JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تم تصميم مشروع علمي للمواطنين لتوظيف سكان سان دييغو لجمع عينات بيئية للسارس-CoV-2. تم إنشاء نظام أساسي متعدد اللغات على شبكة الإنترنت لتقديم البيانات باستخدام واجهة جهاز محمول سهلة الاستخدام. ويسر نظام لإدارة المعلومات المختبرية جمع آلاف العينات المتنوعة جغرافيا مع تتبع النتائج في الوقت الحقيقي.

Abstract

للسيطرة على انتقال فيروس كورونا 2 (SARS-CoV-2) في المجتمع خلال الوباء العالمي لعام 2020، نفذت معظم البلدان استراتيجيات تستند إلى الاختبار البشري المباشر، وتغطية الوجه، وتطهير السطح. 32 - وعلى افتراض أن الطريق الرئيسي لانتقال العدوى يشمل الهباء الجوي وقطرات الجهاز التنفسي، تركزت الجهود المبذولة للكشف عن فيروس سارس -CoV-2 في الفوميت على المواقع المشتبه في ارتفاع معدل انتشارها (مثل عنابر المستشفيات، والسفن السياحية، ونظم النقل الجماعي). وللتحقيق فى وجود السارس - كوف - 2 على الأسطح فى البيئة الحضرية التى نادرا ما يتم تنظيفها ونادرا ما يتم تطهيرها ، تم تجنيد 350 مواطنا من محافظة سان دييجو الكبرى . وفي المجموع، جمع هؤلاء العلماء المواطنون 080 4 عينة. وتم تطوير منصة إلكترونية لرصد تسليم مجموعة العينات والتقاطها، فضلا عن جمع بيانات العينات. وقد بنيت مجموعات أخذ العينات في معظمها من الإمدادات المتاحة في المتاجر التي تعاني من الإجهاد الجائح. وجرى تجهيز العينات باستخدام الكواشف التي يسهل الوصول إليها على الرغم من النقص المتكرر في الإمدادات. وكانت الأساليب المستخدمة حساسة للغاية ومقاومة للمثبطات الموجودة عادة في العينات البيئية. وقد نجحت أساليب التصميم والمعالجة التجريبية المقترحة في إشراك العديد من العلماء المواطنين الذين جمعوا عينات من مناطق سطحية متنوعة بشكل فعال. إن سير العمل والأساليب الموصوفة هنا ذات صلة بمسح البيئة الحضرية بحثا عن فيروسات أخرى، والتي تثير قلقا في مجال الصحة العامة وتشكل تهديدا للأوبئة في المستقبل.

Introduction

ويعتقد ان السارس - كوف - 2 ينتقل اساسا عن طريق استنشاق الهباء الجوى الملوث وقطرات من الاتصال المباشر مع الافراد المصابين1و2و3و4. ومع ذلك، خلال المراحل الأولى من وباء COVID-19 العالمي، ركزت الجهود الرامية إلى السيطرة على انتقال السارس-CoV-2 بقوة على تطهير الأسطح وغسل اليدين والتطهير. وبحلول نهاية عام 2020، اعتبرت المبادئ التوجيهية لانتقال العدوى منمنظمة الصحة العالمية 5 والمراكز الأميركية لمكافحة الأمراض والوقاية منها(CDC) 6 أن انتقال العدوى جوا يشكل خطرا بشكل رئيسي عندما يكون على اتصال وثيق (<2 متر) مع شخص مصاب أو في وجود إجراءات طبية مولدة للهباء الجوي. ولم يستبعد بعد التلقيح الذاتى بعد ملامسة السطوح الملوثة او استنشاق الفوميتس الهباء الجوى كطريق لانتقال السارس - كو فى - 2 .

وقد تم الإبلاغ عن حالات COVID-19 حيث يبدو انتقال العدوى المحمولة جوا من غير المرجح7،8. سارس-CoV-2 virions تبقى المعدية على النحاس لمدة تصل إلى 8 ساعة، على الورق المقوى والفولاذ المقاوم للصدأ لمدة تصل إلى 24 ساعة، وعلى البلاستيك لمدة تصل إلى 48 ساعة9. في كابينة السفن السياحية، تم الكشف عن سارس-CoV-2 الجيش الملكي النيبالي بعد 17 يوما من مغادرة الركاب7. وقد ثبت أن عينات الهواء والسطح المأخوذة من المستشفيات ونظم النقل الجماعي إيجابية بالنسبة لفيروس سارس-كوف-2 وغيره من الفيروساتالتاجية8و10و11و12و13و14. وخلصت دراسة أجريت على التعبئة والتغليف الخارجي للحلوى هالوين التعامل معها من قبل المرضى COVID-19 أعراض غير أعراض ومعتدلة / معتدل، أن الجمع بين غسل اليدين من قبل معالج وغسل الحلوى مع صابون اليد خفضت سارس-CoV-2 الجيش الملكي النيبالي إلى ما دون مستويات العتبة15.

وقد نشرت عدة طرق لتشخيص سارس-CoV-2 استنادا إلى في الوقت الحقيقي عكس النسخ البوليميراز سلسلة من ردود الفعل (RT-qPCR)16،17،عكس النسخ حلقة بوساطة التضخيم isothermal (RT-LAMP)11،18،19، 20،21،و CRISPR-Cas تقنيات18،19،22،23. معظمها يتطلب مجموعات استخراج الحمض النووي الريبي التي غالبا ما تكون قليلة العرض خلال فترات الطلب العالمي الكبير، وقد استخدمت عدد قليل جدا للفحص البيئي للفيروس24. وقد ثبت أن الكشف عن سارس-CoV-2 RNA باستخدام RT-مصباح أن أكثر من 83٪ توافقت مع استخدام RT-qPCR. وعلاوة على ذلك، أدى RT-مصباح في انخفاض بنسبة 25٪ في نتائج غير حاسمة مقارنة RT-qPCR15.

RT-LAMP هو تقنية بسيطة تستخدم النسخ العكسي لتجميع cDNA من قالب الحمض النووي الريبي25، يليه بوليمرات الحمض النووي مع نشاط قوي للإزاحة الخيطية التي تجمع الحمض النووي في درجة حرارة ثابتة (أي التضخيم الإقذري)26. يتم تحقيق خصوصية أعلى للكشف عن الجينوم الفيروسي باستخدام أربعة أو ستة مبرزات تعترف بست أو ثماني مناطق من الحمض النووي المستهدف. يتم بدء التضخيم من التمهيدي الداخلي وينتج بنية الحمض النووي شبه مزدوجة تقطعت بهم السبل. ثم يتم تضخيم حبلا الرائدة من قبل التمهيدي الخارجي. وتتكرر هذه التضخيمات للمبرمجين العكسي. التهيئة الداخلية والخارجية على أي من الطرفين لديها موقع داخلي التكامل الذاتي العكسي الذي يشكل حلقة في المنتج تضخيم26،27. في إزاحة حبلا isothermal، تخليق الحمض النووي غير المتزامن يولد كميات عالية من المنتج تضخيم حيث البلمرة المستمر تضخيم إشارة من عدد قليل من 10 نسخ لكل رد فعل11،20،28. يتم تخزين مزيج RT-LAMP الملون بشكل ضعيف ويستخدم فينول الأحمر كمؤشر درجة الحموضة. كما يتضمن البوليميراز النيوكليوتيدات، فإنه يطلق بروتون، وسوف ما يكفي من البروتونات تغيير الرقم الهيدروجيني للمحلول، فضلا عن لونه من الوردي إلى الأصفر11،20،28،29.

تم تطوير RT-LAMP للكشف عن الأمراض المنقولة بالبعوض في مرافق الرعاية الصحية الطرفية التي تفتقر إلى مختبرات مجهزة تجهيزا كاملا25 وللكشف السريع عن فيروسات الحمض النووي الريبي الأخرى مثل فيروس نقص المناعة البشرية30. وغالبا ما تفتقر أكثر الفئات السكانية ضعفا في الفاشيات الوبائية - وفقا لتعريف منظمة الصحة العالمية - إلى الموارد الاقتصادية الكافية والمعدات المناسبة لتنفيذ الكشف (جدول أعمال الأمم المتحدة العالمي للصحة العامة). وفي جائحة سارس-كوف-2 الحالية، لم تتمكن إمدادات مثل المسحات الطبية والكواشف الخاصة بمجموعات استخراج الحمض النووي الريبي من تلبية الطلب العالمي، لا سيما في البلدان غير المصنعة. استخدم البروتوكول المقترح استخراج الحمض النووي الريبي الخام القائم على جوانيدينيوم (GITC) ، والذي حافظ بشكل فعال على الحمض النووي الريبي بطريقة مستقلة في السلسلة الباردة وقلل بشكل كبير من استمرار المثبطات من العينة. وعلاوة على ذلك، يستند بروتوكول استخراج كلوروفورم GITC على فصل الحمض النووي الريبي عن الحمض النووي والبروتينات يليه هطول الأمطار المعني، مما يسمح باستعادة معظم المواد الوراثية. وتفوق هذه المزايا المخاطر المحتملة للعلماء المواطنين الذين يتعاملون مع المادة الكيميائية إذا اتخذت تدابير لإبلاغهم على النحو المناسب بالمخاطر.

يستخدم سير العمل المقترح المواد والكواشف ذات الاستخدام العام. وهو يتطلب معدات متاحة في البيئات المختبرية الأساسية، والريفية في كثير من الأحيان. هذه الأساليب غير مكلفة، ومقاومة للغاية للمثبطات الموجودة في كثير من الأحيان في العينات البيئية أو العينات التي لا يمكن معالجتها مع مجموعات الاستخراج، والقضاء على الحاجة إلى دراجة حرارية عالية الدقة. تقدم هذه الدراسة خط أنابيب لأخذ عينات من السارس-CoV-2 والكشف عنه من الخزانات البيئية على أسطح الأسر والبيئة الحضرية التي يتم لمسها بشكل شائع ونادرا ما يتم تطهيرها.

Protocol

راجع جدول المواد للحصول على قائمة مفصلة بالكواشف والمستلزمات، بما في ذلك أرقام الكتالوجات والشركة المصنعة والتكاليف المقابلة.

1. أخذ عينات من البيئة الحضرية

  1. توعية المواطنين العلماء
    1. توظيف العلماء المواطنين باستخدام دعوة مباشرة وواضحة للعمل صدر عبر وسائل الإعلام المحلية والاجتماعية. أنشئ مقبضا لوسائل التواصل الاجتماعي (على سبيل المثال، #swab4corona)لربط الموضوع عبر محتوى وسائل التواصل الاجتماعي.
    2. إنشاء حساب بريد إلكتروني للاتصال المباشر بين فريق المختبر وكل عالم مواطن، يديره شخص يجيد اللغات الرئيسية للمنطقة ذات الاهتمام (مثل الإسبانية والإنجليزية لمقاطعة سان دييغو).
    3. بناء منصة آمنة لإدارة العينات على شبكة الإنترنت (SMP) لتكون بمثابة قاعدة بيانات، ونظام إدارة المعلومات المختبرية (LIMS)، والتواصل مع العلماء المواطنين.
      ملاحظة: يوفر SMP موقع مركزي حيث يطلب المستخدمون مجموعة والوصول إلى بروتوكولات جمع نماذج وتقديم بيانات تعريف عينة وطلب التقاط لمجموعات عينات مكتملة.
    4. إنشاء رابط إلى SMP (على سبيل المثال، https://demo.covidsample.org/)(الشكل 1) للأفراد للتقدم بطلب للمشاركة في جهود أخذ العينات البيئية من خلال الإجابة على الأسئلة المتعلقة بالسلامة البيولوجية المحددة في نموذج عبر الإنترنت.
    5. الوصول الآمن إلى SMP باستخدام واجهة برمجة تطبيق المصادقة التي يسهلها موفر خدمة كمبيوتر سحابي. منح المستخدمين المعتمدين حق الوصول إلى SMP.
      ملاحظة: الرجوع إلى الأدب للحصول على وصف بروتوكول OAuth 2.031 للمصادقة والتخويل. وهو يوفر عملية تسجيل دخول خالية من الاحتكاك للمتطوعين من العلماء المواطنين. كما يسمح للمستخدمين بتسجيل الدخول باستخدام حساب موجود، مما يلغي الحاجة إلى إنشاء حل تسجيل دخول مخصص وإدارة بيانات اعتماد المستخدم، مما يوفر قدرا كبيرا من الوقت ويشجع المشاركة. ووفقا لتقارير حديثة، فإن خدمة البريد الإلكتروني المجانية المتاحة لمزود خدمة الكمبيوتر السحابي المختار لديها ما يقرب من 1.5 مليار مستخدم للبريد الإلكتروني النشط شهريا؛ لا يعتبر طلب حساب بريد إلكتروني من مزود الخدمة هذا للمشاركة عاملا مثبطا.
    6. شرح هدف الدراسة واعتبارات السلامة البيولوجية للعلماء المواطنين في SMP قبل أن يطلبوا أول مجموعة. توفير مكون إضافي متعدد اللغات لتمكين التنقل في أي من اللغات المتاحة من خدمة الترجمة الآلية العصبية متعددة اللغات التي يسهلها مزود خدمة الكمبيوتر السحابي.
    7. تضمين في قسم أخذ العينات الرسم والبروتوكولات السمعية والبصرية باللغتين الإنجليزية والإسبانية.
    8. تعيين معرف فريد لكل مجموعة، وتصميم واجهة المستخدم للاستفادة من أزرار مرتبطة عينة معرف لتبسيط عملية إدخال البيانات(الشكل 1A).
    9. استخدم برنامج تخطيط طريق التسليم مع تطبيق للأجهزة المحمولة لاستخدامه من قبل السائقين لتحسين طرق التسليم / الاستلام وإخطار العلماء المواطنين بأوقات الوصول المقدرة الدقيقة.
    10. بناء منصة LIMS على كومة خدمة الويب PHP ، واستضافتها على منصةاستضافة تجارية (يتم تحديد نظام التشغيل المقترح ، وبرامج خادم الويب ، وبرامج قاعدة البيانات في جدول المواد ).
    11. توفير واجهة تطبيق آمنة على شبكة الإنترنت لتمكين موظفي المختبر من إدارة البيانات بسرعة وسهولة في نظام إدارة المعلومات. توفير تصور للبيانات باستخدام واجهة برمجة تطبيقات تخطيط البيانات التي يسهلها موفر خدمة كمبيوتر سحابي.
    12. تصور البيانات الجغرافية المكانية باستخدام واجهة برمجة التطبيقات الجغرافية المكانية التي يسهلها مزود خدمة الكمبيوتر السحابي. تخزين البيانات المقدمة إلى نظام إدارة المشاريع من خلال نظام إدارة البرامج لتسهيل (1) التخزين المركزي لبيانات المشروع؛ (2) المخازن المركزية لبيانات المشروع؛ (2) المخازن المركزية لبيانات المشاريع؛ (2) المخازن المركزية لبيانات المشاريع؛ (2) المخازن المركزية لبيانات المشاريع؛ (2) المخازن المركزية لبيانات المشاريع؛ (2) ال (2) تتبع العينات/عمليات سير العمل لمعالجة البيانات؛ و (3) إدارة الخدمات اللوجستية لتوزيع عدة عينة للعلماء المواطنين.
    13. بيانات تعريفية آمنة مقدمة باستخدام أفضل الممارسات (على سبيل المثال، https://demo.covidsample.org/).
    14. معلومات التحميل المسبق مثل معرف مجموعة العينات ومعرف العينة والتاريخ والوقت وإحداثيات النظام العالمي لتحديد المواقع (GPS) (التي يتم جمعها تلقائيا من صورة للموقع) لتمكين التوافق من نوع البيانات وتقليل تقديم بيانات خاطئة أو مفقودة من قبل المستخدم(الشكل 1B). قم بتضمين الحقول التالية التي سيتم تعبئتها يدويا وبسرعة (<1 دقيقة) من قبل عالم المواطن: تاريخ ووقت التجميع ، ووصف موجز للموقع ، وصورة لموقع أخذ العينات.
    15. تعقيم كافة البيانات التي تم تحميلها والتحقق من صحة نوع البيانات. على سبيل المثال، التحقق من صحة بيانات الصور التي تم تحميلها من قبل المستخدمين لتحديد ملفات .jpg، وإعادة تسميتها باستخدام "معرف العينة" للارتباط السريع مع العينة، وتخزين الصور التي تم تحميلها في موقع آمن منفصل لا يمكن للمستخدمين الوصول إليه.
    16. تفعيل خيار طلب تسليم مجموعة والتقاط عند الانتهاء من جميع العينات (16). بالإضافة إلى ذلك، قم بتنشيط خيار طلب مجموعة جديدة ليتم تسليمها عند التقاط المجموعة السابقة(الشكل 1A).
      ملاحظة: بالنسبة للمتطوعين الذين يفضلون منصة غير قائمة على شبكة الإنترنت ولأولئك الذين يشعرون بالقلق من الكشف عن موقع GPS الخاص بهم (على سبيل المثال، أفراد المجتمع المعنيين بحالة هجرتهم)، يمكن تسليم المجموعات في موقع اجتماع متفق عليه ويطلب من المتطوعين تسجيل نسخة مكتوبة من جمع البيانات. للاتصال بين المختبر وكل مواطن عالم، يكون عضوا ثنائي اللغة في المشروع المتاحة للمكالمات الهاتفية والنصوص.
  2. مسحة ل كورونا
    1. تحديد نافذة زمنية ذات صلة وبائية لجهود أخذ العينات.
    2. بناء مجموعة تحتوي على جميع مستلزمات أخذ العينات، بما في ذلك معدات الحماية الشخصية اللازمة (أي القناع والقفازات) وبروتوكول أخذ العينات والمعلومات ذات الصلة بالسلامة البيولوجية(الشكل 2). قبل تسمية كل أنبوب مع معرف فريد معين (عينة معرف).
    3. نادرا ما يتم تطهير الأسطح التي تتعرض للرذاذ الهباء الجوي في الأسر والبيئة الحضرية.
      1. ارتداء قناع المقدمة في الأماكن العامة وزوج جديد من القفازات لجمع كل عينة لتجنب التلوث المتبادل. بعد الانتهاء من أخذ العينات، استخدم مطهر اليد المقدم.
      2. الرطب 1 سم2 البوليستر ماصة مسحة (على سبيل المثال، منصات ممسحة) مع المنظفات (على سبيل المثال، 0.5٪ الصوديوم دودسيل كبريتات (SDS)) لتعطيل الفيروس عن طريق تعطيل مغلفه وتحقيق الاستقرار في الحمض النووي الريبي عارية عن طريق تحفيز تتكشف من RNases32.
      3. مسحة سطح 10 سم2. بمساعدة مسواك، غمر تماما كل مسحة عينة في أنبوب ما قبل المسمى المقابلة التي تحتوي على 200 ميكرولتر من محلول ثيوسيانات جوانيدينيوم (GITC). تخزين الأنابيب عند درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى يتم نقلها إلى المختبر. بمجرد وصول العينات إلى المختبر، قم بتخزينها عند -80 درجة مئوية.
        ملاحظة: GITC هو مهيج سامة; تجنب ملامسة الجلد. GITC الحل بسيط لإعداد من المواد الكيميائية المختبرية المشتركة، لوصفة انظر33،34. فإنه تعطيل الفيروس، يستقر الجيش الملكي النيبالي عن طريق تناسخ RNases34،35،36، ويستقر العينات في درجة حرارة الغرفة. ومع ذلك، تشمل المجموعة حزم الثلج للحفاظ على برودة العينات دون الحاجة إلى استخدام الثلاجات المنزلية للتخزين.

2. السارس -CoV-2 الكشف

  1. عزل الحمض النووي الريبي الكلي
    1. تطهير الأسطح والمعدات، وأنابيب بمحلول من كبريتات النحاس 2 MM و 3٪ بيروكسيد الهيدروجين؛ يليه محلول من 10٪ تبييض، 90 مليون بيكربونات الصوديوم، 5٪ SDS، و 2.5٪ NaOH. مسح جيدا مع الماء المقطر تليها 75٪ الإيثانول.
      ملاحظة: هذه الحلول هي بديل للحلول المتوفرة تجاريا.
    2. تذوب العينات على الجليد. عينات دوامة لمدة 2 دقيقة بسرعة متوسطة.
    3. لزيادة سرعة الفحص، قم بمعالجة العينات في المسابح. إذا كان تجمع إيجابية، استخراج الحمض النووي الريبي من كل عينة بشكل مستقل للعثور على عينة إيجابية / ثانية. الجمع بين العينات من كل مجموعة أخذ العينات (16 المجموع) في 2 برك من 8 عينات.
      ملاحظة: وجود عينات 8 لكل تجمع يعني أن 2 فقط برك تحتاج إلى معالجة لكل عدة. إذا كان تجمع موجبة، ثم يتم إعادة معالجة عينات الفردية لتحليل RT-مصباح الفردية. وهذا يقلل من الوقت والتكاليف والكواشف.
    4. تجمع 50 ميكرولتر من كل عينة من العينات ال 8 في أنبوب طرد مركزي صغير (إجمالي الحجم 400 ميكرولتر)؛ حفظ العينة المتبقية عند -80 درجة مئوية. أضف 0.2 مجلد (80 ميكرولتر) من الكلوروفورم، دوامة لمدة 15 ثانية، ثم احتضن لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. جهاز طرد مركزي عند 13,000 × غرام لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    5. نقل طبقة مائي (السائل واضحة) في أنبوب جديد microcentrifuge. تخزين الواجهة المتبقية والسائل الوردي في الثلاجة -80 درجة مئوية. هذه الكسور تحتوي على الحمض النووي والبروتينات33،36.
    6. إضافة حجم متساو من الايزوبروبانول (~ 200 ميكرولتر) و 2.6 ميكرولتر من الجليكوجين coprecipitant (15 مل ملغ-1)37. تخلط جيدا، واحتضان في -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل، تليها 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لتسريع الحمض النووي الريبي.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا عن طريق احتضان العينات عند -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها بدلا من ساعة واحدة.
    7. جهاز طرد مركزي عند 13,000 × غرام لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. إزالة supernatant دون إزعاج بيليه. Resuspend بيليه في 50 ميكرولتر من المياه المعالجة ديثيليبيروكربونات (DEPC)، وإضافة حجم متساو (50 ميكرولتر) من RNase خالية من خلات الأمونيوم 5 M و 2.5 أحجام (250 ميكرولتر) من الإيثانول 100٪7،38.
      ملاحظة: أيونات الأمونيوم تمنع كيناز البولينوكليوتيد إذا ما استخدمت في عملية المصب38. هذا المزيج يعجل الجيش الملكي النيبالي في حين ترك الفوسفات ثلاثي الفوسفات ديوكسينوكليوسيد وoligosaccharides في الحل38.
    8. تخلط جيدا، واحتضان في -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل، تليها 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لتسريع الحمض النووي الريبي.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا عن طريق احتضان العينات عند -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها بدلا من ساعة واحدة.
    9. جهاز طرد مركزي عند 13,000 × غرام لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. غسل بيليه مع 1 مل من البرد (-20 درجة مئوية)، أدلى حديثا 75٪ الإيثانول. جهاز طرد مركزي عند 8000 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. إزالة supernatant مع ماصة P10 لتجنب إزعاج بيليه.
    10. الهواء الجاف بيليه لمدة 10-15 دقيقة حتى لا يكون هناك الإيثانول المتبقية. Resuspend بيليه في 50 ميكرولتر من المياه المعالجة DEPC، إضافة 5 ميكرولتر من 10x DNase العازلة + 1μL من DNase (2 وحدات μL-1)،واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    11. أضف 0.1 مجلد (5.6 ميكرولتر) من كاشف تعطيل DNase، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق، واخلطه برفق كل دقيقة. جهاز الطرد المركزي في 13،000 × غرام لمدة 2 دقيقة، ونقل supernatant إلى أنبوب جديد (~ 50 ميكرولتر). ضع الأنبوب على الجليد على الفور أثناء إعداد ردود فعل RT-qPCR أو RT-LAMP، أو قم بتخزينه في ثلاجة -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: إجراء عزل الحمض النووي الريبي في غرفة خالية من amplicon لتجنب التلوث المحمول.
  2. متعدد النسخ العكسي حلقة بوساطة التضخيم isothermal (RT-مصباح)
    1. إعداد حل مزيج التمهيدي 20X (الجدول 1) لكل مجموعة من التمهيديات (الجدول 2). قم بإعداد مزيج رد فعل RT-LAMP (الجدول 3) في درجة حرارة الغرفة مع حجم زائد بنسبة 10٪ لحساب فقدان الأنابيب.
      ملاحظة: مزيج رئيسي COLORImetric LAMP 2X مع القطب الجنوبي thermolabile uracil-DNA جليكوسيلاز (UDG) يمنع تضخيم تلوث الحمض النووي من ردود الفعل السابقة20،28.
    2. دوامة وتدور أسفل الخليط. الاستغناء عن 20 ميكرولتر من المزيج في كل أنبوب رد فعل: عينة، ارتفعت، والسيطرة الإيجابية، والسيطرة السلبية. احتضان ردود الفعل في الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق للسماح ل UDG للعمل على التلوث المحمول المحتمل.
    3. إضافة 5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي إلى رد فعل العينة، 5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي + 2.5 ميكرولتر (450 نسخة) من الحمض النووي الريبي الاصطناعية سارس-CoV-2 إلى رد الفعل ارتفعت، 2.5 ميكرولتر (450 نسخة) من الاصطناعية سارس-CoV-2 الجيش الملكي النيبالي إلى رد فعل السيطرة الإيجابية، و 5 ميكرولتر من H2O إلى رد فعل السيطرة السلبية. تخلط جيدا، وتدور أسفل ردود الفعل. إذابة كل الحمض النووي الريبي على الجليد.
    4. بينما يتم تسخين دراجة حرارية، أو حمام الماء، إلى 65 درجة مئوية، والسماح لجميع ردود الفعل على البقاء في درجة حرارة الغرفة. سيتم تعطيل UDG عند >50 درجة مئوية. ضع التفاعلات في المدور الحراري (استخدم غطاء الحرارة)، واحتضنها عند 65 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة، ودع التفاعلات تصل إلى درجة حرارة الغرفة (~ 22 درجة مئوية لمدة 5 دقائق)، أو تبرد على الجليد لمدة دقيقة واحدة. تحليل النتائج باستخدام ميزة colorimetric (ملاحظة بسيطة) أو عن طريق تشغيل المنتجات في هلام agarose.
      ملاحظة: على الرغم من أن حد الكشف (LOD) هو 10 نسخ لكل رد فعل، يزداد تكرار الكشف مع اقتراب رقم النسخة من 500 نسخة لكل رد فعل(الشكل 3A). بالنسبة لمراقبة قياس الألوان، لاحظ أن النتيجة السالبة يشار إليها باللون الوردي (الرقم القياسي = 8.8)، في حين تشير النتيجة الإيجابية إلى اللون الأصفر (الرقم القياسي = 5)(الشكل 3B). يتجنب خيار قياس الألوان فتح أنابيب RT-LAMP بعد التضخيم ، مما يقلل من حجم منتجات RT-LAMP في بيئة العمل والتلوث المحمول. لكهرومورفوريسيس هلام، وإعداد هلام agarose 1.5٪ مع وصمة عار هلام الحمض النووي 1X في 0.5٪ تريس / بورات / EDTA (TBE) العازلة. تحميل 25 ميكرولتر من رد الفعل + 5 ميكرولتر من 6X تحميل صبغة في كل بئر. تشغيل هلام في 100 V لمدة 60 دقيقة. لا حاجة إلى علامة جزيئية حيث تظهر العينات الإيجابية نمط سلم(الشكل 3C).

النتائج

العينات التي جمعها العلماء المواطنين للكشف عن السارس-CoV-2. وخلال فترة 8 أشهر (من منتصف مارس إلى الأسبوع الثالث من نوفمبر 2020)، تمت الموافقة على مشاركة 482 مواطنا في هذا المشروع، منهم 350 (73٪) طلب عدة. وتم تسليم ما مجموعه 362 مجموعة (أي طلب بعض المشاركين مجموعات متعددة)، و246 مجموعة (70٪) تم إرجاع (الشكل 4A, B). وقد تم تجهيز جميع العينات الواردة في هذه المجموعات، وهي 080 4 عينة. تم توزيع مواقع التجميع عبر المناطق الساحلية الشمالية والشمالية الوسطى والوسطى والجنوبية من المقاطعة ، بالإضافة إلى عدد قليل منها في المناطق الشرقية (الشكل 4A). هذه المناطق لديها أعلى كثافة سكانية في مقاطعة سان دييغو والحالات COVID-19 الأكثر توثيقا، كما ذكرت وكالة سان دييغو لخدمات الصحة البشرية39.

وطلب المواطنون استلام معظم مجموعات العينات (أي متوسط معدل النجاح: 70.4 في المائة). كل يوم، 1-16 مجموعات وطلب، وأعيدت 0-14 مجموعات إلى المختبر(الشكل 4B). وأظهرت دراسة استقصائية للعلماء المواطنين أن جمع مجموعة كاملة (16 عينة) استغرق 1-3 ساعة موزعة على مدى 8 أيام في المتوسط(الشكل 4A والجدول 4). وكانت الغالبية العظمى من مجموعات كاملة (91.1٪)، وهذا يعني أنها تحتوي على مسحة داخل جميع أنابيب العينة 16، وتم تحميل البيانات المقابلة أخذ العينات إلى LIMS(الشكل 4A والجدول 4).

الكشف عن السارس-CoV-2 باستخدام استخراج GITC-الكلوروفورم وتعدد النسخ العكسي حلقة بوساطة التضخيم isothermal (RT-مصباح). بالنسبة لمقايسات RT-LAMP ذات اللون، تم استخدام مجموعتين من البرايمرات11و20و28 لاستهداف النواة(N2)والمغلف(E1)الجينات (الجدول 2). التسلسلات المعترف بها من قبل هذه التمهيديات هي في نفس المنطقة كما التمهيديات والتحقيقات التي وافقت عليها CDC40 والاتحاد الأوروبي (الاتحاد الأوروبي)41 للتشخيص البشري ل COVID-19 من قبل RT-qPCR. وتؤكد هذه النتائج ما وصفه تشانغ وآخرون28، حيث أن إضافة هيدروكلوريد جوانيدين 60 مليون متر إلى التفاعل يزيد من ال LOD عند تشغيله في تعدد. وكان اللد على تردد 100٪ 500 نسخة لكل 25 ميكرولتر رد فعل (الشكل 3A،B). في COLORImetric RT-LAMP، تغيرت العينات الإيجابية اللون من الوردي إلى الأصفر بسبب تحول الرقم القياسي من ~8 إلى 5.5 (الشكل 3B). عندما تحول رد الفعل البرتقالي في أرقام منخفضة النسخ، تم تشغيل عينات في هلام agarose 1.5٪ للتأكد من أن هذه كانت إيجابية وأسفر عن نمط يشبه سلم (الشكل 3C). تم استخدام RT-LAMP للكشف عن السارس-CoV-2 في عينات الحمض النووي الريبي المجمعة.

وللسيطرة على السلبيات الكاذبة بسبب مثبطات التفاعل، تم اختبار كل عينة في رد فعل إضافي ارتفع مع 500 نسخة من السارس الاصطناعية-CoV-2. تم فصل العينات المجمعة الإيجابية عن طريق عزل الحمض النووي الريبي لكل عينة فردية في المسبح وتشغيلها في رد فعل RT-LAMP لتحديد هوية العينة الإيجابية. ثم تم تحميل نتائج الكشف إلى نظام تحديد المواقع حيث تم إقران معرف العينة الفريد بالمعلومات المتعلقة بالتاريخ والوقت وإحداثيات GPS والموقع وصورة العينة.

في الوقت الحقيقي والتقليدية RT-PCR الأساليب: تثبيط بواسطة عينات الملوثات. ولتحديد أفضل طريقة مناسبة لخط الأنابيب المقترح للكشف، تم اختبار أساليب أخرى لتضخيم الحمض النووي الريبي مع عينات بيئية جمعتها مجموعة تجريبية من العلماء المواطنين. وترد أمثلة على نتائج كل من هذه الطرق في الشكل 5 لتصوير حساسيتها للمثبطات البيئية وضوضاء إشارة الخلفية بتركيزات منخفضة الفيروسية عدد النسخ.

وجرى اختبار ست تركيبات من نوع RT-qPCR (جدول المواد) وافق عليها مركز السيطرة على الأمراض والوقاية منها ومنظمة الصحة العالمية للكشف عن الفيروس في عينات بيئية. تم اتباع البروتوكولات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وكذلك المبادئ التوجيهية لمركز السيطرة على الأمراض للكشف عن السارس-CoV-2 في البيئات السريرية40. وارتفعت ردود الفعل التي تحتوي على تركيزات مختلفة من الضوابط الاصطناعية سارس-CoV-2 الجيش الملكي النيبالي في عينات سطح مسحت بعد عزل الحمض النووي الريبي الخام. وكانت جميع يمزج الرئيسية حساسة لمثبطات في تركيزات اللد من السيطرة الإيجابية (الشكل 5A).

لتجاوز مثبطات هذه التقنيات في الوقت الحقيقي ، تم اختبار نظام RT-PCR التقليدي. تم استخدام نظام RT-PCR من خطوة واحدة (جدول المواد) لتضخيم جين النوى باستخدام مجموعات التمهيدي N1، N2، وجين المغلف باستخدام مجموعة التمهيدي E1 المعتمدة من قبل CDC (الولايات المتحدة) وECDC (الاتحاد الأوروبي) ، على التوالي (الجدول 2). تم اتباع البروتوكولات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وكذلك المبادئ التوجيهية لمركز السيطرة على الأمراض للكشف عن السارس-CoV-2 في البيئات السريرية40. التمهيدي مجموعات N1 و N2 التي صممها مركز السيطرة على الأمراض تسفر عن منتج ~ 70 نقطة أساس؛ ومع ذلك، لم يتم تمييز ايجابيات عدد النسخة المنخفضة من الضجيج الخلفية تضخيم السيطرة السلبية (الشكل 5B)، والتي أدخلت إيجابيات كاذبة في النتائج. وكان نتاج التمهيديات E1 إشارة ضعيفة في عدد نسخة منخفضة ( الشكل5B)، وإدخال السلبيات كاذبة في النتائج. وعلاوة على ذلك، فإن طريقة RT-PCR التي تم اختبارها لا تزال حساسة للمثبطات الموجودة في العينات البيئية (البيانات غير مبينة).

وقد تم تطوير طرق أخرى للكشف عن كميات صغيرة جدا من تسلسل الهدف. واحدة من هذه الطرق هي تضخيم الدائرة المتداول (RCA) ، وعندها الاعتراف بالتسلسل المستهدف ، أو الحمض النووي الريبي ، من خلال مسبار خطي محدد ، يقوم الليجيز بتدوير القالب. باستخدام التمهيديات المصممة للتهجين مع المسبار ، فإن بوليمرات الحمض النووي مع نشاط إزاحة الخيط تضخم المسبار في تفاعل isothermal42. هو المسبار الذي حدد الهدف، الذي يتم تضخيمه، وليس التسلسل المستهدف، مما يجعل هذه الطريقة حساسة للغاية43. نشر وانغ وآخرون44 بروتوكولا للكشف المباشر عن الحمض النووي الريبي سارس-CoV-1. تم تعديل هذه الطريقة لاستخدام المبرمجين محددة للسارس-CoV-2. لسوء الحظ ، في التحكم غير القالب (NTC) ، يقوم المسبار بتعميم المنتج وأسفرت عنه في غياب قالب الحمض النووي الريبي ، حتى عند استخدام مجموعة واسعة من الليجا ، بما في ذلك الليجا الحساسة ل SNP. في غياب ليغان، لم يظهر المجلس الانتقالي تضخيما من المسبار الخطي (الشكل 5C).

figure-results-6662
الشكل 1: منصة أخذ العينات على شبكة الإنترنت مع واجهة بيانات جمع العينات للأجهزة المحمولة. (أ) تم إنشاء موقع على شبكة الإنترنت يحتوي على مكون إضافي متعدد اللغات للتوسط في التفاعل بين المختبر والعلماء المواطنين. وقد استخدم النظام الأساسي في طلب تسليم/التقاط العينات وتقديم عينات من البيانات. وتضمنت المنصة بروتوكولات تفصيلية للرسم البياني والسمعي البصري باللغة الإنكليزية/الإسبانية. (ب) عرض الجهاز المحمول المستخدمة لتحميل بيانات العينة: التاريخ والوقت وإحداثيات GPS، وصف موقع العينة، وصورة لموقع المجموعة. المختصرات: سارس-CoV-2 = فيروس كورونا متلازمة الجهاز التنفسي الحاد الوخيمة 2; نظام تحديد المواقع العالمي (GPS) = نظام تحديد المواقع العالمي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7674
الشكل 2: مجموعة العينات. تلقى العلماء المواطنين برودة تحتوي على اثنين من حزم الجليد، ورقة بيانات السلامة لإعلام المتطوعين حول مخاطر التعامل مع حل GITC، وأخذ العينات التفصيلية وبروتوكول ارتداء القناع، قناع KN95، كيس النفايات، زجاجة رش مع مطهر اليد، وزجاجة رذاذ مع 0.5٪ SDS، 16 زوجا من القفازات، وحقيبة صغيرة مع 16 مسواك و 16 مسحات البوليستر، 16 أنابيب الطرد المركزي الدقيق المسمى مسبقا تحتوي على 200 ميكروغرام من محلول GITC، مربع يحتوي على أنابيب أخذ العينات، وحقيبة تستخدم كحاوية ثانوية لصندوق الأنبوب في حالة حدوث تسرب. الاختصارات: GITC = جوانيدينيوم ثيوسياناتي; SDS = كبريتات دودسيل الصوديوم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8600
الشكل 3: متعدد النسخ العكسي حلقة بوساطة التضخيم Isothermal (RT-مصباح) المقايسة. ردود الفعل متعددة الفأس باستخدام التمهيديات للسارس-CoV-2 nucleocapsid(N2)ومغلف(E1)الجينات للكشف عن عدد قليل من 10 نسخ من الفيروس في رد الفعل. تم استخدام الحمض النووي الريبي الاصطناعي سارس-CoV-2 كتحكم إيجابي. (أ)تردد الكشف في multix colorimetric RT-LAMP من سارس-CoV-2 في أرقام نسخ الجينوم مختلفة لكل رد فعل. متوسط قيمة خمس نسخ متماثلة باللون الوردي. (ب)الحد من الكشف (LOD) من سارس-CoV-2 في متعدد colorimetric RT-مصباح; الأصفر = موجب (درجة الحموضة ~ 5)؛ الوردي = السلبية (pH ~ 8). (ج) نمط سلم من إيجابية سارس-CoV-2 RT-مصباح ردود الفعل في 1.5٪ agarose هلام electrophoresis. المختصرات: سارس-CoV-2 = فيروس كورونا متلازمة الجهاز التنفسي الحاد الوخيمة 2; rxn = رد الفعل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-9744
الشكل 4: موقع مجموعات أخذ العينات من العلماء المواطنين في مقاطعة سان دييغو ومعدل نجاح المجموعات المطلوبة. (أ) تمثل النقاط البرتقالية موقع مجموعة عينات واحدة ، والتي تحتوي على 16 عينة. ويبين الرسم البياني الدائري الأزرق النسبة المئوية للأطقم التي استغرقت أياما مختلفة منذ تسليمها إلى العلماء المواطنين إلى وقت إعادتها إلى المختبر. عدد الأيام بين قوسين. ويبين الرسم البياني الدائري البرتقالي النسبة المئوية للمجموعات التي بها عدد مختلف من العينات المكتملة من ما مجموعه 16 عينة. عدد العينات المكتملة التي تحتوي على مسحة داخل أنبوب العينة وبيانات أخذ العينات المقابلة التي تم تحميلها إلى LIMS بين قوسين. (ب)النسبة المئوية للمجموعات التي أعيدت إلى المختبر (النقاط)، والعدد الإجمالي للمجموعات المطلوبة (القضبان)، بالنسبة إلى تاريخ طلب المجموعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-10850
الشكل 5: طرق بديلة للسارس-كوف-2 RNAdetection. (أ) RT-qPCR الكشف عن السارس-CoV-2 nucleocapsid (N) الجينات باستخدام مجموعة التمهيدي N2. وارتفعت العينات البيئية المجمعة ب 900 نسخة (خضراء) أو 9 نسخ (برتقالية) من فيروس سارس-كوف-2. عناصر تحكم موجبة لنفس أرقام النسخ باللون الأزرق. السهم يشير إلى انخفاض في الكشف عن الفلورية من انخفاض عدد نسخة السيطرة الإيجابية عندما عينة بيئية موجودة. (ب) الكشف التقليدي عن RT-PCR للسارس-CoV-2. أعلى: RT-PCR المنتجات من الجين nucleocapsid باستخدام مجموعات التمهيدي N1 و N2. ملاحظة إشارة خلفية باهتة في عنصر التحكم بدون قالب. أسفل: RT-PCR المنتجات من الجين المغلف باستخدام مجموعة التمهيدي E1. لوحظت إشارة منخفضة جدا في تركيز ال LOD. الأسهم الزرقاء تظهر المنتج الإيجابي المتوقع: (أعلى) ~ 70 نقطة أساس و (أسفل) 113 نقطة أساس في 2٪ agarose هلام الكهربائي. (ج) RCA من سارس-CoV-2 RNA. التحقيق الدائري تضخيم في وجود ليغاني وغياب قالب الجيش الملكي النيبالي (المجلس الوطني الانتقاليحول); في غياب ligase و الجيش الملكي النيبالي قالب التحقيق الخطي لا تضخيم (NTCلين). المختصرات: سارس-CoV-2 = فيروس كورونا متلازمة الجهاز التنفسي الحاد الوخيمة 2; RFU = وحدات الفلورسينس النسبية؛ bp = أزواج أساسية; rxn = رد فعل; MM = علامة الجزيئية; RT-PCR = عكس النسخ البوليميراز سلسلة من ردود الفعل; RT-qPCR = في الوقت الحقيقي الكمية RT-PCR; RCA = تضخيم دائرة المتداول; NTC = عنصر تحكم بدون قالب; LOD = حد الكشف؛ rxn = رد الفعل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

التمهيديتركيز 20X (ميكرومتر)تركيز 1X (ميكرومتر)
FIP321.6
BIP321.6
F340.2
B340.2
LoopF80.4
لوب80.4

الجدول 1: صياغة لمزيج التمهيدي RT-LAMP 20X. في رد فعل RT-LAMP ، يتعرف 6 مقترئات على 8 مناطق من الحمض النووي المستهدف. الاختصارات: عكس النسخ حلقة بوساطة التضخيم isothermal; FIP = التمهيدي الداخلي الأمامي؛ BIP = التمهيدي الداخلي الخلفي; F3 = التمهيدي الإزاحة إلى الأمام; B3 = التمهيدي الإزاحة الخلفية; LoopF = التمهيدي حلقة إلى الأمام؛ LoopB = التمهيدي حلقة إلى الوراء.

التمهيديتسلسلهدفحجم المنتج
RT-مصباح9,18,19
E1-F3غاغتاكاغاكتاتاتاكتاتاكاتEنمط يشبه السلم
E1-B3تكاغاتتاتاكاغاغاغت
E1-FIPأكاغاغااغاغاغاغاتكغاتغاغاغاغ
E1-BIPتيكتاغاتاتاتاتاغاكتاكتاغتاغاكجت
E1-LoopBجي جي سيكتاتكاتغاتغت جي جي جي تي
E1-LoopFكجكتاتاتاكاتاكتاتاكج
N2-F3أجاجاغاكتاتاكاغن
N2-B3غاكتاتكتاتغاوتاغتغاتCT
N2-FIPTTCCGAAGAACGCTGAGاجاجاكتاكاتاجاكسيتش
N2-BIPكغكاتاغكاتغاغاتااتغاتغاتغكتغتغتا
N2-LoopFغغغكاكااتغغتغكااتغ
N2-لوبCTTCGGGAاكغتغتك
RT-qPCR38
2019-nCoV_N1-Fغاكاكااتكاغغااتن72 نقطة أساس
2019-nCoV_N1-Rتكتغكتاتغكاتكاتغاكتغ
2019-nCoV_N1-P5'-فام-ACC CCG القط TAC GTT TGG TGG ACC-BHQ1-3'
2019-nCoV_N2-Fتاكاكاتشكاغاكان67 نقطة أساس
2019-nCoV_N2-Rجي جي سي جيغاكاتكاتغاغاغا
2019-nCoV_N2-P5'-FAM-ACA ATT TGC CCC CAG CGC TTC AG-BHQ1-3'
RT-PCR39
E1_Sarbeco_FأغاغتاكجاتاغاتاغاغاغتE113 نقطة أساس
E1_Sarbeco_Rأتاتغاغاغجاجتاكاكاكا

الجدول 2: التهيئة المستخدمة في RT-LAMP وRT-qPCR وRT-PCR. يتم سرد تسلسلات التمهيدي، الجين الهدف، حجم المنتج المتوقع، والمرجع المقابل. الاختصارات: RT-LAMP = النسخ العكسي الحلقي بوساطة التضخيم الحراري؛ RT-PCR = عكس النسخ البوليميراز سلسلة من ردود الفعل; bp = أزواج أساسية; RT-qPCR = في الوقت الحقيقي الكمية RT-PCR; E1 = جين المغلف; N2 = جين النوكليوكابسيد; F = التمهيدي الأمامي؛ R = التمهيدي العكسي; P = التحقيق; FIP = التمهيدي الداخلي الأمامي؛ BIP = التمهيدي الداخلي الخلفي; F3 = التمهيدي الإزاحة إلى الأمام; B3 = التمهيدي الإزاحة الخلفية; LoopF = التمهيدي حلقة إلى الأمام؛ LoopB = التمهيدي حلقة إلى الوراء.

الكاشفحجم الصوت (ميكرولتر)
WarmStart Colorimetric مصباح 2X ماجستير ميكس مع UDG12.5
N2 التمهيدي ميكس (20x)1.25
E1 التمهيدي ميكس (20x)1.25
جوانيدين هيدروكلوريد (600 متر في اليوم)*2.5
الهدف الجيش الملكي النيبالي5
خالية من النيوكليز H2O2.5
إجمالي حجم التداول25

الجدول 3: مزيج التفاعل الرئيسي لتعدد الألوان RT-LAMP. (*) وقد ثبت Guanidine هيدروكلوريد لزيادة حساسية وسرعة رد الفعل من قبل آلية غير مطهرة28. الاختصارات: مصباح = التضخيم isothermal بوساطة حلقية; UDG = uracil-DNA الجليكوسيلاز; N2 = جين النوكليوكابسيد; E1 = جين المغلف; DEPC = ديثيلبيروبونات.

المواطنون المعتمدونالمواطنون الذين طلبوا عدةمجموعات تسليمهامجموعات عينات تم إرجاعهاأيام مخصصة لأخذ العينات٪ مجموعات كاملة٪ مجموعات غير مكتملةعينات معالجة
48272.6% (350/482)36270.4% (255/362)دني891.1 (224/246)8.9 (22/246)4,080
متوسط3

الجدول 4:المسح للسارس-CoV-2 بالأرقام. معدلات نجاح التوعية وأخذ العينات. اختصار: سارس-CoV-2 = فيروس كورونا متلازمة الجهاز التنفسي الحاد الوخيمة 2.

Discussion

مشاركة المواطنين العلماء. وتم تجنيد علماء مواطنين لمسح الأسطح فى جميع انحاء محافظة سان دييجو لعينة واكتشاف وجود السارس - كوف - 2 فى البيئة الحضرية . وغالبية مجموعات أخذ العينات المسلمة (70 في المائة) وأعيدت جميع العينات تقريبا إلى المختبر، واكتمت الانتهاء من جميع هذه العينات (91 في المائة) (الشكل3 ألفوباء والجدول 4). ويمكن للمتطوعين أن يطلبوا بسهولة تسليم/استلام المعدات من خلال المنصة القائمة على شبكة الإنترنت، وأخطر برنامج تخطيط طرق التسليم العلماء المواطنين بالأوقات المقدرة للوصول، وكلاهما من المرجح أن يكونا عاملين هامين للنجاح الملحوظ. متوسط الوقت من عندما تم تسليم عدة إلى المواطن العالم إلى عندما عاد إلى المختبر كان 8 أيام، مع متوسط 3 أيام ومجموعة من 1-64 يوما (الشكل 3A والجدول 4). ومن المرجح أن تؤدي رسائل التذكير الأكثر تواترا للمتطوعين إلى تقليل هذا التأخير الزمني.

تم استخدام منصة جمع البيانات بنجاح من قبل الغالبية العظمى من المستخدمين (73٪) من المستخدمين (73٪) من المستخدمين (1999). (الجدول 4). وفي حين لم يتم قياس جهود العلماء المواطنين، أظهرت الاختبارات الميدانية أن منصة جمع البيانات قللت بشكل كبير من الجهد والوقت اللازمين لإكمال جمع العينات بشكل صحيح. وبالتالي، فإن تخفيض كمية مسك الدفاتر شجع المواطنين على المشاركة في العلماء. وكان الهدف من المنصة القائمة على شبكة الإنترنت هو التغلب على القيود الديمغرافية من خلال توفير خدمة ترجمة آلية عصبية متعددة اللغات وتوفير بروتوكولات بيانية وبصرية باللغتين الإنجليزية والإسبانية. وكان هذا ناجحا جزئيا فقط حيث تم جمع عينات أقل من كل من الخليج الجنوبي والمقاطعة الشمالية حيث يقيم معظم سكان المقاطعة من أصل إسباني / لاتيني45. كما تضم هذه المناطق 63٪ (1,700 حالة لكل 100,000) من إجمالي حالات COVID-19 في مقاطعة سان دييغو مع أعلى معدل انتشار للمرض46 ومعدل دخول المستشفيات (62٪) وبالرغم من ان معظم العينات جاءت من محافظة سنترال ، الا انه تم جمع عدد ممثل من اكثر المناطق تأثرا بالسارس - 19 ، وان جزءا صغيرا فقط من العينات كان ايجابيا ، مما يشير الى ان الخزانات السطحية للسارس - كوف - 2 فى البيئة الحضرية نادرة نسبيا .

معالجة العينة. تم ترطيب مسحات أخذ العينات مع SDS ، والتي عطلت الفيروس عن طريق تعطيل مغلفه واستقرت الحمض النووي الريبي العاري من خلال الكشف عن RNases32. بشكل مريح أثناء الجمع ، قام المنظفات في المسحة بتنظيف السطح الذي تم أخذ عينات منه. العينات البيئية غالبا ما تحتوي على كميات صغيرة جدا من الحمض النووي الريبي. ولتعظيم الاسترداد، تم إجراء عزل الحمض النووي الريبي باستخدام طريقة استخراج خام تستند إلى GITC وخالية من الأعمدة. GITC, عامل chaotropic قوية, يعطل الروابط الهيدروجين التي تحافظ على البروتين للطي (أي تأثير مسعور). ينتج عن هذا الإجراء تعطيل الجسيمات الفيروسية ، ويظل الحمض النووي الريبي مستقرا بسبب تثبيط الحمض النووي الريبي34و35و36. حافظ حل GITC على استقرار عينات الحمض النووي الريبي دون اعتبارات صارمة في السلسلة الباردة ، مما سمح للمواطنين بالحفاظ على العينات في درجة حرارة الغرفة إذا لم يكن هناك ثلاجة لحزم الثلج المقدمة. ولتقليل الخطر المحتمل الذي يشكله هذا الكاشف عند حدوث اتصال مباشر بالجلد أو المخاط، تم توعية المواطنين بهذه المخاطر من خلال إدراج ورقة بيانات السلامة المادية المقدمة في المجموعة ووضع ختم تحذير في الصندوق الذي يحتوي على الأنابيب.

ساعدت طريقة استخراج GITC-chloroform الخام على استعادة آثار الحمض النووي الريبي من المسحات ، وكما هو مبين في تضخيم العينات ارتفعت ، نادرا ما استمرت المثبطات في العينات بعد الاستخراج. العينات، التي كانت سلبية للسارس-CoV-2 وأظهرت أي تثبيط RT-مصباح، تمثل السلبيات الحقيقية أو كان عدد نسخة أقل من LOD في 100٪ التردد. وعلى العكس من ذلك، فإن الكشف عن الحمض النووي الريبي الفيروسي على السطح لا يعني مباشرة خطر انتقال العدوى عن طريق الاتصال حيث أن عدوى الفيروس من العينات الإيجابية تحتاج إلى اختبار. والفحص السريع للبيئة، الذي لا يقتصر على توافر الإمدادات المتطورة أو الموظفين المؤهلين تأهيلا عاليا، أمر حاسم لتقييم ما إذا كانت الأسطح تشكل خزانا فيروسيا ولزيادة توجيه جهود الوقاية والاحتواء.

وقد تم اختيار RT-LAMP لتكون أفضل طريقة مناسبة لخط أنابيب الكشف المقترح. وقد ثبت أنها طريقة سريعة وغير مكلفة كانت شديدة المقاومة لمعظم المثبطات المتبقية وحساسة ومحددة مثل طرق RT-qPCR الأخرى. وبسبب استخدامها في البيئات السريرية أثناء جائحة السارس-CoV-2، تأثر توافر مجموعات RT-qPCR بالطلب العالمي. وعلاوة على ذلك، كانت تقنيات RT-qPCR – حتى تلك التي صيغت لمقاومة المثبطات – حساسة للمواد الواردة في العينات البيئية التي جمعتها مجموعة تجريبية من العلماء المواطنين، حتى بعد استخدام استراتيجيات مشتركة أخرى للحد من المنافسة المثبطة للإنزيم الملزم49. وتؤيد هذه النتائج دراسة حديثة قارنت كلا الطريقتين للكشف عن السارس-CoV-2 على عينات مسحة من الحلوى التي يتعامل معها مرضى COVID-19 ووجدت أكثر من 83٪ نتيجة التوافق، مع تثبيط أقل بنسبة 25٪ في العينات التي حللها RT-LAMP15. وعلاوة على ذلك، فإن استخراج النفط الخام GITC-الكلوروفورم، إلى جانب RT-LAMP، خفض تكلفة الكواشف والإمدادات بنسبة 42٪ مقارنة باستخراج عدة الحمض النووي الريبي وRT-qPCR (جدول المواد).

سمحت هذه الطريقة بتحليل الإنتاجية العالية لآلاف عينات المسحة السطحية. وقد تم تجهيز ما يصل إلى 80 بركة، تمثل 640 عينة، في يومين من استخراج الحمض النووي الريبي إلى الكشف عن السارس-CoV-2 بواسطة RT-LAMP. البروتوكول المقترح شبه مهم، ويقتصر على الكشف عن الحمض النووي الريبي الفيروسي، ولا يشير إلى وجود جزيئات فيروسية عدوى. ويلزم إجراء مزيد من التحليل لتقييم خطر انتقال فيروس سارس-كو-2 من الفوميتات المصابة الموجودة على الأسطح المسحة.

تقدم هذه الدراسة بروتوكولا لوضع استراتيجية اختبار بسرعة تتضمن سير عمل فعال عند مواجهة حالة طوارئ صحية مع مرض معدي. وبروتوكول أخذ العينات المقترح بسيط ويستخدم الإمدادات التي توجد عادة في الأسر المعيشية، ويتم تنفيذ طريقة الكشف الفيروسي على المعدات المتاحة في البيئات المختبرية الأساسية مثل حمام المياه بدلا من الدراج الحراري. تكاليف كواشف RT-LAMP أقل بكثير من تلك اللازمة لRT-qPCR وأقل عرضة لسيناريوهات الطلب العالمي المرتفعة. وتعمل هذه الدراسة إطارا لتقييم الخزانات الفيروسية البيئية في الفاشيات الوبائية والأوبئة العالمية في المستقبل.

Disclosures

ويعلن جميع المؤلفين أنه لا توجد مصالح متنافسة.

Acknowledgements

نشكر محققي معهد المعلومات الفيروسية (السابع)، الدكتورة أنكا م. سيغال، ويلو سيغال، وباتريشيا ل. روهوير، وغاري روهوير، وكاري ل. روهوير، وماغدا سيلفيا بينيتا، وإليزابيث كروز كانو، والدكتور غريغوري بيترز، والدكتور ستيوارت أ. ساندين، والدكتورة جنيفر سميث لأخذهم الوقت لجمع عينات عديدة. كما نشكر الدكتور روب نايت، والدكتور جاك جيلبرت، والدكتور بيدرو بالدا فيري، والدكتورة سارة ألارد من قسم طب الأطفال في كلية الطب بجامعة سان دييغو كاليفورنيا (UCSD) لتسهيل الضوابط الإيجابية وردود الفعل المفيدة. نشكر ستايسي كاروتا (كلية العلوم في جامعة SDSU) وجينا سبيدل (SDSU) على الدعم اللوجستي وخوان رودريغيز على التصميم الفني والرسمي لبروتوكول أخذ العينات. نشكر جميع المشاركين على التزامهم وتفانيهم في هذا المشروع خلال الأوقات الصعبة للغاية. وقد دعم هذا العمل تبرع سخي من الدكتور جو آن لين (كلية العلوم في جامعة SDSU) والمؤسسة الوطنية للعلوم RAPID: الخزانات البيئية لمنحة SARS-CoV-2 (رقم الجائزة: 2030479).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
SMP, LIMS, and community outreach:
Authentication Application Programming InterfaceGoogleGoogle Sign-In
Commercial hosting platformGoDaddy
Data Charting Application Programming InterfaceGoogleGoogle Charts
Database softwareMySQL 
Delivery route planning software CircuitCircuit for Teams
Free email serviceGoogleGoogle Email
Geospatial Application Programming InterfaceGoogleGoogle Maps API
Multilingual neural machine translation serviceGoogleGoogle Translate
Online formGoogleGoogle Form
Operating systemLinux
Web and database development Big Rose Web Design
Web server softwareApache 
Sampling kit:
CoolersColeman (Amazon)B00363X3F2Cost (US$) per 100 rxns: 70
Gallon Ziploc bagsSolimo (Amazon)B07BJ495GLCost (US$) per 100 rxns: 18
Glycerol (hand sanitizer)FischerScientificG33-4Cost (US$) per 100 rxns: 9
Ice packsIce-Brix (Amazon)B075GLD3X1Cost (US$) per 100 rxns: 110
Isopropanol (hand sanitizer)FischerScientificAA36644K7Cost (US$) per 100 rxns: 43
KN95 masksEcho-SigmaEcho-SigmaCost (US$) per 100 rxns: 400
Paper for Protocols and Trizol Safety SheetOffice Depot348037Cost (US$) per 100 rxns: 36
30 mL spray bottles (SDS and hand sanitizer)Anyumocz (Amazon)B07T64FHXRCost (US$) per 100 rxns: 80
RNase, DNase, DNA & PCR inhibitors free Microcentrifuge tubesGenesee Scientific22-281Cost (US$) per 100 rxns: 83
Sample ID solvent resistant labelsLABTAGXST-10C1-1WHCost (US$) per 100 rxns: 68
Swiffer WetJet pads (swabs)Swiffer (Amazon)B001F0RBT2Cost (US$) per 100 rxns: 8
ToothpicksKitchen Essential (Amazon)B00PBK4NG6Cost (US$) per 100 rxns: 8
Trizol Reagent (guanidinium isothiocyanate solution - GITC), not LSInvitrogen15596018Cost (US$) per 100 rxns: 40
Tube boxesGenesee Scientific21-119Cost (US$) per 100 rxns: 180
Small Ziploc bagsZiploc (Amazon)B01LRKEI9KCost (US$) per 100 rxns: 8
Zebra Thermal Transfer Desktop Printer ZebraGK420t
Total Sampling kit Cost (US$) per 100 rxns: 1,160
Trizol RNA extraction:
Ammonium Acetate RNase-freeInvitrogenAM9070GCost (US$) per 100 rxns: 2
ChloroformFisherScientificC298-500Cost (US$) per 100 rxns: 2
GlycoBlue (glycogen 15 mg/mL)InvitrogenAM9515Cost (US$) per 100 rxns: 80
Molecular-grade absolute (200 proof) EthanolFisherScientificBP2818500Cost (US$) per 100 rxns: 30
Molecular-grade IsopropanolFisherScientificBP2618500Cost (US$) per 100 rxns: 3
TURBO DNA-free Kit InvitrogenAM1907Cost (US$) per 100 rxns: 110
Multiplexed colorimetric RT-LAMP:
Guanidine HydrochlorideAlfa AesarAAJ6548522Cost (US$) per 100 rxns: 1
RT-LAMP E1-PrimersIDTn/aCost (US$) per 100 rxns: 7
RT-LAMP N2-PrimersIDTn/aCost (US$) per 100 rxns: 7
Synthetic SARS-CoV-2 RNAATCCVR-3276SDCost (US$) per 100 rxns: 14
WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix with UDGNEBM1800SCost (US$) per 100 rxns: 210
Eppendorf Mastercycler Pro Thermal CyclerEppendorf950030010
Total Trizol RNA extraction + LAMP Cost (US$) per 100 rxns: 470
Kit for RNA extraction:
QIAamp DSP Viral RNA Mini KitQiagen61904Cost (US$) per 100 rxns: 570
RT-qPCR:
Synthetic SARS-CoV-2 RNAATCCVR-3276SDCost (US$) per 100 rxns: 14
TaqMan Fast Virus 1-Step Master MixApplied Biosystems4444432Cost (US$) per 100 rxns: 180
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) N1,N2 Primers and ProbesIDT10006713Cost (US$) per 100 rxns: 20
qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMixQuantabio95132-100
QuantiNova Pathogen Qiagen208652
QuantiNova ProbeQiagen208352
UltraPlex 1-Step ToughMix Quantabio95166-100
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection SystemBioRad1855196
Kit for RNA extraction + RT-qPCR Cost (US$) per 100 rxns: 790 
RT-PCR:
SuperScript IV One-Step RT-PCR Invitrogen12594025
Lab cleanup:
DNAZapInvitrogenAM9890
RNAZapInvitrogenAM9780

References

  1. Alsved, M., et al. Exhaled respiratory particles during singing and talking. Aerosol Science and Technology. 54 (11), 1245-1248 (2020).
  2. Morawska, L., Cao, J. Airborne transmission of SARS-CoV-2: The world should face the reality. Environment International. 139, 105730 (2020).
  3. Stadnytskyi, V., Bax, C. E., Bax, A., Anfinrud, P. The airborne lifetime of small speech droplets and their potential importance in SARS-CoV-2 transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (22), 11875-11877 (2020).
  4. Yu, I. T. S., et al. Evidence of Airborne Transmission of the Severe Acute Respiratory Syndrome Virus. New England Journal of Medicine. 350 (17), 1731-1739 (2004).
  5. Coronavirus disease (COVID-19): How is it transmitted. World Health Organization Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/question-and-answers-hub/q-a-detail/coronavirus-disease-covid-19-how-is-it-transmitted (2020)
  6. How COVID-19 Spreads. Centers for Disease Control and Prevention Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/prevent-getting-sick/how-covid-spreads.html (2020)
  7. Moriarty, L. F., et al. Public Health Responses to COVID-19 Outbreaks on Cruise Ships - Worldwide, February-March 2020. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (12), 347-352 (2020).
  8. Cheng, V. C. -. C., et al. Air and environmental sampling for SARS-CoV-2 around hospitalized patients with coronavirus disease 2019 (COVID-19). Infection Control and Hospital Epidemiology. , 1-8 (2020).
  9. Van Doremalen, N., et al. Aerosol and surface stability of SARS-CoV-2 as compared with SARS-CoV-1. New England Journal of Medicine. 382 (16), 1564-1567 (2020).
  10. Liu, Y., et al. Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals. Nature. 582, 557-560 (2020).
  11. Butler, D. J., et al. Shotgun transcriptome and isothermal profiling of SARS-CoV-2 infection reveals unique host responses, viral diversification, and drug interactions. bioRxiv. , (2020).
  12. Döhla, M., et al. SARS-CoV-2 in environmental samples of quarantined households. medRxiv. , (2020).
  13. Ikonen, N., et al. Deposition of respiratory virus pathogens on frequently touched surfaces at airports. BMC Infectious Diseases. 18, 437 (2018).
  14. Chia, P. Y., et al. Detection of air and surface contamination by SARS-CoV-2 in hospital rooms of infected patients. Nature Communications. 11 (1), 2800 (2020).
  15. Salido, R. A., et al. Handwashing and detergent treatment greatly reduce SARS-CoV-2 viral load on Halloween candy handled by COVID-19 patients. mSystems. 5, 01074 (2020).
  16. Chan, J. F. W., et al. Improved molecular diagnosis of COVID-19 by the novel, highly sensitive and specific COVID-19-RdRp/Hel real-time reverse transcription-PCR assay validated in vitro and with clinical specimens. Journal of Clinical Microbiology. 58 (5), 00310-00320 (2020).
  17. Dao Thi, V. L., et al. A colorimetric RT-LAMP assay and LAMP-sequencing for detecting SARS-CoV-2 RNA in clinical samples. Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).
  18. Rauch, J., et al. A scalable, easy-to-deploy, protocol for Cas13-based detection of SARS-CoV-2 genetic material. bioRxiv. , (2020).
  19. . A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics Available from: https://www.broadinstitute.org/files/publications/special/COVID-119%20detection%20(updated) (2020)
  20. Zhang, Y., et al. Rapid molecular detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) virus RNA using colorimetric LAMP. medRxiv. , (2020).
  21. Zhang, Y., et al. Enhancing colorimetric loop-mediated isothermal amplification speed and sensitivity with guanidine chloride. BioTechniques. 69 (3), 179-185 (2020).
  22. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nature Biotechnology. 38, 870-874 (2020).
  23. Lucia, C., Federico, P. -. B., Alejandra, G. C. An ultrasensitive, rapid, and portable coronavirus SARS-CoV-2 sequence detection method based on CRISPR-Cas12. bioRxiv. , (2020).
  24. Danko, D., et al. Global genetic cartography of urban metagenomes and anti-microbial resistance. bioRxiv. , (2020).
  25. Parida, M., et al. Rapid detection and differentiation of dengue virus serotypes by a real-time reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification assay. Journal of Clinical Microbiology. 43 (6), 2895-2903 (2005).
  26. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic acids research. 28 (12), 63 (2000).
  27. Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
  28. Zhang, Y., et al. Enhancing colorimetric loop-mediated isothermal amplification speed and sensitivity with guanidine chloride. BioTechniques. 69 (3), 179-186 (2020).
  29. Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. Visual detection of isothermal nucleic acid amplification using pH-sensitive dyes. BioTechniques. 58 (2), 59-68 (2015).
  30. Curtis, K. A., Rudolph, D. L., Owen, S. M. Rapid detection of HIV-1 by reverse-transcription, loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). Journal of Virological Methods. 151 (2), 264-270 (2008).
  31. OAuth 2.0. Internet Engineering Task Force (IETF Available from: https://oauth.net/2/ (2012)
  32. Naidu, K. T., Prabhu, N. P. Protein-surfactant interaction: Sodium dodecyl sulfate-induced unfolding of ribonuclease A. Journal of Physical Chemistry B. 115 (49), 14760-14767 (2011).
  33. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
  34. Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: Twenty-something years on. Nature Protocols. 1 (2), 581-585 (2006).
  35. Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol® extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-472 (2007).
  36. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
  37. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Ethanol precipitation of RNA and the use of carriers. Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
  38. Wallace, D. M. Precipitation of nucleic acids. Methods in Enzymology. 152, 41-48 (1987).
  39. COVID-19 Dashboard. County of San Diego Health and Human Services Agency Available from: https://www.arcgis.com/apps/opsdashboard/index.html#/96feda77f12f46638b984fcb1d17bd24 (2020)
  40. CDC 2019-novel Coronavirus (2019-nCoV) real-time RT-PCR diagnostic panel. Centers for Disease Control and Prevention Available from: https://www.fda.gov/media/134922/download (2020)
  41. Corman, V. M., et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Eurosurveillance. 25 (3), 2000045 (2020).
  42. Lizardi, P. M., et al. Mutation detection and single-molecule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nature Genetics. 19, 225-232 (1998).
  43. Johne, R., Müller, H., Rector, A., van Ranst, M., Stevens, H. Rolling-circle amplification of viral DNA genomes using phi29 polymerase. Trends in Microbiology. 17 (5), 205-211 (2009).
  44. Wang, B., et al. Rapid and sensitive detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus by rolling circle amplification. Journal of Clinical Microbiology. 43 (5), 2339-2344 (2005).
  45. Population of Mexican origin in San Diego County. County of San Diego Health and Human Services Agency Available from: https://www.sandiegocounty.gov/content/dam/sdc/hhsa/programs/phs/CHS/ENGLISH (2020)
  46. COVID-19 city of residence MAP. County of San Diego Health and Human Services Agency Available from: https://www.sandiegocounty.gov/content/dam/sdc/hhsa/programs/phs/Epidemiology/COVID-19 (2020)
  47. COVID-19 hospitalizations summary. County of San Diego Health and Human Services Agency Available from: https://www.sandiegocounty.gov/content/dam/sdc/hhsa/programs/phs/ (2020)
  48. COVID-19 race and ethnicity Summary. County of San Diego Health and Human Services Agency Available from: https://www.sandiegocounty.gov/content/dam/sdc/hhsa/programs/ (2020)
  49. Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

170 2 SARS CoV 2 2019 COVID 19 RT LAMP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved