JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الآلية المرتبطة البلعمة في عدوى الليشمانيا لا تزال غير مفهومة بشكل جيد. هنا ، نصف طرق لتقييم الأحداث المبكرة التي تحدث أثناء تفاعل الليشمانيا مع الخلايا المضيفة.

Abstract

البلعمة هي عملية منسقة تتضمن خطوات متميزة: التعرف والربط والاستيعاب. تأخذ الخلايا البلعمية الاحترافية طفيليات الليشمانيا عن طريق البلعمة ، والتي تتكون من التعرف على الأربطة على أسطح الطفيليات بواسطة مستقبلات الخلايا المضيفة المتعددة. يحدث ارتباط الليشمانيا بأغشية البلاعم من خلال مستقبلات المكمل من النوع 1 (CR1) والمستقبلات المكملة من النوع 3 (CR3) ومستقبلات التعرف على الأنماط. Lipophosphoglycan (LPG) و 63 kDa glycoprotein (gp63) هي الروابط الرئيسية المشاركة في تفاعلات البلاعم والليشمانيا . بعد التعرف الأولي على روابط الطفيليات بواسطة مستقبلات الخلايا المضيفة ، تصبح الطفيليات داخلية وتبقى على قيد الحياة وتتكاثر داخل الفجوات الطفيلية. تتضمن عملية نضج الفجوات التي يسببها الليشمانيا الحصول على جزيئات من الحويصلات داخل الخلايا ، بما في ذلك بروتين G الأحادي Rab 5 و Rab 7 ، وبروتين الغشاء المرتبط بالليزوسومات 1 (LAMP-1) ، وبروتين الغشاء المرتبط بالليزوسومات 2 (LAMP-2) ، والبروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة 1A / 1B-light chain 3 (LC3).

هنا ، نصف طرقا لتقييم الأحداث المبكرة التي تحدث أثناء تفاعل الليشمانيا مع الخلايا المضيفة باستخدام المجهر البؤري ، بما في ذلك (i) الربط (ii) الاستيعاب ، و (iii) نضج البلعمة. من خلال إضافة مجموعة المعرفة المحيطة بهذه المحددات لنتائج العدوى ، نأمل في تحسين فهم التسبب في عدوى الليشمانيا ودعم البحث النهائي عن أهداف جديدة للعلاج الكيميائي.

Introduction

داء الليشمانيات هو مرض استوائي مهمل تسببه طفيليات البروتوزوان من جنس الليشمانيا ، مما يؤدي إلى مجموعة واسعة من المظاهر السريرية في مضيف الفقاريات ، بما في ذلك داء الليشمانيات الجلدي ، داء الليشمانيات المخاطي الجلدي وداء الليشمانيات الحشوي 1. تقدر منظمة الصحة العالمية (WHO) أن أكثر من مليار شخص معرضون للخطر ، مع الإبلاغ عن أكثر من مليون حالة جديدة سنويا2.

الليشمانيا spp. هي بدائيات ملزمة داخل الخلايا التي تعيش داخل الخلايا المضيفة ، بما في ذلك الخلايا الوحيدة والبلاعم والخلايا المتغصنة3. تفاعل الليشمانيا والبلاعم هو عملية معقدة تنطوي على مستقبلات متعددة للخلايا المضيفة وروابط طفيليات إما من خلال التفاعل المباشر أو عن طريق opsonization التي تنطوي على مستقبلات تكميلية 4,5. مستقبلات السطح الكلاسيكية ، مثل CR1 ، CR3 ، mannose-fucose ، fibronectin ، مستقبلات تشبه الرسوم والزبال ، تتوسط ارتباط الطفيلي بالبلاعم 6,7,8. تتعرف هذه المستقبلات على الجزيئات الموجودة على سطح الليشمانيا ، بما في ذلك البروتين السكري 63 kDa (gp63) و glycolipid lipophosphoglycan (LPG)9. هذه هي الجزيئات الأكثر وفرة على سطح promastigotes وتلعب دورا أساسيا في تخريب الاستجابة المناعية للمضيف ، وتفضل إنشاء عدوى الطفيليات في خلايا الثدييات10. بعد أن ترتبط روابط سطح الطفيليات بمستقبلات البلاعم ، يتراكم F-actin على أسطح خلايا الثدييات ، والطفيليات المحيطة بها أثناء البلعمة. في وقت لاحق ، يؤدي هذا إلى تكوين حجرة مستحثة بالطفيليات تسمى الفجوة الطفيلية (PV) ، والتي تقدم ميزات البلعمة11. بمجرد دخول هذه البلعمة ، تخضع الطفيليات لعدة تعديلات ضرورية للبقاء على قيد الحياة والتكاثر3.

التولد الحيوي للكهروضوئيات هو عملية اتجار غشاء عالية التنظيم حاسمة لبقاء هذا العامل الممرض داخل الخلايا12. ينتج تكوين هذه المقصورة عن أحداث اندماج متسلسلة بين البلعمة ومقصورات المسار الداخلي للمضيف. كشفت دراسات بيولوجيا الخلية الكلاسيكية أن نضوج الخلايا الكهروضوئية ينطوي على الحصول على بروتين G الأحادي Rab 5 و Rab 7 ، والتي ترتبط بشكل رئيسي بنضج البطانة المبكرة والمتأخرة ، على التوالي13. بالإضافة إلى ذلك ، تكتسب هذه المقصورات بروتينات الغشاء المرتبطة بالليزوسوم 1 و 2 (LAMP 1 ، LAMP 2) ، ومكونات البروتين الرئيسية للغشاء الليزوزومي والبروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة 1A / 1B - سلسلة الضوء 3 (LC3) ، وهي علامة البلعمة الذاتية14. على الرغم من أوجه التشابه الواضحة ، فإن حركية التكوين الكهروضوئي 15,16 ومورفولوجيا هذه المقصورات تختلف اعتمادا على أنواع الليشمانيا. على سبيل المثال ، العدوى التي تسببها L. mexicana أو L. amazonensis تحفز على تكوين مقصورات كبيرة تحتوي على عدد كبير من الطفيليات17. على النقيض من ذلك ، تشكل الأنواع الأخرى ، مثل L. braziliensis و L. infantum ، فجوات أصغر تحتوي عادة على طفيلي واحد أو اثنين فقط في كل فجوة18.

على الرغم من هذه المعرفة المحيطة بتفاعل خلية المضيف مع الليشمانيا ، إلا أن الأحداث الأولية الناجمة عن الاتصال بين مستقبلات المضيف وروابط الطفيليات لم يتم توضيحها بالكامل. ومن المعروف أن هذه الأحداث هي محددات لنتائج العدوى الطفيلية وتعتمد على أنواع الطفيليات ، ونوع مستقبلات الخلايا المضيفة التي تم تجنيدها للتعرف على الطفيليات وتنشيط مسارات إشارات البلاعم 19,20. لذلك ، من الضروري تحديد الجزيئات المشاركة في التكوين الحيوي للكائنات الكهروضوئية التي يسببها الليشمانيا وتحديد الدور (الأدوار) التي تلعبها هذه الجزيئات في إنشاء العدوى ونتائجها. هنا ، نصف طريقة لرصد الأحداث المبكرة التي تحدث أثناء البلعمة في الليشمانيا ، بما في ذلك الربط والاستيعاب وتكوين البلعمة والنضج. يمكن أن يساعد هذا العمل في توضيح مشاركة PLC و Akt و Rab5 و Rab7 و LC3 في تكوين PVs التي تسببها أنواع مختلفة من الليشمانيا. الأهم من ذلك ، يمكن استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في مشاركة البروتينات الأخرى المشاركة في النضج الكهروضوئي. ستوسع الدراسات المستقبلية المعرفة المحيطة بالآليات المشاركة في تفاعل الخلايا المضيفة بين الليشمانيا وتساهم في تصميم استراتيجيات جديدة للعلاج الكيميائي.

Protocol

تم الحصول على الخلايا من متبرعين أصحاء بعد الموافقة على الإجراءات من قبل اللجان الوطنية لأخلاقيات البحث (ID: 94648218.8.0000.0040).

1. مزارع الخلايا

  1. البلاعم البشرية المشتقة من الخلايا الأحادية
    ملاحظة: للحصول على البلاعم المشتقة من الخلايا الأحادية البشرية للتمايز في المختبر إلى بلاعم ، قم بجمع الدم من متبرعين أصحاء وتنقية خلايا الدم أحادية النواة الطرفية (PBMC) كما هو موضح من قبل D. English و B. R. Andersen21.
    1. بعد جمع الدم المحيطي (50 مل) ، اسكبه في أنبوب هيبارين ثم قم بتخفيف الدم 1: 1 في محلول عازل للفوسفات (PBS) في درجة حرارة الغرفة. ضع الدم الهيباريني المخفف برفق فوق وسط تدرج الكثافة الموزع سابقا.
    2. قم بطرد الأنابيب مركزيا عند 252 × جم لمدة 30 دقيقة عند 24 درجة مئوية لتجنب انحلال الدم.
      ملاحظة: اضبط فصل أجهزة الطرد المركزي لتجنب خلط الطبقات المتدرجة. بعد الطرد المركزي ، تتشكل طبقات التدرج المتقطعة من الأسفل إلى الأعلى: كريات الدم الحمراء ، وسط تدرج الكثافة ، حلقة PBMC والبلازما.
    3. انقل حلقة PBMC ، الموجودة بين وسط تدرج الكثافة وطبقات البلازما ، إلى أنبوب جديد واملأها ب PBS لغسل وسط تدرج الكثافة الزائدة.
    4. اغسل الخلايا مرة واحدة وجهاز طرد مركزي عند 190 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    5. تخلص من الحبيبة الفائقة وأعد تعليق الكريات في 1 مل من وسط RPMI الكامل.
    6. عد الخلايا والصفيحة 2 × 106 خلايا في 500 مل من معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) المكملة ب 25 mM N-[2-hydroxyethyl] piperazine-N′-[2-ethane sulfonic acid] (HEPES) ، 2 جم / لتر بيكربونات الصوديوم ، 2 mM glutamine ، 20 g / mL ciprofloxacin و 10٪ مصل الجنين البقري المعطل (FBS) (وسط RPMI الكامل) لمدة 7 أيام عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2 في لوحة 24 بئر للسماح للخلايا الوحيدة بالتمايز إلى البلاعم عن طريق الالتصاق.
  2. ثقافات THP-1
    1. تنمو خط خلية THP-1 بتركيز 2 × 105 خلايا في 10 مل من وسط RPMI الكامل في قارورة ثقافة 75 سم2 .
    2. الحفاظ على مزارع الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2 لمدة 7 أيام.
    3. خلايا الطرد المركزي عند 720 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وإعادة تعليق الكريات في وسط RPMI كامل.
    4. عد الخلايا في غرفة نيوباور.
    5. خلايا صفيحة على أغطية زجاجية 13 مم بتركيز 2 × 10 5 خلايا لكل بئر في 500 ميكرولتر من وسط RPMI الكامل الذي يحتوي على 100 نانومتر من خلات ميروستات ميريستات (PMA) عند 37 درجة مئوية تحت5 ٪ CO2 للسماح بتمايز خلايا THP1 إلى بلاعم.
    6. بعد ثلاثة أيام ، اغسل خليتين بمحلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪ لإزالة الوسط الذي يحتوي على PMA.
    7. احتضان خلايا THP-1 المتمايزة في وسط RPMI كامل خال من PMA عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2 لمدة يومين إضافيين قبل بدء التجريب.

2. ثقافات الطفيليات وتلطيخ CellTracker الأحمر

ملاحظة: لتصور الطفيليات من خلال الفحص المجهري الفلوري ، قم بإجراء تلطيخ باستخدام صبغة الفلورسنت الأحمر CellTracker (CMTPX). بدلا من ذلك ، يمكن استخدام علامات أخرى ، بما في ذلك كربوكسي فلوريسين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة أو promastigotes التي تعبر بشكل أساسي عن GFP أو RFP أو غيرها من جينات مراسل الفلورسنت. الطفيليات المستخدمة لإصابة الخلايا هي تلك الموجودة في مرحلة ثابتة من النمو تم الحصول عليها من ثقافة محورية promastigote لا تزيد عن 7 ممرات.

  1. تنمو الليشمانيا spp. promastigotes في 1 × 10 5 طفيليات لكل 1000 ميكرولتر من الوسط في قارورة مزرعة الخلية التي تحتوي على5 مل من وسط شنايدر مع 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين و 10٪ FBS.
  2. بعد احتضان الثقافات المحورية الطفيلية في الطلب على الأكسجين الكيميائي الحيوي (B.O.D.) عند 24 درجة مئوية ، قم بإجراء العد اليومي في غرفة نيوباور. تحقق من شكل الطفيلي (رقيقة ، ممدودة) والتنقل لمدة 5 أيام. تعتبر الطفيليات في مرحلة ثابتة من النمو عندما تعرض تهمتان متتاليتان مع 8 ساعات من الفاصل الزمني كميات مماثلة.
  3. عند الوصول إلى المرحلة الثابتة من النمو ، احتضن الطفيليات في 4 مل من محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪ مع 1 ميكرومتر CMTPX لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2 لتجنب ملامسة الضوء.
  4. أضف FBS بنسبة 1: 1 واحتضن تعليق الطفيلي لمدة دقيقة إضافية.
  5. اغسل الطفيليات ثلاث مرات باستخدام PBS ، يليه الطرد المركزي عند 1,781 × جم لمدة 10 دقائق.
  6. إعادة تعليق بيليه الطفيلي في 1000 ميكرولتر من الوسط الكامل RPMI.
  7. عد الطفيليات في غرفة نيوباور.

3. تقييم ارتباط الليشمانيا بالبلاعم

  1. البذور 2 × 105 خلايا THP-1 أو البلاعم البشرية المشتقة من الخلايا الأحادية في 500 ميكرولتر من وسط RPMI الكامل لكل بئر على لوحة 24 بئرا مع أغطية زجاجية 13 مم.
  2. زراعة الخلايا في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
  3. اغسل الخلايا مرتين بمحلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪ واحتضنها في وسط RPMI كامل عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
  4. أضف بروماستيغوتات الطور الثابت كما هو موضح من قبل A. L. Petersen22 بنسبة 10: 1 إلى ألواح الآبار ، ثم جهاز طرد مركزي عند 720 × جم لمدة 5 دقائق تحت 4 درجات مئوية.
  5. تحضن في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  6. اغسل الخلايا مرتين بمحلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪ لإزالة أي بروماستيغوتات غير داخلية.
  7. إصلاح الخلايا في 4 ٪ بارافورمالديهايد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  8. احتضن الأغطية ب 15 mM NH4Cl لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  9. اغسل ثلاث مرات باستخدام ألبومين مصل البقر PBS بنسبة 0.15٪ (BSA). احتضان مع حل حجب (3٪ BSA في PBS) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  10. اغسل ثلاث مرات باستخدام PBS ثم تخلل 0.15٪ PBS-Saponin لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  11. أضف الفيلويدين (المخفف 1:1,200) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة واحميه من الضوء.
  12. قم بتركيب الأغطية باستخدام وسائط التركيب.
  13. احصل على صور عبر مجهر فلوري متحد البؤرة باستخدام هدف 63×/1.4.

4. تقييم البلعمة الليشمانيا بواسطة البلاعم

  1. البذور 2 × 105 خلايا THP-1 أو البلاعم البشرية المشتقة من الخلايا الأحادية في 500 ميكرولتر من وسط RPMI الكامل لكل بئر على لوحة 24 بئرا مع أغطية زجاجية 13 مم.
  2. زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
  3. اغسل الخلايا مرتين في محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪ واحتضنها في وسط RPMI كامل في صفيحة 24 بئرا عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
  4. أضف المرحلة الثابتة Leishmania spp. كما هو موضح من قبل A. L. Petersen22 بنسبة 10: 1 (الطفيلي: الخلية المضيفة) ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 720 × جم لمدة 10 دقائق تحت 4 درجات مئوية.
  5. احتضان الخلايا عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  6. اغسل الخلايا مرتين بمحلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪ لإزالة أي بروماستيغوتات غير داخلية.
  7. احتضان الخلايا في وسط RPMI مكمل عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  8. إصلاح الخلايا مع 4 ٪ بارافورمالديهايد لمدة 15 دقيقة.
  9. أغطية التثبيت باستخدام وسائط التركيب المفضلة.
  10. عد ما لا يقل عن 400 خلية في حقول عشوائية تحت مجهر التألق باستخدام هدف 100× / 1.4.

5. تقييم نضج الفجوات الناجم عن الليشمانيا

ملاحظة: يجب إجراء نقل الخلايا THP-1 كما هو موضح من قبل M. B. Maess و B. Wittig و S. Lorkowski 23. هنا نلخص هذا البروتوكول ، مع الحد الأدنى من التعديلات. Nucleofection هي طريقة نقل محددة تتطلب nucleofector. كطريقة بديلة ، يمكن نقل الخلايا باستخدام lipofectamine24 و lentivirus transduction25.

  1. للتحقيق في التكوين الحيوي للخلايا الكهروضوئية التي يسببها الليشمانيا ، قم بنقل خلايا THP1 مع PLC 26,27 أو Akt 26,27 أو Rab 5 28,29,30 أو Rab 728,29,31 plasmids.
    ملاحظة: يمكن استخدام هذه المنهجية لنقل خلايا THP-1 بجينات أخرى غير تلك المذكورة أعلاه.
  2. خلايا THP-1 البذور في 1.5 × 107 في 75 سم مربع قوارير زراعة الأنسجة التي تحتوي على 10 مل كاملة RPMI المتوسطة مع استكمال 100 نانوغرام / مل PMA و 50 ميكرومتر 2-ميركابتوإيثانول لمدة 48 ساعة.
  3. اغسل الخلايا مرة واحدة في محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪.
  4. افصل الخلايا باستخدام محلول تفكك الخلايا غير الأنزيمية وأجهزة الطرد المركزي (250 × جم) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. أعد تعليق خلايا THP-1 في 1 مل من وسط RPMI وقم بإجراء العد في غرفة Neubauer.
  6. خلايا جهاز الطرد المركزي THP-1 مرة أخرى عند 250 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من السوبرناتانت.
  7. إعادة تعليق 2 × 106 خلايا في 100 ميكرولتر من محلول Nucleofector واحتضان مع 0.5 ميكروغرام من ترميز البلازميد للبروتين محل الاهتمام ، الموسومة ببروتين الفلورسنت.
  8. انقل التعليق الذي يحتوي على خلايا THP-1 والحمض النووي إلى كوفيت Nucleofector.
  9. نقل خلايا THP1 باستخدام برنامج Nucleofector Y-001.
  10. استعادة الخلايا المنقولة (2x106) والبذور في وسط RPMI 500 ميكرولتر على لوحات 24 بئر مع أغطية زجاجية 13 مم (4 آبار / نقل).
  11. احتضان خلايا THP-1 في وسط RPMI كامل عند 37 درجة مئوية لمدة 0.5 و 2 و 4 و 6 و 12 و 24 ساعة.
  12. كرر الخطوتين 3.13 و3.13.

6. تقييم توظيف LC3 في Leishmania spp. PVs

ملاحظة: يمكن استخدام علامة الغشاء الذاتي الالتهام LC3 للتحقق مما إذا كانت البلعمة تقدم ميزات ذاتية الالتهام. يمكن تقييم تجنيد LC3 في الكهروضوئية التي يسببها الليشمانيا أثناء العدوى عن طريق وضع العلامات المناعية على الخلايا باستخدام الجسم المضاد LC3 ، كما هو موضح سابقا من قبل C. Matte32 و B. R. S. Dias33.

  1. البذور 2 × 105 خلايا THP-1 أو البلاعم البشرية المشتقة من الخلايا الأحادية في 500 ميكرولتر وسط RPMI كامل على صفيحة 24 بئرا مع أغطية زجاجية 13 ملم.
  2. زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
  3. اغسل الخلايا مرتين في محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪ واحتضنها في وسط RPMI كامل.
  4. أضف المرحلة الثابتة Leishmania spp. promastigotes كما وصفها A. L. Petersen22 بنسبة 10: 1 (الطفيلي: الخلايا المضيفة) وخلايا الطرد المركزي عند 720 × جم لمدة 5 دقائق تحت 4 درجات مئوية.
  5. تحضن في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أو 4 ساعات. ثم اغسل مرتين وقم بإصلاح الخلايا لتقييم تجنيد LC3 للأغشية الكهروضوئية التي يسببها الليشمانيا في المراحل المبكرة من العدوى.
    1. بدلا من ذلك ، لتقييم تجنيد LC3 للأغشية الكهروضوئية في مراحل لاحقة من العدوى ، اغسل مرتين مجموعة بلاعم أخرى في 4 ساعات من العدوى لإزالة أي بروماستيغوتات غير داخلية. احتضن الخلايا المصابة في وسط RPMI كامل لمدة 12 ساعة و 24 ساعة إضافية ، لتغسل أخيرا مرتين وتصلح.
      ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالخلايا الثابتة في محلول PBS أو 0.9٪ كلوريد الصوديوم عند 4 درجات مئوية حتى وضع العلامات.
  6. في وقت واحد كتلة وتخلل الخلايا الثابتة في 0.1٪ Triton X-100 ، و 1٪ BSA ، و 20٪ مصل الماعز العادي ، و 6٪ الحليب الجاف الخالي من الدسم ، و 50٪ FBS لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  7. احتضان الخلايا بالأجسام المضادة LC3 المضادة (1: 200) المخففة في PBS لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: كعنصر تحكم سلبي في التلطيخ المناعي ، يجب تحضين مجموعة من الخلايا بالغلوبيولين المناعي G (IgG) من الحيوان من أصل الأجسام المضادة الأولية بتركيز مكافئ لتلك المستخدمة في الجسم المضاد الأولي.
  8. اغسل الخلايا ثلاث مرات بمحلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪ في درجة حرارة الغرفة.
  9. احتضن الخلايا باستخدام IgG المضاد للأرانب المقترن بالماعز AlexaFluor 488 (1:500) أو الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع صبغة الفلورسنت المفضلة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  10. اغسل الخلايا ثلاث مرات بمحلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪ في درجة حرارة الغرفة.
  11. أغطية التثبيت باستخدام وسائط التركيب المفضلة.
  12. احصل على صور عبر المجهر الفلوري البؤري باستخدام هدف 63x/1.4.

7. اقتناء المجهر البؤري وتحديد كمية فيجي

ملاحظة: يجب إجراء الحصول على صور التألق المناعي باستخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر البؤري. للوصول إلى دقة أفضل، استخدم عدسة موضوعية لغمر الزيت بمعدل 63 ضعفا.

  1. اترك الغطاء الزجاجي مقاس 13 مم في درجة حرارة الغرفة وقم بحمايته من الضوء قبل 30 دقيقة على الأقل من الاقتناء.
  2. نظف الأغطية بمنديل ماص.
  3. أضف قطرة من زيت الغمر إلى الهدف وأضف الشريحة.
  4. حرك الهدف لأعلى حتى يلامس الزيت الشريحة.
  5. مراقبة وضبط التركيز على المجهر واختيار الخيار 63x الهدف مع النفط.
  6. افتح برنامج Leica واضبط الليزر في الأطوال الموجية 488 و 552 و 405.
  7. حدد دقة الصورة 1,024 × 1,024.
  8. انقر فوق الزر Live ، واضبط مكدس Z ، واضغط على خيار Start . ثم قم بذلك مرة أخرى واضغط على الزر إنهاء . نوصي ب 20 ميكرومتر لسمك الشريحة للحصول على صور متحدة البؤرة بدقة جيدة.
  9. انتظر الحصول على الصورة ، ثم حدد الخيار "الحد الأقصى للإسقاط" في أدوات لايكا.
  10. احفظ التجربة.
  11. قم بتصدير الصور بتنسيق lif أو tiff إلى جهاز كمبيوتر وافتح برنامج FIJI.
  12. افتح التجربة واضبط مكدس العرض باستخدام المكدس التشعبي. ثم حدد فتح الملفات بشكل فردي وخياطة البلاط.
  13. حدد أداة الأيدي الحرة في شريط أدوات فيجي وتتبع الخلية بعناية باليد.
  14. اضغط على الزر تحليل وقم بالقياس لتصور شدة التألق.
  15. كرر هذه العملية لكل خلية لكل مجموعة.
  16. احفظ القياسات وقم بتصديرها إلى محرر جداول بيانات.
  17. أضف هذه البيانات إلى برنامج التحليل الإحصائي وقم بإجراء التحليل الإحصائي.

8. التحليل الإحصائي

ملاحظة: لتحليل البيانات والرسومات، استخدم برنامج التحليل الإحصائي.

  1. افتح البرنامج.
  2. أدخل البيانات التي تم الحصول عليها واختبر معلمات الوضع الطبيعي.
  3. بالنسبة للبيانات ذات التوزيع الطبيعي ، استخدم اختبار t للطلاب وللاختبارات غير البارامترية ، اختبار Mann-Whitney.
  4. ضع في اعتبارك البيانات ذات الدلالة الإحصائية عندما تكون قيمة p أقل من 0.05.
  5. إعداد رسومات تمثل البيانات، مع مقاييس الاتجاه المركزية (المتوسط أو المتوسط) ومقاييس التباين.

النتائج

يهدف هذا التقرير إلى تقييم الأحداث المبكرة التي تحدث أثناء البلعمة ل L. braziliensis المعزولة من المرضى الذين يقدمون L. braziliensis-LCL أو L. braziliensis-DL شكل CL. باستخدام المجهر البؤري ، قمنا بالتحقيق في الأحداث الرئيسية المرتبطة بالبلعمة للطفيليات: الربط ، والاستيعاب ، ونضج البلعمة. قمنا أول?...

Discussion

التفاعل بين الليشمانيا والبلاعم هو عملية معقدة وينطوي على العديد من الخطوات التي يمكن أن تؤثر على تطور المرض5. لفهم أفضل للآليات التي ينطوي عليها تفاعل الليشمانيا غير المتعثرة والخلايا المضيفة ، وصفنا بروتوكولا يستخدم المجهر الفلوري البؤري لتقييم البلعمة من المراحل ال?...

Disclosures

لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات أو تحليلها أو قرار النشر أو إعداد المخطوطة. يعلن المؤلفون أن البحث أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.

Acknowledgements

ونشكر معهد غونسالو مونيز وفيوكروز باهيا بالبرازيل وقسم الفحص المجهري على المساعدة. تم دعم هذا العمل من قبل INOVA-FIOCRUZ رقم 79700287000 ، P.S.T.V. حاصل على منحة للإنتاجية في الأبحاث من CNPq (305235/2019-2). تم تقديم البلازميدات بلطف من قبل موريسيو تيريبيزنيك ، جامعة تورنتو ، كاليفورنيا. يود المؤلفون أن يشكروا أندريس ك. والتر على مراجعة اللغة الإنجليزية والمساعدة في تحرير نسخ المخطوطات.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-mercaptoethanolThermo Fisher Scientific21985023
AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificTem varios no site
anti-LC3 antibodyNovus BiologicalsNB600-1384
Bovine serum albumin (BSA)Thermo Fisher ScientificX
CellStripperCorning25-056-CI
CellTracker Red (CMTPX) DyeThermo Fisher ScientificC34552
CentrífugaThermo Fisher Scientific
CiprofloxacinIsofarmaX
CO2 incubatorThermo Fisher ScientificX
Confocal fluorescence microscope (Leica SP8)LeicaLeica SP8
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco10270106
Fluorescence microscope (Olympus Lx73)OlympusOlympus Lx73
GentamicinGibco15750045
GlutamineThermo Fisher Scientific35050-061
HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid)GibcoX
HistopaqueSigma10771
M-CSFPeprotech300-25
NH4ClSigmaA9434
Normal goat serumSigmaNS02L
Nucleofector 2b DeviceLonzaAAB-1001
Nucleofector solutionLonzaVPA-1007
ParaformaldehydeSigma158127
PhalloidinInvitrogenA12379
Phorbol myristate acetate (PMA)SigmaP1585
Phosphate buffer solution (PBS)Thermo Fisher Scientific10010023
ProLong Gold Antifade kitLife TechnologiesP36931
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mediumGibco11875-093
SaponinThermo Fisher ScientificX
Schneider's Insect mediumSigmaS0146
Sodium bicarbonateSigmaS5761
Sodium pyruvateSigmaS8636
Triton X-100SigmaX

References

  1. Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A. Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2), 293-307 (2012).
  2. World Health Organization. Control of the leishmaniases. World Health Organization Technical Report Series. (949), 1 (2010).
  3. Alexander, J., Russell, D. G. The interaction of Leishmania species with macrophages. Advances in Parasitology. 31, 175-254 (1992).
  4. Mosser, D. M., Rosenthal, L. A. Leishmania-macrophage interactions: multiple receptors, multiple ligands and diverse cellular responses. Seminars in Cell Biology. 4 (5), 315-322 (1993).
  5. Awasthi, A., Mathur, R. K., Saha, B. Immune response to Leishmania infection. Indian Journal of Medical Research. 119 (6), 238-258 (2004).
  6. Blackwell, J. M. Role of macrophage complement and lectin-like receptors in binding Leishmania parasites to host macrophages. Immunology Letters. 11 (3-4), 227-232 (1985).
  7. Mosser, D. M., Edelson, P. J. The mouse macrophage receptor for C3bi (CR3) is a major mechanism in the phagocytosis of Leishmania promastigotes. Journal of Immunology. 135 (4), 2785-2789 (1985).
  8. Gough, P. J., Gordon, S. The role of scavenger receptors in the innate immune system. Microbes and Infection. 2 (3), 305-311 (2000).
  9. Russell, D. G., Wilhelm, H. The involvement of the major surface glycoprotein (gp63) of Leishmania promastigotes in attachment to macrophages. Journal of Immunology. 136 (7), 2613-2620 (1986).
  10. Handman, E., Goding, J. W. The Leishmania receptor for macrophages is a lipid-containing glycoconjugate. EMBO J. 4 (2), 329-336 (1985).
  11. Holm, A., Tejle, K., Magnusson, K. E., Descoteaux, A., Rasmusson, B. Leishmania donovani lipophosphoglycan causes periphagosomal actin accumulation: correlation with impaired translocation of PKCalpha and defective phagosome maturation. Cellular Microbiology. 3 (7), 439-447 (2001).
  12. Vergne, I., et al. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4033-4038 (2005).
  13. Courret, N., Lang, T., Milon, G., Antoine, J. C. Intradermal inoculations of low doses of Leishmania major and Leishmania amazonensis metacyclic promastigotes induce different immunoparasitic processes and status of protection in BALB/c mice. International Journal for Parasitology. 33 (12), 1373-1383 (2003).
  14. Gutierrez, M. G., et al. Autophagy induction favours the generation and maturation of the Coxiella-replicative vacuoles. Cellular Microbiology. 7 (7), 981-993 (2005).
  15. Dermine, J. F., Scianimanico, S., Prive, C., Descoteaux, A., Desjardins, M. Leishmania promastigotes require lipophosphoglycan to actively modulate the fusion properties of phagosomes at an early step of phagocytosis. Cellular Microbiology. 2 (2), 115-126 (2000).
  16. Desjardins, M., Descoteaux, A. Inhibition of phagolysosomal biogenesis by the Leishmania lipophosphoglycan. Journal of Experimental Medicine. 185 (12), 2061-2068 (1997).
  17. Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages. Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).
  18. Alexander, J., et al. An essential role for IL-13 in maintaining a non-healing response following Leishmania mexicana infection. European Journal of Immunology. 32 (10), 2923-2933 (2002).
  19. Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annual Review of Immunology. 17, 593-623 (1999).
  20. Olivier, M., Gregory, D. J., Forget, G. Subversion mechanisms by which Leishmania parasites can escape the host immune response: a signaling point of view. Clinical Microbiology Reviews. 18 (2), 293-305 (2005).
  21. English, D., Andersen, B. R. Single-step separation of red blood cells. Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradients of Ficoll-Hypaque. Journal of Immunology Methods. 5 (3), 249-252 (1974).
  22. Petersen, A. L., et al. 17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages. PLoS One. 7 (11), 49496 (2012).
  23. Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
  24. Berges, R., et al. End-binding 1 protein overexpression correlates with glioblastoma progression and sensitizes to Vinca-alkaloids in vitro and in vivo. Oncotarget. 5 (24), 12769-12787 (2014).
  25. Franco, L. H., et al. The Ubiquitin Ligase Smurf1 Functions in Selective Autophagy of Mycobacterium tuberculosis and Anti-tuberculous Host Defense. Cell Host & Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).
  26. Corbett-Nelson, E. F., Mason, D., Marshall, J. G., Collette, Y., Grinstein, S. Signaling-dependent immobilization of acylated proteins in the inner monolayer of the plasma membrane. Journal of Cell Biology. 174 (2), 255-265 (2006).
  27. Yeung, T., et al. Receptor activation alters inner surface potential during phagocytosis. Science. 313 (5785), 347-351 (2006).
  28. Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cellular Microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).
  29. Vieira, O. V., et al. Modulation of Rab5 and Rab7 recruitment to phagosomes by phosphatidylinositol 3-kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (7), 2501-2514 (2003).
  30. Roberts, R. L., Barbieri, M. A., Ullrich, J., Stahl, P. D. Dynamics of rab5 activation in endocytosis and phagocytosis. Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 627-632 (2000).
  31. Vitelli, R., et al. Role of the small GTPase Rab7 in the late endocytic pathway. Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4391-4397 (1997).
  32. Matte, C., et al. Leishmania major Promastigotes Evade LC3-Associated Phagocytosis through the Action of GP63. PLoS Pathogens. 12 (6), 1005690 (2016).
  33. Dias, B. R. S., et al. Autophagic Induction Greatly Enhances Leishmania major Intracellular Survival Compared to Leishmania amazonensis in CBA/j-Infected Macrophages. Frontiers in Microbiology. 9, 1890 (2018).
  34. Babcock, G. F. Quantitation of phagocytosis by confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, 319-328 (1999).
  35. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 071795 (2014).
  36. Lennartz, M. R. Phospholipases and phagocytosis: the role of phospholipid-derived second messengers in phagocytosis. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 31 (3-4), 415-430 (1999).
  37. Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G. Visualizing the Early Stages of Phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. (120), e54646 (2017).
  38. Ramarao, N., Meyer, T. F. Helicobacter pylori resists phagocytosis by macrophages: quantitative assessment by confocal microscopy and fluorescence-activated cell sorting. Infection and Immunity. 69 (4), 2604-2611 (2001).
  39. Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 131-139 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

173

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved