JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Sars-CoV-2 için çevre örnekleri toplamak üzere San Diego sakinlerini işe almak için bir vatandaş bilimi projesi tasarlandı. Kullanıcı dostu bir mobil cihaz arayüzü kullanılarak veri gönderimi için çok dilli bir web tabanlı platform oluşturuldu. Laboratuvar bilgi yönetim sistemi, gerçek zamanlı sonuç takibi ile binlerce coğrafi çeşitlilikte numunenin toplanmasını kolaylaştıran bir sistemdir.

Özet

2020 küresel salgını sırasında şiddetli akut solunum sendromu coronavirus 2'nin (SARS-CoV-2) toplum tarafından bulaşmasını kontrol etmek için, çoğu ülke doğrudan insan testlerine, yüz kaplamasına ve yüzey dezenfeksiyona dayalı stratejiler uyguladı. Ana bulaşma yolunun aerosoller ve solunum damlacıklarını içerdiği varsayımıyla, fomitlerde SARS-CoV-2'yi tespit etme çabaları, yüksek yaygınlık olduğundan şüphelenilen yerlere (örneğin, hastane koğuşları, yolcu gemileri ve toplu taşıma sistemleri) odaklanmıştır. SARS-CoV-2'nin kentsel ortamda nadiren temizlenen ve nadiren dezenfekte edilen yüzeylerde varlığını araştırmak için, 350 vatandaş büyük San Diego County'den askere alındı. Toplamda, bu vatandaş bilim adamları 4.080 örnek topladılar. Örnekleme kiti teslimat ve teslim alımını izlemek ve örnek verileri toplamak için çevrimiçi bir platform geliştirildi. Örnekleme kitleri çoğunlukla pandemik stresli mağazalarda bulunan malzemelerden üretildi. Numuneler, tekrarlayan tedarik sıkıntısına rağmen erişimi kolay reaktifler kullanılarak işlendi. Kullanılan yöntemler çevresel örneklerde yaygın olarak bulunan inhibitörlere karşı oldukça hassas ve dirençliydi. Önerilen deneysel tasarım ve işleme yöntemleri, çeşitli yüzey alanlarından etkili bir şekilde numune toplayan çok sayıda vatandaş bilim adamını devreye sokmada başarılı oldu. Burada açıklanan iş akışı ve yöntemler, halk sağlığıyla ilgili olan ve gelecekteki pandemiler için tehdit oluşturan diğer virüsler için kentsel çevreyi incelemekle ilgilidir.

Giriş

SARS-CoV-2'nin esas olarak kontamine aerosollerin ve damlacıkların enfekte bireylerle doğrudan temastan solunması yoluyla bulaştığı düşünülmektedir1,2,3,4. Bununla birlikte, küresel COVID-19 salgınının ilk aşamalarında, SARS-CoV-2'nin bulaşmasını kontrol etme çabaları, yüzeylerin dezenfekte edilmesine, el yıkamaya ve sterilizasyona odaklandı. 2020'nin sonunda, Dünya Sağlık Örgütü (WHO)5 ve ABD Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (CDC)6'dan gelen iletim kılavuzları, hava yoluyla bulaşmayı esas olarak enfekte bir kişiyle yakın temasta (<2 m) veya aerosol üreten tıbbi prosedürlerin varlığında bir tehlike olarak kabul etti. Kontamine yüzeylerle temas veya aerosolize fomitlerin solunmasından sonra kendi kendine aşılama, SARS-CoV-2'nin bir iletim yolu olarak henüz göz ardı edilemedi.

Covid-19 vakaları, havadan bulaşmanın olası görünmediği bildirilmiştir7,8. SARS-CoV-2 virionları bakır üzerinde 8 saate kadar, karton ve paslanmaz çelikte 24 saate kadar ve plastikte 48 saate kadar bulaşıcı kalır9. Yolcu gemisi kabinlerinde, SARS-CoV-2 RNA yolcuların 7 kalkışlarından17gün sonra tespit edildi. Hastanelerden ve toplu taşıma sistemlerinden alınan hava ve yüzey örnekleri SARS-CoV-2 ve diğer koronavirüsler 8 , 10,11,12,13,14için pozitif test edildi. Asemptomatik ve orta/hafif semptomatik COVID-19 hastaları tarafından ele edilen Cadılar Bayramı şekerinin dış ambalajı üzerinde yapılan bir çalışmada, işleyici tarafından el yıkama ve şekerin el sabunu ile yıkanması kombinasyonunun SARS-CoV-2 RNA'yı eşik seviyelerin altına düşürdüğü sonucuna varılmıştır15.

SARS-CoV-2 tanılama için çeşitli yöntemler gerçek zamanlı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR)16,17,ters transkripsiyon döngüsü aracılı izotermal amplifikasyon (RT-LAMP)11,18,19,20,21ve CRISPR-Cas teknolojileri18 , 19,22,23temel alınarak yayınlanmıştır. Çoğu, önemli küresel talep dönemlerinde genellikle yetersiz olan RNA ekstraksiyon kitleri gerektirir ve virüsün çevresel taraması için çok az kişi kullanılmıştır24. RT-LAMP kullanılarak SARS-CoV-2 RNA'nın tespitinin RT-qPCR kullanmaya %83'ün üzerinde uygun olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, RT-LAMP, RT-qPCR 15'e kıyasla sonuçsuz sonuçlarda%25azalmaya neden oldu.

RT-LAMP, bir RNA şablonundan cDNA sentezlemek için ters transkriptaz kullanan basit bir tekniktir25, ardından DNA'yı sabit sıcaklıkta sentezleyen güçlü iplik yer değiştirme aktivitesine sahip bir DNA polimeraz (yani, izotermal amplifikasyon)26. Viral genom tespitinin daha yüksek özgüllüğü, hedef DNA'nın altı veya sekiz bölgesini tanıyan dört veya altı astar kullanılarak elde edilir. Amplifikasyon bir iç astardan başlatılır ve yarı çift iplikli bir DNA yapısı verir. Önde gelen iplikçik daha sonra bir dış astar ile yükseltilir. Bu amplifikasyonlar ters astarlar için tekrarlanır. Her iki uçtaki iç ve dış astarlar, amplifikasyon ürünü26,27'debir döngü oluşturan dahili ters kendini tamamlayan bir siteye sahiptir. İzotermal iplikçik yer değiştirmede, asenkron DNA sentezi, sürekli polimerizasyonun reaksiyon başına 10 kopya kadar az sinyali güçlendirdiği yüksek miktarlarda güçlendirilmiş ürün üretir11,20,28. Kolorimetrik RT-LAMP karışımı zayıf bir şekilde tamponlanmıştır ve pH göstergesi olarak fenol kırmızısı kullanır. Polimeraz bir nükleotid içerdeğe sahip olduğundan, bir proton salgılar ve yeterli proton çözeltinin pH'ını ve rengini pembeden sarıya değiştirir11,20,28,29.

RT-LAMP, tam donanımlı laboratuvarlardan yoksun periferik sağlık tesislerinde sivrisinek kaynaklı hastalıkların tespiti için geliştirilmiştir25 ve insan immün yetmezlik virüsü30gibi diğer RNA virüslerinin hızlı tespiti için . Salgın salgınlarında en savunmasız nüfuslar -DSÖ tanımına göre- genellikle tespit yapmak için yeterli ekonomik kaynağa ve uygun ekipmana sahip değil (Birleşmiş Milletler Küresel Halk Sağlığı Gündemi). Mevcut SARS-CoV-2 salgınında, RNA ekstraksiyon kitleri için tıbbi sınıf sürüntü örnekleri ve reaktifler gibi malzemeler, özellikle üretim yapmayan ülkelerde küresel talebi karşılayamadı. Önerilen protokol, RNA'yı soğuk zincirden bağımsız bir şekilde etkili bir şekilde koruyan ve inhibitörlerin numuneden kalıcılığını önemli ölçüde azaltan guanidinyum tiyosiyanat (GITC) bazlı bir ham RNA ekstraksiyonu kullandı. Ayrıca, GITC-kloroform ekstraksiyon protokolü, RNA'nın DNA ve proteinlerden ayrılmasına ve ardından ilgili çökeltiye dayanır ve genetik materyalin çoğunun iyileşmesini sağlar. Bu avantajlar, risklerden uygun şekilde haberdar etmek için önlemler alınırsa, kimyasalı ele alan vatandaş bilim adamlarının potansiyel tehlikelerinden daha ağır basmaktadır.

Önerilen iş akışı, genel kullanımlı malzemeler ve reaktifler kullanır. Temel, genellikle kırsal, laboratuvar ortamlarında bulunan ekipman gerektirir. Bu yöntemler ucuzdur, genellikle çevresel örneklerde veya ekstraksiyon kitleriyle işlenemeyen örneklerde bulunan inhibitörlere karşı oldukça dayanıklıdır ve yüksek hassasiyetli bir termosikler ihtiyacını ortadan kaldırır. Bu çalışma, hanelerin ve kentsel çevrenin yaygın olarak dokunulan ve nadiren dezenfekte edilen yüzeylerinde çevre rezervuarlarından SARS-CoV-2'nin örneklemesi ve tespiti için bir boru hattı sunun.

Protokol

Katalog numaraları, üretici ve ilgili maliyetler de dahil olmak üzere reaktiflerin ve sarf malzemelerinin ayrıntılı bir listesi için Malzeme Tablosu'na bakın.

1. Kentsel çevrenin örneklemesi

  1. Vatandaş bilim adamı sosyal yardım
    1. Yerel ve sosyal medya üzerinden yayınlanan doğrudan ve net bir eylem çağrısı kullanarak vatandaş bilim adamlarını işe alın. Konuyu sosyal medya içeriğine bağlamak için bir sosyal medya tanıtıcısı (örneğin, #swab4corona)oluşturun.
    2. Laboratuvar ekibi ile her bir vatandaş bilim adamı arasında doğrudan iletişim için, ilgi çekici bölgenin ana dillerini akıcı bir şekilde konuşarak (örneğin, San Diego County için İspanyolca ve İngilizce) yöneten bir e-posta hesabı oluşturun.
    3. Bir veritabanı, bir laboratuvar bilgi yönetim sistemi (LIMS) olarak hizmet vermek ve vatandaş bilim insanlarıyla iletişim kurmak için güvenli bir web tabanlı örnek yönetim platformu (SMP) oluşturun.
      NOT: SMP, kullanıcıların bir kit istediği, örnek toplama protokollerine eriştiği, örnek meta veriler gönderdiği ve tamamlanan örnek kitler için bir teslim alım istediği merkezi bir konum sağlar.
    4. Bireylerin çevrimiçi bir formda belirtilen biyogüvenlik ile ilgili soruları yanıtlayarak çevresel örnekleme çalışmalarına katılmak için başvurmaları için SMP (örneğin, https://demo.covidsample.org/) (Şekil 1)için bir bağlantı oluşturun.
    5. Bulut bilgisayar hizmeti sağlayıcısı tarafından kolaylaştırılan bir Kimlik Doğrulama Uygulama Programlama Arabirimi kullanarak SMP'ye güvenli erişim. Onaylanan kullanıcılara SMP'ye erişim izni verin.
      NOT: Kimlik doğrulama ve yetkilendirme için OAuth 2.0 protokolü31'in açıklaması için literatüre bakın. Vatandaş bilim adamı gönüllüleri için sürtünmesiz bir oturum açma işlemi sağlar. Ayrıca, kullanıcıların mevcut bir hesapla oturum açmasına izin vererek özel bir oturum açma çözümü oluşturma ve kullanıcı kimlik bilgilerini yönetme ihtiyacını ortadan kaldırır, bu da önemli miktarda zaman kazandırır ve katılımı teşvik eder. Son raporlara göre, seçilen bulut bilgisayar hizmeti sağlayıcısı için sunulan ücretsiz e-posta hizmeti yaklaşık 1,5 milyar aylık aktif e-posta kullanıcısına sahiptir; katılım için bu hizmet sağlayıcısından bir e-posta hesabı gerektirmek cesaret kırıcı bir faktör olarak kabul edilir.
    6. Çalışmanın amacını ve biyogüvenlik konularını ilk kitlerini istemeden önce SMP'deki vatandaş bilim insanlarına açıklayın. Bir bulut bilgisayar hizmeti sağlayıcısı tarafından kolaylaştırılan çok dilli bir sinir makinesi çeviri hizmetinden herhangi bir dilde gezinmeyi etkinleştirmek için çok dilli bir eklenti sağlayın.
    7. örnekleme bölümüne İngilizce ve İspanyolca grafik ve görsel-işitsel protokolleri ekleyin.
    8. Her kite benzersiz bir tanımlayıcı atayın ve kullanıcı arabirimini veri giriş işlemini kolaylaştırmak için Örnek Kimlik'e bağlı düğmeleri kullanacak şekilde tasarlayın (Şekil 1A).
    9. Teslimat/teslim alma rotalarını optimize etmek ve vatandaş bilim adamlarını tahmini varış sürelerini bildirmek için sürücüler tarafından kullanılacak bir mobil cihaz uygulamasına sahip bir teslimat rotası planlama yazılımı kullanın.
    10. LIMS platformunu bir PHP web hizmeti yığını üzerine oluşturun ve ticari bir barındırma platformunda barındırın (önerilen işletim sistemi, web sunucusu yazılımı ve veritabanı yazılımı Malzeme Tablosundabelirtilmiştir).
    11. Laboratuvar personelinin LIMS'de verileri hızlı ve kolay bir şekilde yönetmesini sağlamak için güvenli bir web tabanlı uygulama arabirimi sağlayın. Bulut bilgisayar hizmeti sağlayıcısı tarafından kolaylaştırılan bir veri Grafik Uygulama Programlama Arabirimi kullanarak veri görselleştirmesi sağlayın.
    12. Bir bulut bilgisayar hizmeti sağlayıcısı tarafından kolaylaştırılan jeo uzamsal uygulama programlama arabirimini kullanarak jeo uzamsal verileri görselleştirin. (1) proje verilerinin merkezi olarak depolanmasını kolaylaştırmak için SMP aracılığıyla LIMS'ye gönderilen verileri depolamak; (2) örnek/veri işleme iş akışlarının izlenmesi; ve (3) vatandaş bilim insanlarına numune kiti dağıtımı lojistiğinin yönetimi.
    13. Gönderilen meta verileri en iyi uygulamaları (örneğin, https://demo.covidsample.org/) kullanarak güvenli hale alın.
    14. Veri türü uyumluluğunu etkinleştirmek ve kullanıcı tarafından hatalı veya eksik verilerin gönderimini en aza indirmek için Örnek Kit Kimliği, Örnek Kimlik, tarih, saat ve Küresel Konumlandırma Sistemi (GPS) koordinatları (sitenin bir resminden otomatik olarak toplanır) gibi ön yükleme bilgileri (Şekil 1B). Vatandaş bilim adamı tarafından manuel ve hızlı bir şekilde (<1 dk) doldurulacak aşağıdaki alanları ekleyin: toplanma tarihi ve saati, konumun kısa bir açıklaması ve örnekleme sitesinin bir resmi.
    15. Karşıya yüklenen tüm verileri sterilize edin ve veri türü için doğrulayın. Örneğin, .jpg dosyaları seçmek için kullanıcılar tarafından yüklenen görüntü verilerini doğrulayın, örnekle hızlı ilişki için Örnek Kimliği ile yeniden adlandırın ve yüklenen görüntüleri kullanıcılar tarafından erişilemeyen ayrı bir güvenli konumda depolayın.
    16. Tüm numuneler (16) tamamlandığında kit teslimi ve teslim alma isteğinde bulunma seçeneğini etkinleştirin. Ayrıca, bir öncekinin teslim alınmasından sonra teslim edilecek yeni bir kit isteme seçeneğini etkinleştirin (Şekil 1A).
      NOT: Web tabanlı olmayan bir platformu tercih eden gönüllüler ve GPS konumlarını açıklamaktan endişe duyanlar için (örneğin, göçmen durumlarından endişe duyan topluluk üyeleri), kitler kararlaştırılan bir toplantı yerinde teslim edilebilir ve gönüllülerden veri toplamanın yazılı bir sürümünü kaydetmeleri istenir. Laboratuvar ve her bir vatandaş bilim adamı arasındaki iletişim için, projenin iki dilli bir üyesi telefon görüşmeleri ve metinler için kullanılabilir.
  2. Corona için çubuk
    1. Örnekleme çabası için epidemiyolojik olarak ilgili bir zaman aralığı tanımlayın.
    2. Gerekli kişisel koruyucu ekipman (örneğin, maske, eldiven), örnekleme protokolü ve biyogüvenlik ile ilgili bilgiler de dahil olmak üzere tüm örnekleme malzemelerini içeren bir kit oluşturun (Şekil 2). Her tüpü atanan benzersiz tanımlayıcı (Örnek Kimliği) ile önceden etiketleyin.
    3. Evlerde ve kentsel çevrede aerosolize fomitlere maruz kalan yüzeyleri nadiren dezenfekte eder.
      1. Çapraz kontaminasyonu önlemek için sağlanan maskeyi ve her numunenin toplanması için yeni bir eldiven takın. Örneklemesi bitirdikten sonra, sağlanan el dezenfektanını kullanın.
      2. Zarfını bozarak virüsü etkisiz hale getirmek ve RNases 32'nin açılmasını teşvik ederek çıplak RNA'yı stabilize etmek için 1 cm2 polyester emici svabı (örneğin paspas pedleri) deterjanla (örn.%0,5sodyum dodecyl sülfat (SDS)) ıslatın.
      3. 10 cm2'likbir yüzeyi sürün. Bir kürdan yardımıyla, her örnek çubuğu 200 μL guanidinium tiyosiyanat çözeltisi (GITC) içeren ilgili önceden etiketlenmiş tüpe tamamen batırın. Tüpleri laboratuvara taşınana kadar 4 °C'de saklayın. Numuneler laboratuvara ulaştığında -80 °C'de saklayın.
        NOT: GITC toksik bir tahriş edicidir; ciltle temastan kaçının. GITC çözeltisinin yaygın laboratuvar kimyasallarından hazırlanması kolaydır, tarif içinbkz. Virüsü inaktive eder, RNases34 , 35,36'yıdenatüreederekRNA'yı stabilize eder ve numuneleri oda sıcaklığında stabilize eder. Bununla birlikte, kit, depolama için ev buzdolaplarını kullanmaya gerek kalmadan numuneleri soğuk tutmak için buz paketleri içerir.

2. SARS-CoV-2 algılama

  1. Toplam RNA yalıtımı
    1. Yüzeyleri, ekipmanları ve pipetleri 2 mM bakır sülfat ve% 3 hidrojen peroksit çözeltisi ile dezenfekte edin; ardından %10 çamaşır suyu, 90 mM sodyum bikarbonat, %5 SDS ve %2,5 NaOH çözeltisi. Damıtılmış su ve ardından% 75 etanol ile iyice silin.
      NOT: Bu çözümler, piyasada bulunan çözümlere bir alternatiftir.
    2. Buzdaki örnekleri eritin. Orta hızda 2 dakika boyunca girdap örnekleri.
    3. Taramanın hızını artırmak için örnekleri havuzlarda işleyin. Bir havuz pozitifse, pozitif örneği/örnekleri bulmak için her örneğin RNA'sını bağımsız olarak ayıklayın. Her örnekleme kitinden (toplam 16) alınan örnekleri 8 örnekten oluşan 2 havuzda birleştirin.
      NOT: Havuz başına 8 örneğe sahip olmak, kit başına yalnızca 2 havuzun işlenmesi gerektiği anlamına gelir. Bir havuz pozitifse, ayrı numuneler ayrı RT-LAMP analizi için yeniden işlenir. Bu, zamanı, maliyetleri ve reaktifleri azaltır.
    4. 8 numunenin her birinin 50 μL'lik havuzu bir mikrosantrifüj tüpüne (toplam hacim 400 μL); kalan numuneyi -80 °C'de kaydedin. 0,2 hacim (80 μL) kloroform, 15 sn girdap ekleyin ve ardından 4 °C'de 20 dakika kuluçkaya yatırın. 4 °C'de 20 dakika boyunca 13.000 × g'da santrifüj.
    5. Sulu (berrak sıvı) katmanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Kalan arayüzü ve pembe sıvıyı -80 °C dondurucuda saklayın; bu fraksiyonlar DNA ve protein içerir33,36.
    6. Eşit hacimde izopropanol (~200 μL) ve 2,6 μL glikojen coprecipitant (15 mg mL-1)37ekleyin. İyice karıştırın ve en az 1 saat boyunca -20 °C'de kuluçkaya yatırın, ardından RNA'yı çökeltmek için 10 dakika boyunca 4 °C'yi takip edin.
      NOT: Protokol burada numuneler 1 saat yerine gece boyunca -20 °C'de inkübe edilerek duraklatılabilir.
    7. 4 °C'de 20 dakika boyunca 13.000 × g'da santrifüj. Peletin rahatsız etmeden süpernatant çıkarın. Peleti 50 μL dietilpyrokarbonat (DEPC) arıtılmış suya yeniden yansıtın ve eşit hacim (50 μL) RNase içermeyen 5 M amonyum asetat ve % 100 etanol7,38'in2,5 cilt (250 μl) ekleyin.
      NOT: Amonyum iyonları, aşağı akış işleminde kullanılırsa polinükleotid kinazı inhibe eder38. Karışım, çözelti38'dedeoksinükleozid trifosfatlar ve oligosakkaritler bırakırken RNA'yı çökeltir.
    8. İyice karıştırın ve en az 1 saat boyunca -20 °C'de kuluçkaya yatırın, ardından RNA'yı çökeltmek için 10 dakika boyunca 4 °C'yi takip edin.
      NOT: Protokol burada numuneler 1 saat yerine gece boyunca -20 °C'de inkübe edilerek duraklatılabilir.
    9. 4 °C'de 20 dakika boyunca 13.000 × g'da santrifüj. Peleti 1 mL soğuk (-20 °C), taze yapılmış% 75 etanol ile yıkayın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 8.000 × g'da santrifüj. Peletin rahatsız edici olmasını önlemek için üsttekiyi bir P10 pipetle çıkarın.
    10. Kalan etanol kalmayana kadar peletin hava ile 10-15 dakika kurutun. Peleti 50 μL DEPC arıtıcı suya yeniden saklayın, 5 μL 10x DNase tamponu + 1μL DNase (2 Birim μL-1)ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
    11. 0,1 cilt (5,6 μL) DNase inaktivasyon reaktifi ekleyin, oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın ve her dakika hafifçe karıştırın. 2 dakika boyunca 13.000 × g'da santrifüj ve süpernatantı yeni bir tüpe (~50 μL) aktarın. RT-qPCR veya RT-LAMP reaksiyonlarını hazırlarken tüpü hemen buza yerleştirin veya -20 °C'lik bir dondurucuda saklayın.
      NOT: Taşıma kontaminasyonini önlemek için amplicon içermeyen bir odada RNA İzolasyonu gerçekleştirin.
  2. Multipleks ters transkripsiyon döngüsü aracılı izotermal amplifikasyon (RT-LAMP)
    1. Her astar kümesi için 20X astar karışımı çözeltisi (Tablo 1) hazırlayın (Tablo 2). Borulama kaybını hesaba katmak için ODA SıCAKLıĞıNDA %10 fazla hacimli RT-LAMP reaksiyon karışımını (Tablo 3) hazırlayın.
      NOT: Antarktika termolabile urasil-DNA glikosilaz (UDG) ile kolorimetrik LAMP 2X anakarışımı,DNA kontaminasyonunun önceki reaksiyonlardan amplifikasyonunun kesilmesini önler20,28.
    2. Girdap ve karışımı aşağı döndür. Karışımın 20 μL'sini her reaksiyon tüpüne dağıtın: örnek, çivili, pozitif kontrolve negatif kontrol. UDG'nin potansiyel taşıma kontaminasyonuna etki edebilmesi için tüplerdeki reaksiyonları oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya bırakın.
    3. Numune reaksiyonu için 5 μL RNA, çivili reaksiyona 5 μL RNA + 2,5 μL (450 kopya) sentetik SARS-CoV-2 RNA, pozitif kontrol reaksiyonu için 2,5 μL (450 kopya) sentetik SARS-CoV-2 RNA ve negatif kontrol reaksiyonu için5 μLH 2 O ekleyin. İyice karıştırın ve reaksiyonları aşağı çevirin; tüm RNA'ları buzda eritin.
    4. Termosikleyici veya su banyosu 65 °C'ye ısıtılırken, tüm reaksiyonların oda sıcaklığında kalmasını sağlar. UDG >50 °C'de devre dışı bırakılacaktır. Reaksiyonları termosiklere yerleştirin (ısı kapağı kullanın), 40 dakika boyunca 65 °C'de kuluçkaya yaslayın ve reaksiyonların oda sıcaklığına (5 dakika için ~ 22 ° C) ulaşmasını bekleyin veya 1 dakika boyunca buz üzerinde soğutun. Sonuçları kolorimetrik özelliği (basit gözlem) veya ürünleri bir agarose jelinde çalıştırarak analiz edin.
      NOT: Algılama sınırı (LOD) reaksiyon başına 10 kopya olmasına rağmen, kopya numarası reaksiyon başına 500 kopyaya yaklaştıkça algılama sıklığı artar (Şekil 3A). Kolorimetrik gözlem için, negatif bir sonucun pembe (pH = 8.8) ile, pozitif sonucun ise sarı (pH = 5) (Şekil 3B)ile belirtildiğini unutmayın. Kolorimetrik seçenek, rt-LAMP ürünlerinin çalışma ortamındaki hacmini ve taşıma kirlenmesini azaltacak olan amplifikasyondan sonra RT-LAMP tüplerinin açılmasını önler. Jel elektroforezi için% 0.5 Tris / Borat / EDTA (TBE) tamponunda 1X DNA jel lekesi ile% 1.5 agarose jel hazırlayın. Reaksiyonun 25 μL'si + her kuyuya 5 μL 6X yükleme boyası yükleyin. Jeli 60 dakika boyunca 100 V'ta çalıştırın. Pozitif numuneler merdiven deseni gösterdiği için moleküler bir işarete ihtiyaç yoktur (Şekil 3C).

Sonuçlar

SARS-CoV-2'nin tespiti için vatandaş bilim adamları tarafından toplanan örnekler. 8 aylık bir süre boyunca (Mart ortasından Kasım 2020'nin üçüncü haftasına kadar), 482 vatandaşın bu projeye katılması onaylandı ve bunların 350'si (%73) bir kit istedi. Toplam 362 kit teslim edildi (yani, bazı katılımcılar birden fazla kit istedi) ve 246 (%70) iade edildi (Şekil 4A,B). Bu kitlerde bulunan 4.080 numunenin tamamı işlendi. Toplama alanları, ilçenin Kuzey Kıyı, Kuzey Orta, Orta ve Güney bölgelerine ve doğu bölgelerine dağıtıldı (Şekil 4A). Bu bölgeler, San Diego İnsan Sağlığı Servisi Ajansı 39 tarafından bildirildiği gibi, San Diego county'nin en yüksek nüfus yoğunluğuna ve en çok belgelenenCOVID-19vakalarına sahiptir.

Vatandaşlar en çok örneklenen kitlerin teslimini istedi (yani ortalama başarı oranı: %70,4). Her gün 1-16 kit isteilmiş ve 0-14 kit laboratuvara iade edilmiştir(Şekil 4B). Vatandaş bilim adamlarının bir anketi, tam bir kitin (16 örnek) toplanmasının ortalama 8 gün boyunca dağıtılan 1-3 saat sürdüğünügöstermiştir (Şekil 4A ve Tablo 4). Kitlerin büyük çoğunluğu tamamlandı (%91,1), yani 16 örnek tüpün içinde bir çubuk içeriyordu ve ilgili örnekleme verileri LIMS'ye yüklendi (Şekil 4A ve Tablo 4).

GITC-kloroform ekstraksiyonu ve multipleks ters transkriptaz döngü aracılı izotermal amplifikasyon (RT-LAMP) kullanılarak SARS-CoV-2'nin tespiti. Kolorimetrik RT-LAMP tahlilleri için, nükleokapsid (N2) ve zarf ( E1 ) genlerini (Tablo 2) hedeflemek için iki astar seti11,20, 28kullanıldı. Bu astarlar tarafından tanınan diziler, RT-qPCR tarafından COVID-19'un insan teşhisi için CDC40 ve Avrupa Birliği (AB)41 tarafından onaylanan astarlar ve problarla aynı bölgededir. Bu sonuçlar, reaksiyona60 mM guanidin hidroklorür eklemenin çok sayıda çalıştırıldığında LOD'yi artırdığı Zhang ve ark. %100 frekansta LOD, 25 μL reaksiyon başına 500 kopya idi (Şekil 3A,B). Kolorimetrik RT-LAMP'de pozitif numuneler , pH kayması nedeniyle ~8'den 5,5'e (Şekil 3B)pembeden sarıya renk değiştirdi. Reaksiyon düşük kopya sayılarında turuncuya döndüğünde, numuneler bunların pozitif olduğunu doğrulamak için% 1.5 agarose jelde çalıştırıldı ve merdiven benzeri bir desenle sonuçlandı (Şekil 3C). RT-LAMP, havuza alınan RNA örneklerinde SARS-CoV-2'yi tespit etmek için kullanıldı.

Reaksiyon inhibitörlerine bağlı yanlış negatifleri kontrol etmek için, her örnek 500 sentetik SARS-CoV-2 kopyası ile çivilenmiş ek bir reaksiyonda test edildi. Pozitif havuza alınan numuneler, havuzdaki her bir numunenin RNA'sı izole ederek dereplicated edildi ve pozitif numunenin kimliğini belirlemek için bir RT-LAMP reaksiyonunda çalıştırıldı. Algılama sonuçları daha sonra benzersiz örnek kimliğin tarih, saat, GPS koordinatları, site ve numunenin görüntüsüyle eşleştiği LIMS'ye yüklendi.

Gerçek zamanlı ve geleneksel RT-PCR yöntemleri: örnek kirleticiler tarafından inhibisyon. Önerilen algılama boru hattı için uygun en iyi yöntemi seçmek için, diğer RNA amplifikasyon yöntemleri, vatandaş bilim adamlarından oluşan bir pilot kohort tarafından toplanan çevresel örneklerle test edildi. Bu yöntemlerin her birinin sonuçlarına örnekler, düşük viral kopya numarası konsantrasyonlarında çevresel inhibitörlere ve arka plan sinyal gürültüsüne duyarlılıklarını tasvir etmek için Şekil 5'te sunulmuştur.

CDC ve WHO tarafından onaylanan altı RT-qPCR formülasyonu (Malzeme Masası) çevresel numunelerde virüsün tespiti için test edildi. Protokoller, üreticinin talimatlarına ve KLINIK ortamlarda SARS-CoV-2'nin tespiti için CDC yönergelerine göre takip edilmiştir40. Farklı konsantrasyonlarda sentetik SARS-CoV-2 RNA kontrolleri içeren reaksiyonlar, ham RNA izolasyonu sonrasında sürünmüş yüzey örneklerine çivilendi. Tüm ana karışımlar, pozitif kontrolün LOD konsantrasyonlarındaki inhibitörlere karşı hassastı (Şekil 5A).

Bu gerçek zamanlı teknolojilerin inhibitörlerini atlamak için geleneksel bir RT-PCR sistemi test edildi. N1 , N2astar setlerini ve sırasıyla CDC (ABD) ve ECDC (AB) tarafından onaylanan Astar seti E1'ikullanarak zarf genini kullanarak nükleapsid geni yükseltmek için tek adımlı bir RT-PCR sistemi (Malzeme Tablosu) kullanılmıştır (Tablo 2). Protokoller, üreticinin talimatlarına ve KLINIK ortamlarda SARS-CoV-2'nin tespiti için CDC yönergelerine göre takip edilmiştir40. CDC tarafından tasarlanan astar setleri N1 ve N2 ~70 bp ürün verir; ancak, düşük kopya sayısı pozitifleri negatif kontrolün amplifikasyon arka plan gürültüsünden ayırt değildi (Şekil 5B), sonuçlara yanlış pozitifler getirdi. E1 astarlarının ürünü düşük kopya numarasında zayıf bir sinyale sahipti (Şekil 5B), sonuçlara yanlış negatifler sokarak. Ayrıca, test edilen RT-PCR yöntemi çevresel örneklerde bulunan inhibitörlere karşı hala hassastı (veriler gösterilmedi).

Çok az miktarda hedef diziyi tespit etmek için başka yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemlerden biri, hedef sıranın, RNA'nın veya DNA'nın belirli bir doğrusal prob tarafından tanınmasının ardından, bir ligaz şablonu daireselleştirir. Probla hibridize etmek için tasarlanmış astarlar kullanılarak, iplikçik yer değiştirme aktivitesine sahip bir DNA polimeraz, probu izotermal reaksiyon42'deyükseltiyor. Bu yöntemi son derecehassashale getiren hedef dizisi değil, yükseltilmiş olan hedefi tanımlayan probdur. Wang ve arkadaşları44, SARS-CoV-1 RNA'nın doğrudan tespiti için bir RCA protokolü yayınladı. Yöntem SARS-CoV-2'ye özgü astarlar kullanacak şekilde değiştirildi. Ne yazık ki, şablon olmayan denetimde (NTC), prob, SNP'ye duyarlı bir ligase de dahil olmak üzere çok çeşitli bağlar kullanırken bile RNA şablonunun yokluğunda ürünü döngüselleştirir ve verir. Ligase yokluğunda, NTC doğrusal probdan amplifikasyon göstermedi (Şekil 5C).

figure-results-7056
Şekil 1: Mobil cihazlar için örnek toplama veri arayüzüne sahip web tabanlı örnekleme platformu. (A) Laboratuvar ile vatandaş bilim insanları arasındaki etkileşime aracılık etmek için çok dilli bir eklenti içeren bir web sitesi oluşturulmuştur. Platform, numune kiti teslimi/ teslim alma isteği ve örnek veri gönderimi için kullanılmıştır. Platform ayrıntılı İngilizce / İspanyolca grafik ve görsel-işitsel örnekleme protokolleri içeriyordu. (B) Örnek verileri yüklemek için kullanılan mobil cihaz görünümü: tarih, saat, GPS koordinatları, örnek site açıklaması ve toplama sitesinin bir görüntüsü. Kısaltmalar: SARS-CoV-2 = şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2; GPS = Küresel Konumlandırma Sistemi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-8163
Şekil 2: Örnek toplama kiti. Vatandaş bilim adamları, iki buz paketi içeren bir soğutucu, gitc çözeltisini kullanmanın tehlikeleri hakkında gönüllüleri bilgilendirmek için bir güvenlik veri sayfası, ayrıntılı bir örnekleme ve maske takma protokolü, bir KN95 maskesi, bir atık torbası, el dezenfektanlı bir sprey şişesi aldı. %0,5 SDS'li bir sprey şişesi, 16 çift eldiven, 16 kürdan ve 16 polyester sürüntülü küçük bir çanta, 200 μL GITC çözeltisi içeren önceden etiketlenmiş 16 mikrosantrifüj tüpü, numune alma tüplerini içeren bir kutu ve dökülme durumunda tüp kutusu için ikincil kap olarak kullanılan bir torba. Kısaltmalar: GITC = guanidinium tiyosiyanat; SDS = sodyum dodecyl sülfat. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-9216
Şekil 3: Çok katlı Ters Transkripsiyon Döngüsü Aracılı İzotermal Amplifikasyon (RT-LAMP) tahlili. SARS-CoV-2 nükleocapsid (N2) ve zarf (E1) genleri için astarlar kullanılarak çok katlı reaksiyonlar, reaksiyonda virüsün 10 kadar kopyasını tespit etmek için. Pozitif kontrol olarak sentetik SARS-CoV-2 RNA kullanıldı. (A) Reaksiyon başına farklı genom kopya numaralarında SARS-CoV-2'nin çok katlı kolorimetrik RT-LAMP'ında algılama sıklığı. Ortalama değer beş pembe olarak çoğalır. (B) Multiplks kolorimetrik RT-LAMP'de SARS-CoV-2'nin algılama sınırı (LOD); sarı = pozitif (pH ~5); pembe = negatif (pH ~8). (C) %1,5 agarose jel elektroforezunda pozitif SARS-CoV-2 RT-LAMP reaksiyonlarının merdiven deseni. Kısaltmalar: SARS-CoV-2 = şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2; rxn = reaksiyon. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-10442
Şekil 4: San Diego County'deki vatandaş bilim adamı örnekleme kitlerinin konumu ve istenen kitlerin başarı oranı. (A) Turuncu noktalar, 16 örnek içeren 1 örnekleme kitinin yerini temsil eder. Mavi pasta grafiği, vatandaş bilim insanlarına teslim edildiklerinden laboratuvara geri döndüklerine kadar çeşitli günler süren kitlerin yüzdesini gösteriyor. Parantez içindeki gün sayısı. Turuncu pasta grafik, toplam 16 örnekten farklı sayıda tamamlanmış numuneye sahip kitlerin yüzdesini gösterir. Örnek tüpün içinde bir çubuk içeren tamamlanmış örneklerin sayısı ve parantez içinde LIMS'ye yüklenen ilgili örnekleme verileri. (B) Laboratuvara iade edilen kitlerin yüzdesi (noktalar) ve kitin istendiğı tarihe göre toplam talep edilen kit (çubuk) sayısı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-11591
Şekil 5: Alternatif SARS-CoV-2 RNAdetection yöntemleri. (A) SARS-CoV-2 nükleocapsid ( N ) geninin Astar setiN2kullanılarak RT-qPCR tespiti . Havuza alınan çevresel numuneler SARS-CoV-2'nin 900 (yeşil) veya 9 (turuncu) kopyası ile birleştirilmiştir. Mavi ile aynı kopya numaralarının pozitif kontrolleri. Ok, çevresel örnek mevcut olduğunda düşük kopya numarası pozitif kontrolünün floresan algılamasındaki azalmayı gösterir. (B) SARS-CoV-2'nin geleneksel RT-PCR tespiti. Üst: Astar setleri N1 ve N2kullanılarak nükleapsid geninin RT-PCR ürünleri. Şablonsuz denetimde soluk bir arka plan sinyali gözlenir. Alt: Zarf geninin RT-PCR ürünleri astar seti E1. LOD konsantrasyonunda çok düşük sinyal gözlenir. Mavi oklar beklenen pozitif ürünü gösterir: (üstte) ~70 bp ve (altta) 113 bp% 2 agarose jel elektroforezi. (C) SARS-CoV-2 RNA RCA. Dairesel prob, ligaz varlığında ve RNA şablonunun yokluğunda (NTCcir); Ligase ve RNA şablon doğrusal prob yokluğunda yükseltici değildir (NTClin). Kısaltmalar: SARS-CoV-2 = şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2; RFU = bağıl floresan üniteleri; bp = temel çiftler; rxn = reaksiyon; MM = moleküler işaretleyici; RT-PCR = ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu; RT-qPCR = gerçek zamanlı nicel RT-PCR; RCA = yuvarlanan daire amplifikasyonu; NTC= şablonsuz denetim; LOD = algılama sınırı; rxn = reaksiyon. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Astar20X Konsantrasyon (μM)1X Konsantrasyon (μM)
Fıp321.6
BIP321.6
F340.2
B340.2
Döngü80.4
DöngüB80.4

Tablo 1: 20X RT-LAMP astar karışımı için formülasyon. RT-LAMP reaksiyonunda, 6 astar hedeflenen DNA'nın 8 bölgesini tanır. Kısaltmalar: ters transkripsiyon döngüsü aracılı izotermal amplifikasyon; FIP = ileri iç astar; BIP = geri iç astar; F3 = ileri deplasman astarı; B3 = geri deplasman astarı; LoopF = ileri döngü astarı; LoopB = geri döngü astarı.

AstarsırahedefÜrün boyutu
RT-LAMBA9,18,19
E1-F3TGAGTACGAACTTATGTACTCATEmerdiven benzeri desen
E1-B3TTCAGATTTTTAACACGAGAGT
E1-FIPACCACGAAAGCAAGAAAAGAAGTTCGTTTCGGAAGAGACAG
E1-BIPTTGCTAGTTACACTAGCCATCCTTAGGTTTTACAAGACTCACGT
E1-LoopBGCGCTTCGATTGTGTGCGT
E1-LoopfCGCTATTAACTATTAACG
N2-F3ACCAGGAACTAATCAGACAAGN
N2-B3GACTTGATCTTTGAAATTTGGATCT
N2-FIPTTCCGAAGAACGCTGAAGCGGAACTGATTACAAACATTGGCC
N2-BIPCGCATTGGCATGGAAGTCAATTTGATGGCACCTGTGTA
N2-LoopfGGGGGCAAATTGTGCAATTTG
N2-LoopBCTTCGGGAACGTGGTTGACC
RT-qPCR38
2019-nCoV_N1-FGACCCCAAAATCAGCGAAATN72 bp
2019-nCoV_N1-RTCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG
2019-nCoV_N1-P5'-FAM-ACC CCG CAT TAC GTT TGG TGG ACC-BHQ1-3'
2019-nCoV_N2-FTTACAAACATTGGCCGCAAAN67 bp
2019-nCoV_N2-RGCGACATTCCGAAGAA
2019-nCoV_N2-P5'-FAM-ACA ATT TGC CCC CAG CGC TTC AG-BHQ1-3'
RT-PCR39
E1_Sarbeco_FACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGTE113 bp
E1_Sarbeco_RATATTGCAGCAGTACGCACACA

Tablo 2: RT-LAMP, RT-qPCR ve RT-PCR için kullanılan astarlar. Astar dizileri, hedef gen, beklenen ürün boyutu ve karşılık gelen referans listelenir. Kısaltmalar: RT-LAMP = ters transkripsiyon döngüsü aracılı izotermal amplifikasyon; RT-PCR = ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu; bp = temel çiftler; RT-qPCR = gerçek zamanlı nicel RT-PCR; E1 = zarf geni; N2 = nükleokapsid gen; F = ileri astar; R = ters astar; P = Prob ; FIP = ileri iç astar; BIP = geri iç astar; F3 = ileri deplasman astarı; B3 = geri deplasman astarı; LoopF = ileri döngü astarı; LoopB = geri döngü astarı.

reaktifHacim (μL)
UDG ile WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix12.5
N2 Astar Karışımı (20x)1.25
E1 Astar Karışımı (20x)1.25
Guanidine Hidroklorür (600 mM)*2.5
Hedef RNA5
Nükleaz içermeyen H2O2.5
Toplam Birim25

Tablo 3: Multipleks kolorimetrik RT-LAMP için reaksiyon ana karışımı. (*) Guanidine Hydrochloride'nin,28. Kısaltmalar: LAMP = döngü aracılı izotermal amplifikasyon; UDG = urasil-DNA glikosilaz; N2 = nükleokapsid gen; E1 = zarf geni; DEPC = dietilpyrokarbonat.

Onaylanmış vatandaşlarKit talebinde bulunan vatandaşlarTeslim edilen kitlerİade edilen örneklenmiş kitlerÖrneklemeye adanmış günlerTamamlanma Yüzdesi KitleriTamamlanmadı Kit yüzdesiİşlenmiş numuneler
48272.6% (350/482)36270.4% (255/362)demek891.1 (224/246)8.9 (22/246)4,080
Medyan3

Tablo 4:SAYılarla SARS-CoV-2 için swabbing. Sosyal yardım ve örnekleme başarı oranları. Kısaltma: SARS-CoV-2 = şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2.

Tartışmalar

Vatandaş bilim adamı nişanı. Vatandaş bilim adamları, SARS-CoV-2'nin kentsel ortamdaki varlığını örnek almak ve tespit etmek için San Diego County'deki yüzeyleri taramak için işe alındı. Teslim edilen örnekleme kitlerinin çoğu (%70) laboratuvara iade edildi ve bunların neredeyse tüm örnekleri tamamlandı (%91) (Şekil 3A,B ve Tablo 4). Gönüllüler, web tabanlı platform üzerinden kolayca kit teslimi / teslim alma talep edebilir ve teslimat rotası planlama yazılımı, vatandaş bilim insanlarına tahmini varış zamanlarını, her ikisi de gözlemlenen başarı için muhtemelen önemli faktörleri bildirdi. Kitin vatandaş bilim adamına teslim edildiğinden laboratuvara geri döndüğü zamana kadar geçen ortalama süre 8 gün, 3 gün ortanca ve 1-64 gün aralığı (Şekil 3A ve Tablo 4)idi. Gönüllülere daha sık yapılan hatırlatmalar büyük olasılıkla bu gecikme süresini azaltacaktır.

Veri toplama platformu, kullanıcıların büyük bir çoğunluğu tarafından başarıyla kullanıldı (%73) (Tablo 4). Vatandaş bilim insanlarının çabaları ölçülmezken, saha testleri veri toplama platformunun örnek toplamayı düzgün bir şekilde tamamlamak için gereken çabayı ve zamanı önemli ölçüde azalttığını gösterdi. Böylece, muhasebe miktarını azaltmak, vatandaş bilim adamı katılımını teşvik etti. Web tabanlı platform, çok dilli bir sinir makinesi çeviri hizmeti sunarak ve İngilizce ve İspanyolca grafik ve görsel-işitsel protokoller sağlayarak demografik sınırlamaların üstesinden gelmeyi amaçlamıştır. Bu, hem Güney Körfezi'nden hem de ilçenin Hispanik / Latin nüfusunun çoğunun45ikamet ettiği North County'den daha az örnek toplandığı için sadece kısmen başarılı oldu. Bu bölgeler ayrıca San Diego county'deki toplam COVID-19 vakalarının% 63'ünü (100.000'de 1.700 vaka) barındırıyor ve hastalığın en yüksek yaygınlığı46 ve hastaneye yatış oranı (%62)47,48. Örneklerin çoğu Central County'den gelmesine rağmen, en çok COVID-19 etkilenen bölgelerden temsili bir sayı toplandı ve örneklerin sadece küçük bir kısmı pozitifti, bu da kentsel ortamdaKI SARS-CoV-2 yüzey rezervuarlarının nispeten nadir olduğunu gösteriyor.

Örnek işleme. Örnekleme sürüntüleri, zarfını bozarak virüsü inaktive eden ve RNases32'yiaçarak çıplak RNA'yı stabilize eden SDS ile ıslatıldı. Toplama sırasında, çubuktaki deterjan örneklenen yüzeyi temizledi. Çevresel numuneler genellikle çok az miktarda RNA içerir. Kurtarmayı en üst düzeye çıkarmak için, RNA yalıtımı GITC tabanlı, sütunsuz, ham çıkarma yöntemi kullanılarak gerçekleştirildi. Güçlü bir chaotropik ajan olan GITC, protein katlamayı (yani hidrofobik etkiyi) koruyan hidrojen bağlarını bozar. Bu eylem viral parçacıkların inaktivasyonu ile sonuçlanır ve RNA,RNA'larıninhibisyonu nedeniyle sabit kalır 34,35,36. GITC çözümü, RNA numunelerinin stabilitesini sıkı soğuk zincir hususları olmadan korudu ve bu da sağlanan buz paketleri için bir dondurucu mevcut değilse vatandaşların numuneleri oda sıcaklığında tutmasını sağladı. Doğrudan cilt veya mukozal temas meydana geldiğinde bu reaktifin oluşturmuş olma potansiyelini azaltmak için kite sağlanan bir malzeme güvenliği veri sayfasının dahil edilmesiyle vatandaşlar bu risklerden haberdar edildi ve tüplerin bulunduğu kutuya uyarı mührü yerleştirildi.

Ham GITC-kloroform ekstraksiyon yöntemi, sürüntülerden RNA izlerinin geri kazanılmasına yardımcı oldu ve çivili örneklerin amplifikasyonunda gösterildiği gibi, inhibitörler ekstraksiyondan sonra örneklerde nadiren devam etti. SARS-CoV-2 için negatif olan ve RT-LAMP inhibisyonu göstermeyen örnekler, gerçek negatifleri temsil ediyordu veya %100 frekansta LOD'den daha düşük bir kopya numarasına sahipti. Tersine, viral RNA'nın bir yüzeyde tespit edilmesi, virüsün pozitif örneklerden enfeksiyozitesinin test edilmesi gerektiğinden, doğrudan temas yoluyla bulaşma riski anlamına gelmez. Sofistike malzemelerin veya yüksek nitelikli personelin mevcudiyeti ile sınırlı olmamak üzere çevrenin hızlı bir şekilde taranması, yüzeylerin viral bir rezervuar oluşturup oluşturmadığını değerlendirmek ve önleme ve çevreleme çabalarını daha iyi yönlendirmek için çok önemlidir.

RT-LAMP, önerilen algılama ardışık düzeni için uygun en iyi yöntem olarak seçildi. Kalan inhibitörlerin çoğuna karşı oldukça dirençli ve diğer RT-qPCR yöntemleri kadar hassas ve spesifik olan hızlı ve ucuz bir yöntem olduğu kanıtlanmıştır. SARS-CoV-2 pandemisi sırasında klinik ortamlarda kullanımları nedeniyle, RT-qPCR kitlerinin kullanılabilirliği küresel talepten etkilendi. Dahası, RT-qPCR teknikleri - inhibitörlere direnmek için formüle edilmiş olanlar bile - enzim bağlama49için inhibitör rekabetini azaltmak için diğer ortak stratejilerin kullanılmasından sonra bile, vatandaş bilim adamlarından oluşan bir pilot kohort tarafından toplanan çevresel örneklerde bulunan maddelere duyarlıydı. Bu bulgular, COVID-19 hastaları tarafından ele alınan şekerlerden alınan svap örneklerinde SARS-CoV-2'yi tespit etmek için her iki yöntemi de karşılaştıran ve RT-LAMP 15 tarafındananaliz edilen örneklerde% 25 daha düşük inhibisyon ile% 83'ün üzerinde sonuç uyumu bulan yeni bir çalışma ile doğrulanmaktadır. Ayrıca, GITC-kloroform ham ekstraksiyonu, RT-LAMP ile birleştiğinde, reaktiflerin ve malzemelerin maliyetini RNA kit ekstraksiyonu ve RT-qPCR (Malzeme Masası)ile karşılaştırıldığında% 42 azalttı.

Bu yöntem, binlerce yüzey çubuğu örneğinin yüksek verim analizine izin verildi. RNA ekstraksiyonundan RT-LAMP ile SARS-CoV-2 algılamasına kadar 2 günde 640 örneği temsil eden 80'e kadar havuz işlendi. Önerilen protokol yarı niteliktedir, viral RNA'nın tespiti ile sınırlıdır ve enfektif viral parçacıkların varlığını göstermez. SARS-CoV-2'nin sürünmüş yüzeylerde bulunan enfekte fomitlerden bulaşma riskini değerlendirmek için daha fazla analiz yapılması gerekmektedir.

Bu çalışma, bulaşıcı bir hastalığa sahip bir sağlık acil durumuyla karşı karşıya kaldığında etkili bir iş akışı içeren bir test stratejisini hızlı bir şekilde kurmak için bir protokol salamaktadır. Önerilen örnekleme protokolü basittir ve evlerde yaygın olarak bulunan malzemeleri kullanır ve viral algılama yöntemi, termosikler yerine su banyosu gibi temel laboratuvar ortamlarında bulunan ekipmanlarda gerçekleştirilir. RT-LAMP reaktiflerinin maliyetleri RT-qPCR için gerekenden önemli ölçüde daha düşüktür ve yüksek küresel talep senaryolarına daha az duyarlıdır. Bu çalışma, gelecekteki salgın salgınlarda ve küresel pandemilerde çevresel viral rezervuarların değerlendirilmesi için bir çerçeve görevi görür.

Açıklamalar

Tüm yazarlar rakip çıkarların olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

Viral Bilgi Enstitüsü (VII) araştırmacıları Dr. Anca M. Segall, Willow Segall, Patricia L. Rohwer, Gary Rohwer, Cary L. Rohwer, Magda Silvia Pinetta, Elizabeth Cruz Cano, Dr. Gregory Peters, Dr. Stuart A. Sandin ve Dr. Jennifer Smith'e çok sayıda örnek toplamak için zaman ayırarak teşekkür ediyoruz. Ayrıca San Diego Kaliforniya Tıp Fakültesi (UCSD) Pediatri Bölümünden Dr. Rob Knight, Dr. Jack Gilbert, Dr. Pedro Balda-Ferre ve Dr. Sarah Allard'a olumlu kontrolleri ve yararlı geri bildirimleri kolaylaştıranlar için teşekkür ederiz. Lojistik destek için Stacey Carota (SDSU Bilimler Koleji) ve Gina Spidel'e (SDSU) ve örnekleme protokolünün sanatı ve grafik tasarımı için Juan Rodríguez'e teşekkür ederiz. Tüm katılımcılara çok zor zamanlarda bu projeye olan bağlılıkları ve özverileri için teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, Dr. Jo Ann Lane (SDSU Bilimler Koleji) ve Ulusal Bilim Vakfı RAPID: Sars-CoV-2'nin Çevre Rezervuarları hibesinin cömert bir bağışı ile desteklendi (Ödül Numarası: 2030479).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
SMP, LIMS, and community outreach:
Authentication Application Programming InterfaceGoogleGoogle Sign-In
Commercial hosting platformGoDaddy
Data Charting Application Programming InterfaceGoogleGoogle Charts
Database softwareMySQL 
Delivery route planning software CircuitCircuit for Teams
Free email serviceGoogleGoogle Email
Geospatial Application Programming InterfaceGoogleGoogle Maps API
Multilingual neural machine translation serviceGoogleGoogle Translate
Online formGoogleGoogle Form
Operating systemLinux
Web and database development Big Rose Web Design
Web server softwareApache 
Sampling kit:
CoolersColeman (Amazon)B00363X3F2Cost (US$) per 100 rxns: 70
Gallon Ziploc bagsSolimo (Amazon)B07BJ495GLCost (US$) per 100 rxns: 18
Glycerol (hand sanitizer)FischerScientificG33-4Cost (US$) per 100 rxns: 9
Ice packsIce-Brix (Amazon)B075GLD3X1Cost (US$) per 100 rxns: 110
Isopropanol (hand sanitizer)FischerScientificAA36644K7Cost (US$) per 100 rxns: 43
KN95 masksEcho-SigmaEcho-SigmaCost (US$) per 100 rxns: 400
Paper for Protocols and Trizol Safety SheetOffice Depot348037Cost (US$) per 100 rxns: 36
30 mL spray bottles (SDS and hand sanitizer)Anyumocz (Amazon)B07T64FHXRCost (US$) per 100 rxns: 80
RNase, DNase, DNA & PCR inhibitors free Microcentrifuge tubesGenesee Scientific22-281Cost (US$) per 100 rxns: 83
Sample ID solvent resistant labelsLABTAGXST-10C1-1WHCost (US$) per 100 rxns: 68
Swiffer WetJet pads (swabs)Swiffer (Amazon)B001F0RBT2Cost (US$) per 100 rxns: 8
ToothpicksKitchen Essential (Amazon)B00PBK4NG6Cost (US$) per 100 rxns: 8
Trizol Reagent (guanidinium isothiocyanate solution - GITC), not LSInvitrogen15596018Cost (US$) per 100 rxns: 40
Tube boxesGenesee Scientific21-119Cost (US$) per 100 rxns: 180
Small Ziploc bagsZiploc (Amazon)B01LRKEI9KCost (US$) per 100 rxns: 8
Zebra Thermal Transfer Desktop Printer ZebraGK420t
Total Sampling kit Cost (US$) per 100 rxns: 1,160
Trizol RNA extraction:
Ammonium Acetate RNase-freeInvitrogenAM9070GCost (US$) per 100 rxns: 2
ChloroformFisherScientificC298-500Cost (US$) per 100 rxns: 2
GlycoBlue (glycogen 15 mg/mL)InvitrogenAM9515Cost (US$) per 100 rxns: 80
Molecular-grade absolute (200 proof) EthanolFisherScientificBP2818500Cost (US$) per 100 rxns: 30
Molecular-grade IsopropanolFisherScientificBP2618500Cost (US$) per 100 rxns: 3
TURBO DNA-free Kit InvitrogenAM1907Cost (US$) per 100 rxns: 110
Multiplexed colorimetric RT-LAMP:
Guanidine HydrochlorideAlfa AesarAAJ6548522Cost (US$) per 100 rxns: 1
RT-LAMP E1-PrimersIDTn/aCost (US$) per 100 rxns: 7
RT-LAMP N2-PrimersIDTn/aCost (US$) per 100 rxns: 7
Synthetic SARS-CoV-2 RNAATCCVR-3276SDCost (US$) per 100 rxns: 14
WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix with UDGNEBM1800SCost (US$) per 100 rxns: 210
Eppendorf Mastercycler Pro Thermal CyclerEppendorf950030010
Total Trizol RNA extraction + LAMP Cost (US$) per 100 rxns: 470
Kit for RNA extraction:
QIAamp DSP Viral RNA Mini KitQiagen61904Cost (US$) per 100 rxns: 570
RT-qPCR:
Synthetic SARS-CoV-2 RNAATCCVR-3276SDCost (US$) per 100 rxns: 14
TaqMan Fast Virus 1-Step Master MixApplied Biosystems4444432Cost (US$) per 100 rxns: 180
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) N1,N2 Primers and ProbesIDT10006713Cost (US$) per 100 rxns: 20
qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMixQuantabio95132-100
QuantiNova Pathogen Qiagen208652
QuantiNova ProbeQiagen208352
UltraPlex 1-Step ToughMix Quantabio95166-100
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection SystemBioRad1855196
Kit for RNA extraction + RT-qPCR Cost (US$) per 100 rxns: 790 
RT-PCR:
SuperScript IV One-Step RT-PCR Invitrogen12594025
Lab cleanup:
DNAZapInvitrogenAM9890
RNAZapInvitrogenAM9780

Referanslar

  1. Alsved, M., et al. Exhaled respiratory particles during singing and talking. Aerosol Science and Technology. 54 (11), 1245-1248 (2020).
  2. Morawska, L., Cao, J. Airborne transmission of SARS-CoV-2: The world should face the reality. Environment International. 139, 105730(2020).
  3. Stadnytskyi, V., Bax, C. E., Bax, A., Anfinrud, P. The airborne lifetime of small speech droplets and their potential importance in SARS-CoV-2 transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (22), 11875-11877 (2020).
  4. Yu, I. T. S., et al. Evidence of Airborne Transmission of the Severe Acute Respiratory Syndrome Virus. New England Journal of Medicine. 350 (17), 1731-1739 (2004).
  5. Coronavirus disease (COVID-19): How is it transmitted. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/question-and-answers-hub/q-a-detail/coronavirus-disease-covid-19-how-is-it-transmitted (2020).
  6. How COVID-19 Spreads. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/prevent-getting-sick/how-covid-spreads.html (2020).
  7. Moriarty, L. F., et al. Public Health Responses to COVID-19 Outbreaks on Cruise Ships - Worldwide, February-March 2020. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (12), 347-352 (2020).
  8. Cheng, V. C. -C., et al. Air and environmental sampling for SARS-CoV-2 around hospitalized patients with coronavirus disease 2019 (COVID-19). Infection Control and Hospital Epidemiology. , 1-8 (2020).
  9. Van Doremalen, N., et al. Aerosol and surface stability of SARS-CoV-2 as compared with SARS-CoV-1. New England Journal of Medicine. 382 (16), 1564-1567 (2020).
  10. Liu, Y., et al. Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals. Nature. 582, 557-560 (2020).
  11. Butler, D. J., et al. Shotgun transcriptome and isothermal profiling of SARS-CoV-2 infection reveals unique host responses, viral diversification, and drug interactions. bioRxiv. , (2020).
  12. Döhla, M., et al. SARS-CoV-2 in environmental samples of quarantined households. medRxiv. , (2020).
  13. Ikonen, N., et al. Deposition of respiratory virus pathogens on frequently touched surfaces at airports. BMC Infectious Diseases. 18, 437(2018).
  14. Chia, P. Y., et al. Detection of air and surface contamination by SARS-CoV-2 in hospital rooms of infected patients. Nature Communications. 11 (1), 2800(2020).
  15. Salido, R. A., et al. Handwashing and detergent treatment greatly reduce SARS-CoV-2 viral load on Halloween candy handled by COVID-19 patients. mSystems. 5, 01074(2020).
  16. Chan, J. F. W., et al. Improved molecular diagnosis of COVID-19 by the novel, highly sensitive and specific COVID-19-RdRp/Hel real-time reverse transcription-PCR assay validated in vitro and with clinical specimens. Journal of Clinical Microbiology. 58 (5), 00310-00320 (2020).
  17. Dao Thi, V. L., et al. A colorimetric RT-LAMP assay and LAMP-sequencing for detecting SARS-CoV-2 RNA in clinical samples. Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).
  18. Rauch, J., et al. A scalable, easy-to-deploy, protocol for Cas13-based detection of SARS-CoV-2 genetic material. bioRxiv. , (2020).
  19. Zhang, F., Abudayyeh, O. O., Gootenberg, J. S. A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics. , Available from: https://www.broadinstitute.org/files/publications/special/COVID-119%20detection%20(updated).pdf (2020).
  20. Zhang, Y., et al. Rapid molecular detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) virus RNA using colorimetric LAMP. medRxiv. , (2020).
  21. Zhang, Y., et al. Enhancing colorimetric loop-mediated isothermal amplification speed and sensitivity with guanidine chloride. BioTechniques. 69 (3), 179-185 (2020).
  22. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nature Biotechnology. 38, 870-874 (2020).
  23. Lucia, C., Federico, P. -B., Alejandra, G. C. An ultrasensitive, rapid, and portable coronavirus SARS-CoV-2 sequence detection method based on CRISPR-Cas12. bioRxiv. , (2020).
  24. Danko, D., et al. Global genetic cartography of urban metagenomes and anti-microbial resistance. bioRxiv. , (2020).
  25. Parida, M., et al. Rapid detection and differentiation of dengue virus serotypes by a real-time reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification assay. Journal of Clinical Microbiology. 43 (6), 2895-2903 (2005).
  26. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic acids research. 28 (12), 63(2000).
  27. Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
  28. Zhang, Y., et al. Enhancing colorimetric loop-mediated isothermal amplification speed and sensitivity with guanidine chloride. BioTechniques. 69 (3), 179-186 (2020).
  29. Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. Visual detection of isothermal nucleic acid amplification using pH-sensitive dyes. BioTechniques. 58 (2), 59-68 (2015).
  30. Curtis, K. A., Rudolph, D. L., Owen, S. M. Rapid detection of HIV-1 by reverse-transcription, loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). Journal of Virological Methods. 151 (2), 264-270 (2008).
  31. OAuth 2.0. Internet Engineering Task Force (IETF. , Available from: https://oauth.net/2/ (2012).
  32. Naidu, K. T., Prabhu, N. P. Protein-surfactant interaction: Sodium dodecyl sulfate-induced unfolding of ribonuclease A. Journal of Physical Chemistry B. 115 (49), 14760-14767 (2011).
  33. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
  34. Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: Twenty-something years on. Nature Protocols. 1 (2), 581-585 (2006).
  35. Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol® extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-472 (2007).
  36. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
  37. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Ethanol precipitation of RNA and the use of carriers. Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
  38. Wallace, D. M. Precipitation of nucleic acids. Methods in Enzymology. 152, 41-48 (1987).
  39. COVID-19 Dashboard. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.arcgis.com/apps/opsdashboard/index.html#/96feda77f12f46638b984fcb1d17bd24 (2020).
  40. CDC 2019-novel Coronavirus (2019-nCoV) real-time RT-PCR diagnostic panel. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.fda.gov/media/134922/download (2020).
  41. Corman, V. M., et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Eurosurveillance. 25 (3), 2000045(2020).
  42. Lizardi, P. M., et al. Mutation detection and single-molecule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nature Genetics. 19, 225-232 (1998).
  43. Johne, R., Müller, H., Rector, A., van Ranst, M., Stevens, H. Rolling-circle amplification of viral DNA genomes using phi29 polymerase. Trends in Microbiology. 17 (5), 205-211 (2009).
  44. Wang, B., et al. Rapid and sensitive detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus by rolling circle amplification. Journal of Clinical Microbiology. 43 (5), 2339-2344 (2005).
  45. Population of Mexican origin in San Diego County. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.sandiegocounty.gov/content/dam/sdc/hhsa/programs/phs/CHS/ENGLISH VERSION_Mexican Origin.pdf (2020).
  46. COVID-19 city of residence MAP. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.sandiegocounty.gov/content/dam/sdc/hhsa/programs/phs/Epidemiology/COVID-19 City of Residence_MAP.pdf (2020).
  47. COVID-19 hospitalizations summary. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.sandiegocounty.gov/content/dam/sdc/hhsa/programs/phs/ Epidemiology/COVID-19 Hospitalizations Summary_ALL.pdf (2020).
  48. COVID-19 race and ethnicity Summary. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.sandiegocounty.gov/content/dam/sdc/hhsa/programs/ phs/Epidemiology/COVID-19 Race and Ethnicity Summary.pdf (2020).
  49. Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 170evresel viral rezervuarlarfomit RNA vir slerik resel sa l kiddetli akut solunum sendromu coronavirus 2 SARS CoV 2koronavir s hastal 2019 COVID 19ters transkripsiyon d ng s arac l izotermal amplifikasyon RT LAMPmolek ler epidemiyolojiviral d k lmevatanda bilimi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır