意識的に拘束されたウサギにおける発作、不整脈および無呼吸の識別のためのマルチシステムモニタリング

要約

同時ビデオ-EEG-ECG-オキシメトリー-カプノグラフィーを用いて、ウサギモデルの感受性を評価し、引き起こされた不整脈および発作を発症する方法論を開発した。この新しい記録システムは、治療薬の有効性と安全性をテストするプラットフォームを確立し、突然死に至るマルチシステムイベントの複雑なカスケードをキャプチャすることができます。

要約

イオンチャネル症の患者は、発作および致命的な心臓不整脈を発症する危険性が高い。てんかん患者(すなわちてんかんの心臓)には心臓病や不整脈の有病率が高い。さらに、発作を取り巻く心臓および自律神経障害が報告されている。1:1,000てんかん患者/年はてんかん(SUDEP)で突然の予期せぬ死で死亡する。SUDEP のメカニズムは、完全には理解されていません。脳波(EEG)と心電図(ECG)は、発作や不整脈の基質/トリガーを検出して研究するために臨床現場で日常的に使用される2つの技術です。この方法論の多くの研究と記述はげっ歯類にありますが、心臓の電気的活動は人間とは大きく異なります。この記事では、意識的なウサギの同時ビデオ-脳脳-EEG-ECG-オキシメトリーカポノグラフィーを記録するための非侵襲的な方法の説明を提供します。心臓の電気機能はウサギとヒトで類似しているので、ウサギは翻訳診断および治療研究の優れたモデルを提供する。データ収集の方法論を概説するほか、ウサギの神経心の電気機能や病理を調べる分析手法についても議論する。これには、不整脈検出、EEGのスペクトル分析、および抑制されたウサギのために開発された発作スケールが含まれます。

概要

心電図(ECG)は、心臓電気伝導のダイナミクスと電気活性化回復プロセスを評価するために臨床現場で日常的に使用されています。ECGは、不整脈、虚血、梗塞のリスクを検出、局所化、評価するために重要です。典型的には、電極は、心臓の立体的なビューを提供するために、患者の胸部、腕および脚に付設される。心筋脱分極の方向が電極に向かう場合に正の偏向が生じ、心筋脱分極の方向が電極から離れているときに負の偏向が生じる。心周期の電解成分には、心房脱分極(P波)、心房心室伝導(P-R間隔)、心室興奮(QRS複合体)、心室リポーラリゼーション(T波)が含まれる。ECGには、人間、ウサギ、イヌ、モルモット、ブタ、ヤギ、馬^1、2、3など、多くの哺乳類に対して、行動の可能性のある対策が大きく類似しています。

ウサギは心臓翻訳研究に理想的なモデルです。ウサギの心臓は、イオンチャネル組成の点で人間の心臓に似ており、作用電位特性^2、4、5。ウサギは、心臓病2、4、6、7、8の遺伝的、獲得、および薬物誘発モデルの生成に使用されてきた。心臓心電図と行動の薬物に対する反応の可能性は^{、人間7、10、11}に大きな類似点があります。

心拍数と心臓電気活性化回復プロセスは、ウサギ、ヒト、および他の大きな哺乳類^12、13、14と比較して、げっ歯類では非常に異なっています。げっ歯類の心臓は人間の10倍の速さで鼓動する。これに対し、ヒトおよびウサギのECGにおける等電動STセグメントに対して、げっ歯類^14、15、16にはSTセグメントはない。また、げっ歯類は、逆T波^14、15、16を持つQRS-r波形を有する。QT間隔の測定値は、げっ歯類と人間とウサギ^{の14、15、16}で非常に異な^{っています}。さらに、正常なECG値は、げっ歯類^12、15、16との人間で大きく異なる。心電図波形のこれらの違いは、心臓再^分極9,14を駆動する作用電位形態とイオンチャネルの違いに起因する可能性がある。一過性外向きカリウム電流はげっ歯類における短い(非ドーム)心行動電位形態の主要な再分極電流であるが、ヒトおよびウサギでは、作用電位に大きな相2ドームがあり、遅滞性整流カリウム電流(I_KrおよびI_Ks)はヒトおよびウサギ^4,17の主要な再分極電流である。重要なことに、I_KrおよびI_Ksの発現はげっ歯類において存在しない/最小限であり、そしてI_Krおよび_{I Ks}の時間的活性化運動学のために、それは心行動電位形態^9、13において役割を持たない。このように、ウサギは、薬物誘発、取得、および遺伝したECG異常および不整脈^4、7、13のメカニズムを評価するためのより翻訳的なモデル^を提供する。次に、多くの研究が、初発心臓(長いQT症候群^{18、19、20)}または神経疾患(てんかん^{21、22、23、24)}における神経および心臓の両方の電気異常の存在を示しているように、ヒト生理学を密接に再現する動物モデルの基礎的メカニズムを研究することが重要である。げっ歯類は人間の脳をモデル化するのに十分かもしれませんが、げっ歯類はヒト心臓生理学⁷の理想的なモデルではありません。

脳波(EEG)は、通常頭皮または内部に置かれた電極を使用して、皮質の電気機能を記録します。これらの電極は、大脳皮質²⁵における近傍錐型ニューロン群の焼成速度およびシンクロニシティの変化を検出できる。この情報は、脳機能と覚醒/睡眠状態を評価するために使用することができます。また、EEGはてんかんの活性を局所化し、てんかん発作を非てんかん事象(例えば、心因性非てんかん活動および心原性事象)と区別するのに有用である。てんかんの種類、誘発因子、および発作の起源を診断するために、てんかん患者は発作をもたらす可能性のある様々な操縦を受ける。様々な方法は、過換気、photic刺激、および睡眠不足を含む。このプロトコルは、ウサギ^{26、27、28、29}におけるEEG収差および発作を誘発する感知刺激の使用^を示す。

同時ビデオ-EEG-ECG記録は、ヒトおよびげっ歯類において、イクタル前、イクタル状態、およびイクタル状態³⁰の間の行動、神経、および心臓活動を評価するために広く使用されている。いくつかの研究がウサギ^{4、31、32、33}で個別にEEGとECG記録を行っているが、意識的に拘束されたウサギの同時ビデオ-EEG-ECGを取得および分析するためのシステムは³⁴を確立していない。本論文では、神経心の電気機能と呼吸機能を評価するために、意識的なウサギに同時にビデオ-EEG-ECG-カプノグラフィーオキシメトリーデータを記録できるプロトコルの設計と実装について述べる。この方法から収集された結果は、不整脈、発作、呼吸障害、および身体的症状の間の感受性、引き金、ダイナミクスおよび一体性を示すことができる。実験システムの利点は、鎮静剤を必要とせずに意識的な録音を取得することです。ウサギは、最小限の動きで≥5時間の拘束剤に残ります。麻酔薬は神経細胞、心臓、呼吸、自律神経機能を摂動するので、意識状態の間の記録は最も生理学的なデータを提供する。

この記録システムは、最終的には、てんかんにおける突然の予期せぬ死(SUDEP)に対する神経学的、心臓および呼吸機構の理解を進めるための詳細な洞察を提供するかもしれない。上記の神経学的および心臓モニタリングに加えて、最近の証拠は、発作^35、36後の突然死への潜在的な貢献として呼吸不全の役割を支持している。ウサギの呼吸状態を監視するために、発作の前後の呼吸器系の状態を評価するためにオキシメトリーおよびカプノグラフィーを実施した。ここで提示されるプロトコルは、薬理学的および感電誘発性ウサギの発作の閾値を評価することを目的として設計された。このプロトコルは、物理的な症状を引き起こす可能性のある微妙なEEGおよびECG異常を検出することができる。さらに、この方法は、心臓の安全性と新しい薬剤やデバイスの抗不整脈効果検査に使用することができます。

プロトコル

すべての実験は、国立衛生研究所(NIH)ガイドラインおよびアップステート医科大学施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)に従って行われました。また、このプロトコルの概要を 図 1に示します。

1. 録音機器の準備

1. コンピュータを64ピンヘッドボックスでアンプに接続します。
   注:各動物は、頭部の4象限からのEEG用の4つのまっすぐな皮下頭皮ピン電極(7または13mm)、ECG(アイントーヴェンの三角形)のための3つの曲がった皮下胸部ピン電極(13mm、35°の角度)、右脚の1曲りの皮下ピン接地電極、および1つのストレート皮下頭皮ピン電極を備えています。
2. ヘッドボックスの 8^番目 のピンを参照するには、取得ソフトウェア設定、取得タブを更新して、参照電極が "独立" (リサーチ モード) になるようにします。
   注:これは7つの電極と専用の参照電極および地面の電極をそれぞれ1つのアンプ、デジタイザーおよびコンピュータを通して同時に7動物からの記録を可能にする。すべての電極は、単極チャネルとして取得され、参照(頭の中心)と比較されます。追加のバイポーラおよび拡張リード構成/モンタージュは、記録中または記録後に設定することができます。セットアップは複数の動物から同時に記録する能力を有するので、各動物からの接地電極は、アンプ上のグランド入力に並列に接続される(図2)。
3. 飼いのうちからウサギを取り除き、体重を量って動物ごとに適切な薬物用量を計算します。ウサギを輸送キャリアに入れ、非実験動物へのストレスを最小限に抑えるために別の部屋に持って行きます。本研究では、雄と雌のニュージーランド白ウサギとその後の子孫を使用した。実験は生後1ヶ月>ウサギに対して行った。実験の時点で、これらのウサギの重量は0.47-5.00キロの間でした。
   注意:ウサギは同じ部屋に、カメラの視界にある必要があるので、ウサギを完全に隔離しないでください。あるウサギが別のウサギにストレスを与える視覚および聴覚症状の可能性があります。したがって、一度に1匹のウサギを部屋に入れ、これは、感性刺激実験のために行われるのが理想的です。他のすべての実験では、ウサギはビデオカメラの視界内にそれらのすべてを保持しながら、可能な限り間隔を空けています。理想的には、障壁が使用されるか、または一度に1匹の動物だけが研究される。これは、ウサギの心拍数が 実験中にかなり安定しており、睡眠スピンドルが頻繁に存在していたため、大きなコンファウンダーではありませんでした。複数の動物からの記録は同時に制御およびテスト動物のデータが同じ環境条件の下で獲得されることを保証する。

2. EEG-ECG電極の埋め込みと呼吸モニターの取り付け

1. 輸送キャリアから1匹のウサギを取り除き、座った調査官の膝の上に置きます。
2. ウサギを縦に持ち、捜査官の遺体の近くに置いてください。
3. ウサギを、見本の膝に、ウサギの頭を身体の他の部分よりも低くして、うさぎの位置に下げます。
   注:この操縦は動物を弛緩させ、電極を置いている間動かしたり逃げようとする可能性を最小にする。
4. ウサギが腹の位置に固定されている今、皮膚が特定され、根底の組織から隔離されるまで毛皮を広げるように2人目の調査官に依頼する。
5. 各腋窩に35°曲げ電極を下皮に挿入する(図3A)。
   注:電極は、皮膚にしっかりと引っ掛けられるように押し通す必要がありますが、より深い構造に浸透しないでください。電極を皮膚に入れてから出て(スルースルー)すると、ウサギを拘束剤に入れたり、実験中に動いたりするとリードが外れる可能性が低くなります(図3B)。すべての電極は、配置前に70%エタノールで殺菌される。
6. 胸部の後部を右および左前肢に置き、腹部の前部を左後肢に置く。右後肢の腹部に接地ピン電極前部を置く(図4A)。
7. すべてのECGリードが適切に配置されたら、ウサギの腹部の片側を駆け上がった状態でウサギを起こしやすい位置に戻し、ウサギを適切なサイズの拘束剤(例えば、6" x 18"x 6")に移します。 ウサギを拘束剤に入れる場合は、緩いワイヤーを上に引っ張り、ウサギが足で電極を引き出すことを最小限に抑えます。実験中にウサギの下に巻き込まれないように、ワイヤーをサビサの側面にテープで留めます(図4B)。
8. 首の周りの拘束を下げ、所定の位置にロックすることによって、拘束剤にウサギを固定します。さらに、後肢を動物の下に上に移動させ、後部拘束を固定します。
   注:首の下のスペースに1-2本の指を収め、きつすぎないようにする必要があります。特に運動が起こる可能性のある実験では、動き、潜在的な脊髄損傷、四肢脱臼、および後部拘束を蹴り出す能力を最小限に抑えるために拘束を引き締めることが重要である(図4B)。ウサギは、動きの増加や脱水症状の兆候に関連する問題なしに〜5時間の拘束剤に維持されています。
   1. 小さいウサギ(例えば、2ヶ月未満)の場合は、動物の下にゴムブースターパッドを置いてウサギを上げ、ウサギが頭の下に首を置くことを防ぎます(図4C)。
      注:呼吸と心拍数の急激な低下は、首の衝突に二次的である可能性があります。この場合は、首の拘束を緩め、ウサギの頭を持ち上げて首の圧迫を緩和します。
   2. 後部拘束がウサギの背中/背骨を密接に追跡しない場合は、脊髄損傷を引き起こす可能性のある動きを防ぐためにPVCスペーサーを配置します。
      注:例えば、〜14センチ長x 4"内径PVCパイプ、下25〜33%を取り除いた適切な拘束を提供するために泡でウサギの上に置くことができます(図4C)。
9. これでウサギがしっかりと拘束剤に入れられたので、7~13mmの皮下ストレートピン電極を頭皮に挿入します(図3A)。45°の角度アプローチを使用して、耳の間にワイヤーを上げ、導線の配置を維持するために、ワイヤーを頭部の後ろの拘束者にゆるやかにつなぐ。5 EEGリードを次の位置に配置します:右前、左前頭、右後頭、左後頭部および中央参照(Cz)リードを他の4つのリードとの間のポイントに配置します(図4D)。
   注:電極は頭蓋骨に対して皮下組織に配置されたときに適切に配置されます。この配置により、鼻、耳、およびその他の周囲の筋肉からのアーチファクトを最小限に抑えます。リズミカルな鼻の動きからいくつかのアーティファクトは避けられません。前のEEGリードはウサギの目に内側に置かれ、前向きにする必要があります。後頭部リードは耳の前に置かれ、内側方向を指し示す。Czは、4つの電極(縫合線に沿ってラムダとブレグマの中間方向)の間にある点で、頭頂部の中央に配置されます。Cz電極のピンは前向きに向いています。
   1. ウサギがワイヤーを噛もうとしないように、耳の間にEEGワイヤーを渡します。
10. パルスオキシメータプレチスモグラフを、うさぎの耳に、限界の耳静脈の上に取り付けます。
    メモ:信号を改善するために耳から余分な髪を剃るか、センサーを所定の位置に保つためにいくつかのガーゼを使用する必要があります。
    1. 胸膜造影の心拍数が心電図からの心拍数と相関し、酸素飽和度が表示されていることを確認します(図5C)。
11. ウサギの口と鼻の上にカプノグラフィーチューブを入れ、フェイスマスクをそっと置きます(図4H)。マスクに巻き付けられた文字列でフェイスマスクを固定し、文字列の両端を拘束者に取り付けます。カプノグラフィーチューブのもう一方の端をバイタルサインモニターに取り付けます。
    注:実験中に、ひもがウサギの目の上に置かないようにすることが重要です。これを行うには、ウサギの耳の間の拘束剤の真ん中に文字列をテープします。カポノグラフィー信号を改善するために、テープとTピースに酸素を入れ込む薄いニトリルを使用して一方通行バルブを作成し、吐出したCO2をカポノグラフィーチューブに導きます(図4I)。

3. ビデオ-EEG-ECGの記録

1. 市販のEEGソフトウェアを使用してビデオ-EEG-ECG記録を行う。
   注:バイオポテンシャルリードとビデオは、後で電気信号とビデオ信号を相関させるために時間ロックされています(例えば、EEGスパイクとミオクロニックジャーク)。
2. ベースラインドリフト、60 Hzの電気ノイズ、高い信号対雑音比を備えた最適な接続性を確認します。具体的には、心波形の各相をECG上で可視化し、デルタ波、シータ波、アルファ波がEEG上の高周波ノイズによって視覚的に隠されていないことを確認します。
   1. すべての電極が過度のノイズを発生させる場合は、中央基準リードを調整します。1つの電極だけが過度に騒がしい場合は、その電極を皮膚の奥深くに押し込むか、金属が露出しなくなるまで位置を変更します。
3. すべてのウサギが同時に見ることができるようにビデオを調整し、運動活動とEEGの所見の相関を可能にします(図5A)。
   注:システムは最大7匹のウサギからの同時EEG/ECG/オキシメトリー/カプノグラフィー録音を収容する。
4. 最低10〜20分間、または心拍数が穏やかなリラックス状態(200〜250 bpm)に安定するまで、各動物からベースライン記録を開始し、ウサギは少なくとも5分間大きな動きを示さない。フィルターなしで完全な帯域幅の電気的なデータを得る。データをより良く視覚化するために、低周波数フィルタ(=ハイパスフィルタ)を1 Hzに設定し、高周波フィルタ(=ローパスフィルタ)を59 Hzに設定します。
   注:ウサギがリラックスしているもう一つの兆候は、EEG睡眠スピンドルの発症です(後述します)。
5. リアルタイムでの実験中に時間ロックされたメモを追加して、介入(例えば、薬物送達)および神経心事象(例えば、脳電スパイク、運動発作、異所性拍動、不整脈)、および運動/研究者の人工物のタイミングを示す。
   注:調査官が介入(例えば、恐怖刺激、薬物送達)を適用する必要がある頻度のために、調査官が部屋に出入りし、ドアを開閉するストレスを最小限に抑えるために、調査官は実験を通して部屋の反対側にとどまります。研究者は可能な限り動物から遠くに座り、動物を邪魔する可能性を最小限に抑えるために静かに静かにしています。

4. 実験プロトコル

注:次の実験は、同じ動物に対して実行された場合、別々の日に実行されます。経口検査化合物薬物研究と急性末端痙攣薬研究の間には2週間の遅延がある。必要に応じて、感知刺激実験を行い、続いて30分待機し、次にPTZ薬物研究を行う。

1. ウサギが拘束剤に順応し、研究者が心呼吸率の安定化を客観的に確認できるようにするために、すべてのウサギを心呼吸センサーおよび神経センサーで計器化し、動物1匹あたり1〜3回>連続的なビデオモニタリングを行います。
2. 感知刺激実験
   1. 上記の方法に加えて、眼の高さでウサギの前部に円形反射器30cmの光源を配置し、フラッシュ強度を最大(16カンデラ⁾²⁹に設定した。光源は 図4Eの白い点で示されています。
      注:薄暗い部屋は、感光応答³⁷を引き出すために使用されるべきです。
   2. ウサギの目は頭の前ではなく頭の側にあるので(人間のように)、ウサギの両側に2つの鏡を置き、ウサギの目に光が入るようにウサギの後ろに1を置きます。
      注: 縦≥20cmの平らな鏡は、長さ120cm≥、ウサギの周りに三角形の囲いを作成し、点滅する光がウサギの目に入るようにします( 図4E参照)。
   3. 調整可能なレート、強度、および持続時間を持つコントローラーに光源を接続します。
   4. 赤色光と赤外線記録機能を備えたカメラを使用してビデオを録画します。
   5. 目を開けて30sの各周波数にウサギをさらし、顔を覆う外科マスクを持つ別の30 sを各周波数でシミュレートまたは引き起こします。
      注:以前の研究では、目の閉鎖は発作に対する光感受性を引き出す最も挑発的な操縦であることを示しています²⁹.また、感光患者の10%は、目を閉じている間に脳波の徴候を示すだけです^。発作は、頭部および全身筋孔性ジャーク、クローヌス、または強壮状態の存在を観察することによって臨床的に同定することができる。脳波記録は、発作活動の確定診断のための運動症状を伴う脳波相関(例えば、スパイク、ポリスパイク、リズミカル放電)についてより徹底的に分析される。筋肉の人工物や不確定なてんかんの波によってEEGが隠されている動きは、確認のためにてんかん学者によって見直されるべきである。
   6. 2 Hz 単位で 1 Hz から 25 Hz までのフォティック刺激周波数を増加します。次に同じ光刺激プロトコルを実行しますが、今回は周波数を60Hzから25Hzに5 Hzずつ減らします。
      注意:ウサギが発作を起こした場合は、実験を中止する必要があります。ウサギを30分間監視し続けます。その後、ハウジングルームにウサギを返し、完全な回復のために3時間のために1時間ごとに監視します。しかし、この感光刺激が光パルスの応答を誘導する場合、上昇周波数の残りの部分はスキップされ、別の光パルスの応答が起こるまで60Hzから降下して再び系列が開始される。これにより、上下のフォティック刺激閾値の決定が可能になります。フォティック刺激が中止された後に光パルスマル応答が停止するため、遅延は必要ありません。光パルスマル応答が発生したかどうかが不明である場合、周波数は10s遅延³⁸の後に繰り返される。
   7. 実験が完了したら、ウサギからEEGと心電図のリードを取り除き、夫のスタッフによる日常的なケアのために自宅のケージに戻します。
3. 薬の経口投与
   1. 多くの薬が経口で服用されているように, 食品グレードのリンゴソースと混合して経口化合物を準備します。.0.3 mg/kgのE-4031を3mLのリンゴソースで混ぜ、針なしで3mL経口/灌漑注射器にロードします。
      注:いくつかの薬は、この方法で投与することができます, テスト化合物, QTの持続時間を変更することが知られている薬 (モキシフロキサシンまたはE-4031), 陰性制御または車両.いくつかの薬物は、静脈内製剤では利用できません.さらに、多くの薬は経口製剤で処方されるため、静脈内投与は臨床的関連性が低い可能性があります。
   2. 上唇を持ち上げ、ウサギの歯に塞がらないウサギの口の側面に口腔注射器の先端をスライドさせ、すべての薬とリンゴソースをウサギの口に注入します。
   3. ビデオ-EEG-ECGの記録を2時間続け、定期的なケアのために動物を自宅のケージに戻します。
   4. 実験2日目と3日目に、ウサギをビデオEEG-ECGに接続し、ベースラインの10〜20分を記録し、同じ薬を注入し、2時間記録します。
   5. 1週間のウォッシュアウトの後、ベースラインの10〜20分を行い、各ウサギに3日間連続してプラセボの単回投与を与え、2時間記録する。
      注:経口薬の投与は、プラセボが第1週と第2週の薬の間に与えられるクロスオーバー研究として設計され得る。
4. 静脈内投薬実験(ペンチレンテトラゾール、PTZ)
   1. 外耳静脈を可視化するために、ウサギの耳の後部表面を剃る。70%エタノールワイプを使用してサイトを消毒し、限界耳静脈を拡張します。これは、 図 4Fの黒い破線の楕円で示されています。
   2. この時点で、1人の実験者がウサギに対する手順のストレスを軽減するために、ウサギの顔を手で覆います。第2の実験者は、滅菌25-G血管カテーテルで限界耳静脈を慎重にカニューレ化する。
   3. カテーテルが静脈に入ったら、針が静脈内に薬を導入できるように、カテーテルの端に無菌注射プラグを置きます。射出プラグの位置は 、図4Gの青い円で示されています。
   4. 4 x 4 インチガーゼをテープで包み、チューブ状にしてウサギの耳の中に置いて副木を作ります。その後、カテーテルが所定の位置に固定され、非カテーテル化された耳と同様に直立したままになるように、副木を耳にテープで留めます。
   5. 1mLの10 USP単位を1mLのヘパリニ化生理的な生理液を注入する。
      注意:カテーテルと容器は目に見えて空気を取り除き、特許を残す必要があります。カテーテルが血管内に存在しない場合、注射器は容易に押されず、皮下組織に生理食音が蓄積する。
   6. 1 mg/kg から 1mg/kg の 1 mg/kg 単位で 10 mg/kg 単位の PTZ の増分用量を 10 分ごとにウサギに与えます。各用量の開始時にメモを取り、どの動物が注射されているか、そして薬の濃度を示します。
      注: これにより、PTZ 管理の急性および加法的効果の評価が可能になります。あるいは、低用量PTZの慢性的な影響をさらに評価するために、ウサギは各低用量濃度で反復投与を行い、2mg/kgで7回投与し、5mg/kgで3回投与し、次いで10mg/kgで3回投与し、各用量は10分で分離される。
   7. 各用量の後、任意の神経心の電気および呼吸異常およびてんかん活動の視覚的証拠に対するビデオ-EEG-ECG-カプノグラフィー-オキシメトリーを注意深く監視する。リアルタイムおよび後分析中にこれらの変更に注意してください。
      注:発作活動は、PTZ管理の60s以内に開始することがよくあります。

5.非生存実験の結論

1. もし、ウサギがPTZ実験の過程で突然死しなかった場合、体重4.54kg(または全てのウサギに対して1.5mL)に対してペントバルビタールナトリウムの1mLを投与し、続いて正常な生理塩水の1mLフラッシュを行う。心電図を監視して、ウサギが心停止を受けることを確認します。
2. ウサギが心停止を経験したら、心臓、肺、肝臓、脳、骨格筋、その後の分子/生化学的分析に必要なその他の組織を含む様々な器官を新たに分離するために壊死を迅速に行う。
3. 機関の方針に従ってウサギを処分する。

6. ECGの分析

1. 市販の心電図解析ソフトウェアを使用して、心電図を目視で検査し、頻脈、徐脈、異所性拍、その他の不整脈の期間を特定する(図6)。レビューするデータの量を減らすために、タコグラムを作成し、頻脈、徐脈、またはRR間隔の不規則性の期間を容易にする。
   注:ECG異常(例えば、QT_の延長 )および不整脈は、速度の異常(例えば、ECGを見直すことによって手動で識別される、 ブレイディ/タキ性不整脈、リズム(例えば、早期心房/心室複合体)、伝導(例えば、房室ブロック)、波形(例えば、非正気心房/心室頻脈および線維化)不整脈は、RR間隔の不規則性のタコグラムを見直すことによって検出することができる。頻脈は、心拍数が毎分300拍を超えるタコグラムのセクションによって識別することができる。徐脈は、心拍数がタコグラムで毎分120拍未満である場合に識別される。
2. 市販の心電図分析ソフトウェアを用いて、ベースラインおよび挑発時に標準心電図測定(心拍数、心拍間隔)を行う(例えば、動物を操作する研究者、試験剤の投与、発作誘発心電図変化)。

7. ビデオ-EEGの分析

1. 市販のソフトウェアを使用してビデオおよびEEGトレースを視覚的にスクロールして、ベースライン信号(図7)、睡眠スピンドル(図8)や頂点波などの期待されるEEG放電の存在を特定する(図9)。
   注:全帯域幅の電磁波データはフィルタなしで取得されますが、低周波数フィルタ(ハイパスフィルタ)を1Hzに設定して表示し、ナイキストの定理に基づいて、高周波フィルタ(つまり、ローパスフィルタ)を120Hzに設定して信号を逃さないようにします。フィルターは、低周波(<25 Hz)のEEGアクティビティをレビューする際に、より良い視覚化とノイズリダクション(例えば、1〜59 Hz)を可能にするために調整することができます。
2. カポノグラフィー波形に加えて、脳波で鼻の動きアーティファクトを使用して、呼吸の有無を判断します。これは、ビデオ録画で見られる鼻の動きとも相関することができます。
3. PTZの各投与後少なくとも1分間のてんかんと非てんかん(例えば、意識的)の動きを区別するために市販のソフトウェアを使用してビデオおよびEEGトレースを視覚的にスクロールする(図10)。発作の前後に、頭間てんかんの排出とEEGの変化をスキャンします。発作は、頭部および全身筋孔性ジャーク、クローヌス、またはEEG相関を有する強壮状態の存在を観察することによって臨床的に同定することができる。EEGの変化には、EEGスパイク、ポリスパイク、リズミカル放電が含まれる場合があります。
   注:脳波が筋肉の人工物または不確定性てんかんの波によって隠されている動きは、確認のために神経科医によって見直されるべきです。ビデオを1つのウサギに焦点を当てて、その動作だけでなく、そのEEGとECGの録音をより密接に見る方が有利かもしれません(図5B)。
4. PTZ注入後1分以内に発生する運動症状の種類と重症度に基づいて発作のビデオ-EEGをスコア付けする(表1)。
5. 感光刺激実験の後、市販のEEG解析ソフトウェアでスペクトル解析プロットを作成することにより、後頭部駆動リズムの有無についてEEGの後頭部を解析する。後頭部駆動リズムは、感知刺激器の周波数に対応するスペクトル解析でピークを作り出す(図11)。
   注:感音刺激は、基本周波数のピークに加えて、高調波周波数ピークを生成することがあります。

7. 呼吸機能の解析

1. バイタルサインモニタからの出力を確認し(図4I)、信号をエクスポートしてさらなる分析を行います。
2. 発作時および発作後の呼吸パターンの変化、特に無呼吸が始まる時点に注意してください。

結果

上記の方法は、呼吸障害だけでなく、脳や心臓の電気伝導系の異常を検出することができる。データ取得ソフトウェアは、ECG形態を評価し、異常な心拍数、伝導障害、または心電図リズム(心房/心室異所性拍、および徐脈性不整脈)を検出するために使用される(図6)。ECGの形態を視覚化することに加えて、トレースは、RR間隔、心拍数、PR間隔、P?...

ディスカッション

この実験的なセットアップは、特に心臓および/または神経疾患のモデルにおいて、ウサギにおける詳細な同時ビデオ-EEG-ECG-オキシメトリー-カプノグラフィーの記録および分析を促進する。この記事の結果は、この方法が発作や不整脈を検出し、それらを電図アーティファクトから区別することができることを示しています。ウサギにプロコンバルサントを与えたときに期待される結果が得?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP - Flexible Container	PFIZER (HOSPIRA)	7983-09	Dilutant
10cc Luer Lock syringe with 20G x 1" Needle	Sur-Vet	SS-10L2025	Used as a flush after drug injection
4x4 gauze sponges	Fisher Scientific	22-415-469	Rolled in a tube to splint ear with angiocatheter
Apple Sauce	Kirkland	897971	Vehicle for oral medications
Computer	Dell	Optiplex 5040	Acquisition computer
E-4031	Tocris	1808	Agent known to prolong the QT interval
ECG Electrode	RhythmLink	RLSND116-2.5	13mm 35-degree bent (0.4 mm diameter) subdermal pin electrodes
EEG Electrode	RhythmLink	RLSP513	5-twist 13mm straight (0.4mm diameter) subdermal pin electrodes
EEGLAB (2020)	Swartz Center for Computational Neuroscience	Open Access	Can perform spectral analysis of EEG
Ethernet-to-ethernet adapter	Linksys	USB3G16	Adapter for connecting the camera to the computer
Euthanasia-III Solution	Med-Pharmex	ANADA 200-280	Contains pentobarbital sodium and phenytoin sodium, controlled substance
Foam padding	Generic	N/A	Reduces pressure applied to the neck of small rabbits by the restrainer in order to prevent the adverse cardiorespiratory effects of neck compression
Heparin Lock Flush	Medline	EMZ50051240	To maintain patency of angiocatheter
IR Light	Bosch	EX12LED-3BD-8W	Facilitates recordings in the dark
LabChart Pro (2019, Version 8.1.16)	ADInstruments	N/A	ECG Analysis
JELCO PROTECTIV Safety I.V. Catheters, 25 gauge	Smiths Medical	3060	Used to catherize marginal ear vein
MATLAB (R2019b, Update 5)	MathWorks	N/A	Required to run EEGLAB
Microphone	Sony Stereo	ECM-D570P	Recording of audible manifestions of seizures
Micropore Medical Tape, Paper, White	3M	1530-1	Used to secure wires and create ear splint
Natus NeuroWorks	Natus	LC101-8	Acquisition and review software
Pentylenetetrazol (1 - 10 mg/kg always in 1mL volume)	Sigma-Aldrich	88580	Dilutions prepared in saline
Photic Stimulator	Grass	PS22	Stimulator to control frequency, delay, duration, intensity of the light pulses
Plastic wire organizer / bundler	12Vwire.com	LM-12-100-BLK	Bundle wires to cut down on noise
PS 22 Photic Stimulator	Grass Instruments	BZA641035	Strobe light with adjustable flash frequency, delay, and intensity
PVC pipe	Generic	N/A	Prevents small rabbits from kicking their hind legs and causing spinal injury
Quantum Amplifier	Natus	13926	Amplifier / digitizer
Quantum HeadBox Amplifier	Natus	22134	64-pin breakout box
Rabbit Restrainer	Plas-Labs	501-TC	Various size rabbit restrainers are available. 6" x 18" x 6" in this study.
Rubber pad (booster)	Generic	N/A	Raises small rabbits up in the restrainer to prevent neck compression
SpO2 ear clip	NONIN	61000	PureSAT/SpO2
SpO2 sensor adapter	NONIN	13931	XPOD PureSAT/SpO2
SRG-X120 1080p PTZ Camera with HDMI, IP & 3G-SDI Output	Sony	SRG-X120	Impela Camera
Terumo Sur-Vet Tuberculin Syringe 1cc 25G X 5/8" Regular Luer	Sur-Vet	13882	Used to inject intravenous medications
Veterinary Injection Plug Luer Lock	Sur-Vet	SRIP2V	Injection plug for inserting the needle for intravenous medication
Webcol Alcohol Prep, Sterile, Large, 2-ply	Covidien	5110	To prepare ear vein before catheterization