia humana. Embora os roedores possam ser suficientes para modelar o cérebro humano, os roedores não são um modelo ideal de fisiologia cardíaca humana⁷.

A eletroencefalografia (EEG) utiliza eletrodos, geralmente colocados no couro cabeludo ou intracranianamente, para registrar a função elétrica cortical. Estes eletrodos podem detectar alterações na taxa de disparo e sincronicidade de grupos de neurônios piramida próximos no córtex cerebral²⁵. Essas informações podem ser usadas para avaliar a função cerebral e o estado de despertar/sono. Além disso, os EEGs são úteis para localizar a atividade epiepiforme e distinguir convulsões epilépticas de eventos não epilépticos (por exemplo, atividade psicogênica não epiléptica e eventos cardiogênicos). Para diagnosticar o tipo de epilepsia, provocando fatores e a origem da convulsão, os pacientes com epilepsia são submetidos a diversas manobras que podem provocar uma convulsão. Vários métodos incluem hiperventilação, estimulação fótica e privação do sono. Este protocolo demonstra o uso de estimulação fótica para induzir aberrações e apreensões de EEG em coelhos^26,27,28,29.

Gravações simultâneas de vídeo-EEG-ECG têm sido amplamente utilizadas em humanos e roedores para avaliar a atividade comportamental, neuronal e cardíaca durante os estados pré-ictal, ictal e pós-ictal³⁰. Embora vários estudos tenham realizado gravações de EEG e ECG separadamente em coelhos^4,31,32,33, um sistema para aquisição e análise de vídeo simultâneo-EEG-ECG no coelho consciente contido não está bem estabelecido³⁴. Este artigo descreve o desenho e a implementação de um protocolo que pode gravar dados simultâneos de vídeo-EEG-ECG -capnografia-oximetria em coelhos conscientes, a fim de avaliar a função elétrica e respiratória neuro-cardíaca. Os resultados obtidos a partir deste método podem indicar a suscetibilidade, gatilhos, dinâmica e concordância entre arritmias, convulsões, distúrbios respiratórios e manifestações físicas. Uma vantagem do nosso sistema experimental é que adquirimos gravações conscientes sem a necessidade de um sedativo. Os coelhos permanecem nos contentores por ≥5 h, com movimento mínimo. Como anestésicos perturbam a função neuronal, cardíaca, respiratória e autônoma, as gravações durante o estado consciente fornecem os dados mais fisiológicos.

Este sistema de gravação pode, em última análise, fornecer insights detalhados para avançar na compreensão dos mecanismos neurológicos, cardíacos e respiratórios para morte súbita inesperada em epilepsia (SUDEP). Além do monitoramento neurológico e cardíaco acima, evidências recentes também apoiaram o papel da insuficiência respiratória como potencial contribuição para a morte súbita após uma convulsão^35,36. Para monitorar o estado respiratório dos coelhos, foram implementadas oximetria e capnografia para avaliar o estado do sistema respiratório antes, durante e depois de uma convulsão. O protocolo aqui apresentado foi concebido com o objetivo de avaliar o limiar para convulsões de coelhos induzidos por farmacologicamente e estímulos fóticos. Este protocolo pode detectar sutis anormalidades de EEG e ECG que podem não resultar em manifestações físicas. Além disso, este método pode ser usado para testes de segurança cardíaca e eficácia anti-arrítmica de novas drogas e dispositivos.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) e do Comitê de Uso e Uso Institucional de Animais (IACUC). Além disso, um esboço deste protocolo é fornecido na Figura 1.

1. Preparação de equipamentos de gravação

1. Conecte o computador a um amplificador com uma caixa de cabeça de 64 pinos.
   NOTA: Cada animal tem quatro eletrodos de pinos de couro cabeludo subdérmicos (7 ou 13 mm) para EEGs dos 4 quadrantes da cabeça, 3 eletrodos de pinos subdérmicos dobrados (ângulo de 13 mm, 35°) para ECG (triângulodeEinthoven), 1 eletrodo de pino subdérmico dobrado na perna direita e 1 eletrodo de couro cabeludo subdérmico reto no centro da cabeça serve como referência.
2. Para fazer de cada 8^pinos na caixa de entrada uma referência, atualize as configurações de software de aquisição, a guia de aquisição, de modo que o Eletrodo de Referência seja "Independente" (ou seja, modo de pesquisa).
   NOTA: Isso permite gravações de até 7 animais simultaneamente, cada um com 7 eletrodos mais um eletrodo de referência dedicado e um eletrodo de terra, tudo através de um amplificador, digitalizador e computador. Todos os eletrodos são adquiridos como canais unipolares e comparados com a referência (centro da cabeça.) Configurações/montagens adicionais de chumbo bipolar e aumentada podem ser configuradas durante ou após a gravação. Como a configuração tem a capacidade de gravar de vários animais simultaneamente, um eletrodo moído de cada animal é conectado em paralelo à entrada do solo no amplificador(Figura 2).
3. Remova coelhos de sua gaiola e pese-os para calcular a dose de droga apropriada para cada animal. Coloque os coelhos em um transportador e leve-os para uma sala separada, a fim de minimizar o estresse para animais não experimentais. Neste estudo, foram utilizados coelhos brancos da Nova Zelândia e seus descendentes subsequentes. Foram realizados experimentos em coelhos > de 1 mês de idade. No momento do experimento, esses coelhos pesavam entre 0,47 e 5,00 kg.
   NOTA: Como os coelhos precisam estar na mesma sala e, à vista da câmera, não isole completamente os coelhos. Há o potencial de manifestações visuais e auditivas de um coelho estressando outro coelho. Portanto, é ideal ter um coelho na sala de cada vez, o que é feito para os experimentos de estimulação fótica. Para todos os outros experimentos, os coelhos são espaçados o máximo possível, mantendo todos eles dentro da visão da câmera de vídeo. Idealmente, as barreiras são usadas ou apenas um animal é estudado por vez. Este não foi um grande confundimento, pois as frequências cardíacasdos coelhos permaneceram bastante estáveis durante os experimentos e houve a presença frequente de fusos de sono. Gravações de vários animais simultaneamente garantem que os dados de controle e teste de animais sejam adquiridos sob as mesmas condições ambientais.

2. Implantação de eletrodos EEG-ECG e anexação de monitores respiratórios

1. Remova um coelho do porta-transporte e coloque no colo de um investigador sentado.
2. Segure o coelho verticalmente e mantenha-o pertodocorpo do investigador.
3. Abaixe o coelho em uma posição supina, com a cabeçadocoelho nos joelhosdoinvestigador, e a cabeçadocoelho mais baixa que o resto de seu corpo.
   NOTA: Esta manobra relaxa o animal e minimiza a probabilidade de ele tentar se mover ou escapar enquanto coloca os eletrodos.
4. Agora que o coelho está preso em uma posição supina, peça a um segundo investigador para espalhar a pele até que a pele possa ser identificada e isolada do tecido subjacente.
5. Insira eletrodos dobrados de 35° subderme em cada axilla(Figura 3A).
   NOTA: Os eletrodos devem ser empurrados para que estejam firmemente ligados à pele, mas não penetrem em estruturas mais profundas. Ter o eletrodo entrar e sair da pele (através e através) reduz a chance de os leads serem desalojados ao colocar o coelho no conterr condutor ou se ele se move durante o experimento(Figura 3B). Todos os eletrodos são esterilizados com 70% de etanol antes da colocação.
6. Coloque as pistas no tórax posterior para a direita e membros dianteiros esquerdos e no abdômen anterior ao membro traseiro esquerdo. Coloque um pino-eletrodo de terra anterior ao membro traseiro direito no abdômen(Figura 4A).
7. Uma vez que todos os leads de ECG são devidamente colocados, devolva o coelho a uma posição propensa, com as pistas correndo por um lado do abdômen do coelho, e transfira o coelho para um conterrâneo de tamanho apropriado (por exemplo, 6" x 18" x 6").  Ao colocar o coelho no contento, puxe o fio solto para cima para minimizar o coelho de puxar os eletrodos com as pernas. Tape os fios para o lado do conterreiro para que eles não sejam pegos sob o coelho durante o experimento(Figura 4B).
8. Fixar o coelho no contenção baixando a contenção ao redor do pescoço e trancando-o no lugar. Além disso, mova os membros traseiros para cima sob o animal e proteja a contenção traseira.
   NOTA: Deve-se ser capaz de encaixar 1-2 dedos dentro do espaço sob o pescoço para garantir que não está muito apertado. Particularmente durante experimentos onde pode haver movimento motor, é importante apertar a contenção para minimizar o movimento, possíveis lesões na coluna vertebral, luxação do membro e a capacidade de chutar a contenção traseira(Figura 4B). Coelhos foram mantidos no contenção por ~5 h sem quaisquer problemas relacionados ao aumento do movimento ou sinais de desidratação.
   1. Para coelhos pequenos (por exemplo, menos de 2 meses) coloque uma almofada de reforço de borracha sob o animal para levantar o coelho, o que impede o coelho de descansar o pescoço na parte inferior da contenção da cabeça(Figura 4C).
      NOTA: Uma queda repentina na frequência respiratória e cardíaca pode ser secundária ao impacto do pescoço. Se isso ocorrer, solte o conterr mais do pescoço e levante a cabeçadocoelho para aliviar qualquer compressão do pescoço.
   2. Quando a contenção traseira não rastrear de perto a parte traseira/coluna do coelho, coloque um espaçador de PVC para evitar qualquer movimento que possa causar lesões na coluna vertebral.
      NOTA: Por exemplo, ~14 cm de comprimento x 4" tubo de PVC de diâmetro interno, com a parte inferior 25-33% removida pode ser colocado sobre o coelho com espuma para fornecer contenção adequada(Figura 4C).
9. Agora que o coelho está firmemente colocado no contento, insira os eletrodos subdérmicos de pinos retos de 7-13 mm no couro cabeludo(Figura 3A). Usando uma aproximação de ângulo de 45° de entrada, execute os fios entre as orelhas e amarre os fios ao conterr falante da cabeça para manter a colocação do chumbo. O EEG coloca 5 nas seguintes posições: anterior direito, anterior esquerdo, occipital direito, occipital esquerdo e uma referência central (Cz) no ponto entre as outras 4 pistas(Figura 4D).
   NOTA: Os eletrodos são colocados corretamente quando estão posicionados em tecido subcutâneo contra o crânio. Esta colocação minimiza o artefato do nariz, orelhas e outros músculos circundantes. Algum artefato do movimento rítmico do nariz é inevitável. As pistas anteriores do EEG devem ser colocadas medial aos olhosdocoelho e apontar anteriormente. As pistas occipitais devem ser colocadas anteriormente aos ouvidos e apontarão na direção medial. Cz é colocado no centro da parte superior da cabeça em um ponto que está entre todos os 4 eletrodos (meio caminho entre Lambda e Bregma, ao longo da linha de sutura). O pino do eletrodo Cz aponta anteriormente.
   1. Passe os fios EEG entre as orelhas, para evitar que o coelho tentando morder os fios.
10. Conecte o pletimógrafo do oxímetro de pulso à orelha do coelho sobre a veia marginal da orelha.
    NOTA: Pode ser necessário raspar o excesso de cabelo da orelha para melhorar o sinal ou usar alguma gaze para manter o sensor no lugar.
    1. Certifique-se de que a frequência cardíaca na plethysmografia se correlaciona com a frequência cardíaca do ECG e que a saturação de oxigênio seja exibida(Figura 5C).
11. Coloque suavemente a máscara facial com tubos de capnografia sobre a boca e o nariz do coelho(Figura 4H). Fixar a máscara facial com corda enrolada ao redor da máscara e anexar as duas extremidades da corda ao conterrâneo. Conecte a outra extremidade da tubulação de capnografia ao monitor de sinais vitais.
    NOTA: É importante evitar que a corda deita sobre os olhos do coelho durante o experimento. Para fazer isso, amarre a corda no meio do cabrheiro entre as orelhas do coelho. Para melhorar o sinal de capnografia, crie uma válvula unidirecional usando fita adesiva e um fino pedaço de nitrito que permitirá a entrada de oxigênio na peça T, e direcionará co2 expirado para a tubulação de capnografia(Figura 4I).

3. Gravação de vídeo-EEG-ECG

1. Execute a gravação de vídeo-EEG-ECG usando um software EEG comercialmente disponível.
   NOTA: Os leads e o vídeo biopotenciais são bloqueados para mais tarde correlacionar os sinais elétricos e de vídeo (por exemplo, espeto de EEG com um empurrão mioclônico).
2. Confirme a conectividade ideal, sem deriva de linha de base, sem ruído elétrico de 60 Hz e alta relação sinal-ruído. Especificamente, certifique-se de que cada fase da forma de onda cardíaca possa ser visualizada no ECG e que as ondas delta, e alfa não sejam obscurecidas visualmente pelo ruído de alta frequência no EEG.
   1. Se todos os eletrodos estiverem produzindo quantidades excessivas de ruído, ajuste o chumbo de referência central. Se apenas um eletrodo for excessivamente barulhento, então empurre esse eletrodo mais fundo na pele ou reposicione-o até que não haja metal exposto.
3. Ajuste o vídeo para que todos os coelhos possam ser vistos simultaneamente, o que permite a correlação da atividade motora com os achados de EEG(Figura 5A).
   NOTA: O sistema acomoda gravações simultâneas de EEG/ECG/oximetria/capnografia de até 7 coelhos.
4. Inicie a gravação da linha de base de cada animal por um mínimo de 10-20 min ou até que a frequência cardíaca se estabilize para um estado calmo e relaxado (200-250 bpm) e os coelhos não apresentam grandes movimentos por pelo menos 5 minutos. Adquira dados eletrográficos de largura de banda completa sem filtros. Para melhor visualizar os dados, defina o filtro de baixa frequência (=filtro de passagem alta) a 1 Hz e o filtro de alta frequência (=filtro de passagem baixa) a 59 Hz.
   NOTA: Outro sinal de que o coelho está relaxado é o aparecimento de fusos de sono EEG (discutidos posteriormente).
5. Adicione notas bloqueadas durante o experimento em tempo real para indicar o tempo de intervenções (por exemplo, entrega de drogas) e eventos neuro-cardíacos (por exemplo, pico de EEG, convulsões motoras, batida ectópica e arritmias) e artefatos motor/investigador.
   NOTA: Devido à frequência que o investigador precisa para aplicar uma intervenção (por exemplo, estimulação fótica, entrega de medicamentos), para minimizar o estresse de um investigador entrando e saindo da sala e abrindo/fechando a porta, o investigador permanece no lado oposto da sala durante todo o experimento. O investigador fica o mais longe possível do animal, e permanece quieto e quieto para minimizar potencialmente perturbando os animais.

4. Protocolos experimentais

NOTA: Cada um dos seguintes experimentos são realizados em dias separados se forem realizados no mesmo animal. Há um atraso de duas semanas entre os testes orais compostos estudos de drogas, e o estudo de drogas terminais agudas pró-convulsiva. Quando necessário, o experimento de estimulação fótica é realizado, seguido por uma espera de 30 minutos, e depois o estudo de drogas PTZ.

1. Para permitir que os coelhos se aclimatam nos contentores e que o pesquisador confirme objetivamente a estabilização das taxas cardiorrespiratórias, instrumentalize todos os coelhos com os sensores cardiorrespiratórios e neuronais e realize o monitoramento contínuo por > 1 hora, 1 - 3 vezes por animal.
2. Experimento de estimulação fótica
   1. Além do método descrito acima, coloque uma fonte de luz com um refletor circular de 30 cm na frente do coelho ao nível dos olhos, com a intensidade de flash definida ao máximo (16 candela)²⁹. A fonte de luz é indicada por um ponto branco na Figura 4E.
      NOTA: Uma sala mal iluminada deve ser usada para provocar a resposta fotossensível³⁷.
   2. Como os olhosdocoelho estão do lado da cabeça em vez da frente de sua cabeça (como em humanos), coloque 2 espelhos em ambos os lados do coelho, e um atrásdocoelho para que a luz entre nos olhos do coelho.
      NOTA: Um espelho plano que tem ≥ 20 cm de altura, por ≥ 120 cm de comprimento cria um gabinete triangular ao redor do coelho para garantir que a luz piscando entre nos olhosdocoelho, como visto na Figura 4E.
   3. Conecte a fonte de luz a um controlador que tenha uma taxa, intensidade e duração ajustáveis.
   4. Grave vídeo usando uma câmera com luz vermelha e capacidades de gravação infravermelha.
   5. Exponha os coelhos a cada frequência por 30 s com os olhos abertos e, em seguida, outros 30 s com uma máscara cirúrgica cobrindo seu rosto para simular ou causar fechamento ocular em cada frequência.
      NOTA: Estudos anteriores mostraram que o fechamento dos olhos é a manobra mais provocativa para provocar fotosensibilidade à convulsão²⁹. Além disso, 10% dos pacientes fotosensíveis só apresentam sinais eletroencefalográficos enquanto seus olhos estão fechados²⁹. Uma convulsão pode ser identificada clinicamente observando a presença de mioclônicos da cabeça e do corpo inteiro, clonus ou um estado tônico. O registro do EEG é mais aprofundado para correlação eletroencefalográfica (por exemplo, picos, poli-picos e descargas rítmicas) com manifestações motoras para um diagnóstico definitivo da atividade convulsiva. Os movimentos em que o EEG é obscurecido por artefato muscular ou ondas de epieptogenicidade indeterminante devem ser revistos por um epitético para confirmação.
   6. Aumente a frequência do estimulador fótico de 1 Hz para 25 Hz em incrementos de 2 Hz. Em seguida, realize o mesmo protocolo de foto-estimulação, mas desta vez diminua a frequência de 60 Hz para 25 Hz em incrementos de 5 Hz.
      NOTA: Se um coelho tiver uma convulsão, o experimento deve ser interrompido. Continue monitorando o coelho por 30 minutos. Em seguida, devolva o coelho para a sala de habitação e monitore a cada 1h por 3h para recuperação completa. No entanto, se a estimulação fótica induz uma resposta fotoparoxística, então o restante das frequências ascendentes são pulados e a série é iniciada novamente descendo de 60 Hz até que outra resposta fotoparoxística ocorra. Isso permitirá a determinação dos limiares de estimulação fótica superior e inferior. Não é necessário atraso, pois a resposta fotoparoxística cessará após a estimulação fótica ser interrompida. Se não está claro se ocorreu uma resposta fotoparoxissmal, a frequência é repetida após um atraso de 10 s³⁸.
   7. Após a conclusão do experimento, remova os condutores de EEG e ECG do coelho e devolva-os à sua gaiola doméstica para cuidados de rotina por parte da equipe de criação.
3. Administração oral de medicamentos
   1. Como muitas drogas são tomadas oralmente, prepare compostos orais misturando-se com molho de maçã de grau alimentar. Misture 0,3 mg/kg de E-4031 em 3 mL de molho de maçã e carregue em uma seringa oral/irrigação de 3 mL sem agulha.
      NOTA: Vários medicamentos podem ser administrados desta forma, incluindo, compostos de teste, drogas que são conhecidas por alterar a duração do QT (moxifloxacina ou E-4031), e um controle negativo ou veículo. Algumas drogas não estão disponíveis em uma formulação intravenosa. Além disso, muitos medicamentos são prescritos em uma formulação oral e, portanto, uma administração intravenosa pode ter menor relevância clínica.
   2. Levante os lábios superiores e deslize a ponta da seringa oral para o ladodaboca do coelho, que é desobstruída pelos dentesdocoelho, e injete toda a medicação e molho de maçã na bocadocoelho.
   3. Continue a gravação de vídeo-EEG-ECG por 2h e depois devolva o animal para sua gaiola doméstica para cuidados de rotina.
   4. Nos dias experimentais 2 e 3, conecte o coelho ao vídeo-EEG-ECG, grave 10-20 minutos de linha de base, depois injete a mesma medicação e grave por 2h.
   5. Após 1 semana de lavagem, realize 10-20 min de linha de base, e, em seguida, dar a cada coelho uma única dose de placebo por 3 dias consecutivos e recorde de 2h.
      NOTA: A administração de medicamentos orais pode ser projetada como um estudo crossover, no qual o placebo é dado durante a semana 1 e a medicação na semana 2.
4. Experimento de medicação intravenosa (Pentilenotrazol, PTZ)
   1. Para visualizar a veia marginal da orelha, raspe a superfície posteriordaorelha do coelho. Use uma limpeza de 70% de etanol para desinfetar o local e dilatar a veia marginal do ouvido. Isso é indicado pelo oval tracejado preto na Figura 4F.
   2. Neste ponto, um experimentador cubra o rostodocoelho com a mão, a fim de diminuir o estresse do procedimento para o coelho. Um segundo experimentador cuidadosamente cannula a veia auditiva marginal com um angiocateter 25 G estéril.
   3. Uma vez que o cateter esteja na veia, coloque um plugue de injeção estéril na extremidade do cateter para que uma agulha possa introduzir a medicação por via intravenosa. A localização do plugue de injeção é indicada por um círculo azul na Figura 4G.
   4. Faça uma tala embrulhando gaze de 4 x 4 polegadas com fita para formar uma forma de tubo e colocá-la dentrodaorelha do coelho. Em seguida, coloque a tala na orelha para que o cateter fique no lugar e permaneça ereto, semelhante ao ouvido não cateterizado.
   5. Injete 1 mL de 10 unidades usp por mL de soro fisiológico heparinizado.
      NOTA: O cateter e o vaso devem ser visivelmente limpos do ar e permanecer patenteados. Se o cateter não estiver no vaso, a seringa não empurrará facilmente e haverá acúmulo de soro fisiológico no tecido subcutâneo.
   6. Dê aos coelhos doses incrementais de PTZ por via intravenosa de 1 mg/kg a 10 mg/kg em incrementos de 1 mg/kg a cada 10 minutos. Anote no início de cada dose para indicar qual animal está sendo injetado e a concentração da medicação.
      NOTA: Isso permite avaliações dos efeitos agudos e aditivos da administração ptz. Alternativamente, para avaliar melhor os efeitos crônicos da baixa dose PTZ, o coelho recebe doses repetidas em cada baixa concentração de dose, 7 doses a 2 mg/kg, 3 doses a 5 mg/kg, depois 3 doses a 10 mg/kg, cada dose é separada por 10 minutos.
   7. Após cada dose, monitore cuidadosamente o vídeo-EEG-ECG-capnografia-oximetria para quaisquer anormalidades elétricas e respiratórias neuro-cardíacas e evidências visuais de atividade epileptiforme. Observe essas alterações em tempo real e durante a pós-análise.
      NOTA: A atividade de apreensão geralmente começa dentro dos 60 s da administração ptz.

5.Conclusão de Experimentos de Não Sobrevivência.

1. Se o coelho não experimentou morte súbita durante o experimento PTZ, administre 1mL de 390 mg/mL de pentobarbital de sódio para cada 4,54 kg de peso corporal (ou 1,5 mL para todos os coelhos), seguido por uma descarga de 1 mL de soro fisiológico normal. Monitore o ECG para garantir que o coelho sondo uma parada cardíaca.
2. Uma vez que o coelho experimenta parada cardíaca, realize rapidamente uma necropsia para isolar recentemente vários órgãos, incluindo coração, pulmões, fígado, cérebro, músculo esquelético e qualquer outro tecido necessário para análises moleculares/bioquímicas subsequentes.
3. Descarte o coelho de acordo com as políticas institucionais.

6. Análise do ECG

1. Use software de análise ECG comercialmente disponível para inspecionar visualmente o ECG e identificar períodos de taquicardia, bradicardia, batidas ectópicas e outras arritmias(Figura 6). Para reduzir a quantidade de dados para revisão, crie um tachograma, que aumentará a facilidade com que períodos de taquicardia, bradicardia ou irregularidades do intervalo RR podem ser identificados.
   NOTA: Anormalidades do ECG (por exemplo, prolongamento_{QT c)} e arritmias são identificadas manualmente pela revisão do ECG por anormalidades na taxa (por exemplo, brady-/táquia-arritmias), ritmo (por exemplo, complexos atrial/ventricular prematuros), condução (por exemplo, bloco atrio-ventricular) e forma de onda (por exemplo, taquicardia atrial/ventricular não-sinusal e fibrilação.) As arritmias podem ser detectadas revendo o tachograma por irregularidades no intervalo RR. A taquicardia pode ser identificada por seções do tachograma em que a frequência cardíaca está acima de 300 batimentos por minuto. Bradycardia é identificada quando a frequência cardíaca é inferior a 120 batidas por minuto no tachograma.
2. Utilizando software de análise ECG comercialmente disponível, realize medições padrão de ECG (frequência cardíaca, intervalos de ciclo cardíaco) na linha de base e mediante provocação (por exemplo, investigador manipulando o animal, administração de agentes de teste e alterações induzidas por convulsão do ECG).

7. Análise do vídeo-EEG

1. Role visualmente o rastreamento de vídeo e EEG usando software comercialmente disponível para identificar o sinal de linha de base (Figura 7) e a presença de descargas de EEG esperadas, como eixos de sono(Figura 8) e ondas de vértice(Figura 9).
   NOTA: Embora os dados eletrográficos de largura de banda completa sejam adquiridos sem filtros, os dados devem ser exibidos com o filtro de baixa frequência (ou seja, filtro de passagem alta) definido em 1 Hz, e com base no teoremadeNyquist, o filtro de alta frequência (ou seja, filtro de passagem baixa) é definido em 120 Hz para evitar a falta de qualquer sinal. Os filtros podem ser ajustados para permitir uma melhor visualização e redução de ruído (por exemplo, 1-59 Hz) ao revisar a atividade de EEG de menor frequência (<25 Hz).
2. Além das formas de onda de capnografia, use artefato de movimento do nariz no EEG para determinar a presença versus ausência de respiração. Isso também pode ser correlacionado com os movimentos do nariz vistos na gravação de vídeo.
3. Visualmente role através do vídeo e rastreamento EEG usando software comercialmente disponível para distinguir movimentos epilépticos vs. não epilépticos (por exemplo, conscientes) por pelo menos 1 min após cada dose de PTZ(Figura 10). Procure por descargas epilépticas intericais e para alterações de EEG antes, durante e depois das convulsões. Uma convulsão pode ser identificada clinicamente observando a presença de mioclônicos da cabeça e do corpo inteiro, clonus ou um estado tônico com uma correlação de EEG. As alterações do EEG podem incluir picos de EEG, polipes e descargas rítmicas.
   NOTA: Os movimentos em que o EEG é obscurecido por artefato muscular ou ondas de epieptogenicidade indeterminante devem ser revistos por um neurologista para confirmação. Pode ser vantajoso focar o vídeo em um coelho para ver seu comportamento, bem como suas gravações de EEG e ECG, mais de perto(Figura 5B).
4. Marque o vídeo-EEG para convulsões com base no tipo e gravidade das manifestações motoras, que normalmente ocorrem dentro de 1 minuto após a injeção de PTZ(Tabela 1).
5. Após um experimento de estimulação fótica, analise os leads occipitais do EEG para a presença e ausência do ritmo de condução occipital, criando um gráfico de análise espectral em software de análise EEG comercialmente disponível. O ritmo de condução occipital criará um pico na análise espectral que corresponde à frequência do estimulador fótico(Figura 11).
   NOTA: A estimulação fótica pode produzir picos de frequência harmônica, além do pico da frequência fundamental.

7. Análise da função respiratória

1. Revise a saída do monitor de sinais vitais(Figura 4I) e exporte o sinal para análise posterior.
2. Note a mudança no padrão respiratório durante uma convulsão e após uma convulsão, especialmente o ponto de tempo quando a apneia começa.

Resultados

O método descrito acima é capaz de detectar anormalidades no sistema de condução elétrica do cérebro e do coração, bem como distúrbios respiratórios. Um software de aquisição de dados é usado para avaliar a morfologia do ECG e detectar quaisquer frequências cardíacas anormais, distúrbios de condução ou ritmos ECG (batidas ectópicas atrial/ventriculares e brady-/tchy-arritmias)(Figura 6). Além de visualizar a morfologia do ECG, os traços s...

Discussão

Esta configuração experimental facilita gravações e análises simultâneas de vídeo e EEG-EEG-ECG-oximetria-capnografia em coelhos, particularmente em modelos de doenças cardíacas e/ou neuronais. Os resultados deste artigo mostram que este método é capaz de detectar convulsões e arritmias e diferenciá-las de artefatos eletrográficos. Os resultados esperados foram obtidos ao dar aos coelhos um provulsivo, o que induziu convulsões. Os dados obtidos a partir das gravações de vídeo-EEG puderam ser ainda mais ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP - Flexible Container	PFIZER (HOSPIRA)	7983-09	Dilutant
10cc Luer Lock syringe with 20G x 1" Needle	Sur-Vet	SS-10L2025	Used as a flush after drug injection
4x4 gauze sponges	Fisher Scientific	22-415-469	Rolled in a tube to splint ear with angiocatheter
Apple Sauce	Kirkland	897971	Vehicle for oral medications
Computer	Dell	Optiplex 5040	Acquisition computer
E-4031	Tocris	1808	Agent known to prolong the QT interval
ECG Electrode	RhythmLink	RLSND116-2.5	13mm 35-degree bent (0.4 mm diameter) subdermal pin electrodes
EEG Electrode	RhythmLink	RLSP513	5-twist 13mm straight (0.4mm diameter) subdermal pin electrodes
EEGLAB (2020)	Swartz Center for Computational Neuroscience	Open Access	Can perform spectral analysis of EEG
Ethernet-to-ethernet adapter	Linksys	USB3G16	Adapter for connecting the camera to the computer
Euthanasia-III Solution	Med-Pharmex	ANADA 200-280	Contains pentobarbital sodium and phenytoin sodium, controlled substance
Foam padding	Generic	N/A	Reduces pressure applied to the neck of small rabbits by the restrainer in order to prevent the adverse cardiorespiratory effects of neck compression
Heparin Lock Flush	Medline	EMZ50051240	To maintain patency of angiocatheter
IR Light	Bosch	EX12LED-3BD-8W	Facilitates recordings in the dark
LabChart Pro (2019, Version 8.1.16)	ADInstruments	N/A	ECG Analysis
JELCO PROTECTIV Safety I.V. Catheters, 25 gauge	Smiths Medical	3060	Used to catherize marginal ear vein
MATLAB (R2019b, Update 5)	MathWorks	N/A	Required to run EEGLAB
Microphone	Sony Stereo	ECM-D570P	Recording of audible manifestions of seizures
Micropore Medical Tape, Paper, White	3M	1530-1	Used to secure wires and create ear splint
Natus NeuroWorks	Natus	LC101-8	Acquisition and review software
Pentylenetetrazol (1 - 10 mg/kg always in 1mL volume)	Sigma-Aldrich	88580	Dilutions prepared in saline
Photic Stimulator	Grass	PS22	Stimulator to control frequency, delay, duration, intensity of the light pulses
Plastic wire organizer / bundler	12Vwire.com	LM-12-100-BLK	Bundle wires to cut down on noise
PS 22 Photic Stimulator	Grass Instruments	BZA641035	Strobe light with adjustable flash frequency, delay, and intensity
PVC pipe	Generic	N/A	Prevents small rabbits from kicking their hind legs and causing spinal injury
Quantum Amplifier	Natus	13926	Amplifier / digitizer
Quantum HeadBox Amplifier	Natus	22134	64-pin breakout box
Rabbit Restrainer	Plas-Labs	501-TC	Various size rabbit restrainers are available. 6" x 18" x 6" in this study.
Rubber pad (booster)	Generic	N/A	Raises small rabbits up in the restrainer to prevent neck compression
SpO2 ear clip	NONIN	61000	PureSAT/SpO2
SpO2 sensor adapter	NONIN	13931	XPOD PureSAT/SpO2
SRG-X120 1080p PTZ Camera with HDMI, IP & 3G-SDI Output	Sony	SRG-X120	Impela Camera
Terumo Sur-Vet Tuberculin Syringe 1cc 25G X 5/8" Regular Luer	Sur-Vet	13882	Used to inject intravenous medications
Veterinary Injection Plug Luer Lock	Sur-Vet	SRIP2V	Injection plug for inserting the needle for intravenous medication
Webcol Alcohol Prep, Sterile, Large, 2-ply	Covidien	5110	To prepare ear vein before catheterization