JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

המנגנון הקשור לפאגוציטוזה בזיהום לישמניה נותר לא מובן. כאן אנו מתארים שיטות להערכת האירועים המוקדמים המתרחשים במהלך אינטראקציה של לישמניה עם התאים המארחים.

Abstract

פאגוציטוזה היא תהליך מתוזמר הכולל שלבים נפרדים: הכרה, כריכה והפנמה. פאגוציטים מקצועיים קולטים טפילי לישמניה על ידי פאגוציטוזה, המורכבת מזיהוי ליגנדים על משטחי טפילים על ידי קולטנים מרובים של תאי מארח. קשירת לישמניה לממברנות מקרופאגים מתרחשת באמצעות קולטן משלים מסוג 1 (CR1) וקולטן משלים מסוג 3 (CR3) וקולטני זיהוי תבניות. ליפופוספוגילן (LPG) וגליקופרוטאין 63 kDa (gp63) הם הליגנדות העיקריות המעורבות באינטראקציות מקרופאג'-לישמניה . לאחר הזיהוי הראשוני של ליגנדות טפילים על ידי קולטני התאים המארחים, הטפילים מופנמים, שורדים ומתרבים בתוך טפילים. תהליך ההבשלה של ואקואולים הנגרמים על ידי לישמניה כרוך ברכישת מולקולות משלפוחיות תוך-תאיות, כולל חלבון G מונומרי Rab 5 ו-Rab 7, חלבון ממברנה הקשור לליזוזומלי 1 (LAMP-1), חלבון ממברנה הקשור לליזוזומלי 2 (LAMP-2), וחלבון הקשור למיקרוטובול 1A/1B-light chain 3 (LC3).

במאמר זה נתאר שיטות להערכת האירועים המוקדמים המתרחשים במהלך אינטראקציה של לישמניה עם התאים המארחים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, כולל (i) קישור (ii) הפנמה, ו-(iii) התבגרות פגוזום. על ידי הוספה לגוף הידע סביב גורמים אלה של תוצאות זיהום, אנו מקווים לשפר את ההבנה של הפתוגנזה של זיהום לישמניה ולתמוך בסופו של דבר בחיפוש אחר מטרות כימותרפיות חדשות.

Introduction

לישמניאזיס היא מחלה טרופית מוזנחת הנגרמת על ידי טפילים פרוטוזואניים מהסוג לישמניה, וכתוצאה מכך ספקטרום רחב של ביטויים קליניים בפונדקאי החולייתנים, כולל לישמניאזיס עורית, לישמניאזיס רירית ולישמניאזיס הקרביים1. ארגון הבריאות העולמי (WHO) מעריך כי יותר ממיליארד בני אדם נמצאים בסיכון, עם יותר ממיליון מקרים חדשים המדווחים בשנה2.

לישמניה spp. הם פרוטוזואנים תוך-תאיים מחייבים ששורדים בתוך התאים המארחים, כולל מונוציטים, מקרופאגים ותאים דנדריטיים3. אינטראקציה לישמניה-מקרופאגים היא תהליך מורכב הכולל קולטנים מרובים של תאים מארחים וליגנדות טפילים באמצעות אינטראקציה ישירה או על ידי אופסוניזציה המערבת קולטני משלים 4,5. קולטני פני שטח קלאסיים, כגון CR1, CR3, מנוז-פוקוז, פיברונקטין, קולטנים דמויי אגרה ונבלות, מתווכים חיבור טפילים למקרופאגים 6,7,8. קולטנים אלה מזהים מולקולות על פני השטח של לישמניה, כולל גליקופרוטאין 63 kDa (gp63) וליפופוגליקן גליקוליפיד (LPG)9. אלה הן המולקולות הנפוצות ביותר על פני השטח של promastigotes וממלאות תפקיד חיוני בחתרנות של התגובה החיסונית המארחת, לטובת הקמת זיהום טפילי בתאי יונקים10. לאחר שליגנדות פני השטח של הטפילים נקשרות לקולטני מקרופאגים, F-אקטין מצטבר על פני השטח של תאי היונקים, ומקיף את הטפילים כשהם פאגוציטוזה. לאחר מכן, זה מוביל להיווצרות של תא המושרה על ידי טפיל המכונה vacuole טפילי (PV), אשר מציג תכונות phagolysosomal11. ברגע שהם נמצאים בתוך הפאגוליסוזומים האלה, הטפילים עוברים מספר שינויים החיוניים להישרדות ולכפל3.

הביוגנזה של PVs היא תהליך מווסת מאוד של סחר בממברנה החיוני להישרדות התוך-תאית של פתוגןזה 12. היווצרותו של תא זה נובעת מאירועי איחוי רציפים בין פאגוזומים ותאים של המסלול האנדוציטי המארח. מחקרים קלאסיים בביולוגיה של התא גילו כי הבשלה של PVs כרוכה ברכישת חלבונים מונומריים מסוג G חלבון Rab 5 ו-Rab 7, הקשורים בעיקר להבשלה מוקדמת ומאוחרת של האנדוזום,בהתאמה 13. בנוסף, תאים אלה רוכשים חלבוני ממברנה הקשורים לליזוזום 1 ו-2 (LAMP 1, LAMP 2), המרכיבים החלבוניים העיקריים של הממברנה הליזוזומלית וחלבון 1A/1B-light chain 3 (LC3) הקשור למיקרוטובול, סמן אוטופגוזום14. למרות הדמיון לכאורה, הקינטיקה של היווצרות PV15,16 והמורפולוגיה של תאים אלה משתנים בהתאם למיני לישמניה. לדוגמה, זיהום הנגרם על ידי L. mexicana או L. amazonensis גורם להיווצרות של תאים גדולים המכילים מספר רב של טפילים17. לעומת זאת, מינים אחרים, כגון L. braziliensis ו- L. infantum, יוצרים vacuoles קטנים יותר המכילים בדרך כלל רק טפיל אחד או שניים בכל vacuole18.

למרות הידע הזה סביב האינטראקציה בין התא המארח ללישמניה, האירועים הראשוניים המופעלים על ידי מגע בין קולטני פונדקאי לליגנדות טפילים לא הובהרו במלואם. אירועים אלה ידועים כגורמים הקובעים את תוצאות ההדבקה בטפילים והם תלויים במיני טפילים, בסוג הקולטנים של תאי המארח שגויסו לזיהוי טפילים ובהפעלת מסלולי איתות מקרופאגים19,20. לכן, חיוני לזהות את המולקולות המעורבות בביוגנזה של PVs הנגרמים על ידי לישמניה ולקבוע את התפקידים שממלאות מולקולות אלה בהתבססות הזיהום ובתוצאותיו. במאמר זה נתאר שיטה לניטור אירועים מוקדמים המתרחשים במהלך הפאגוציטוזה של לישמניה, כולל קשירה, הפנמה, היווצרות פאגוסומים והבשלה. עבודה זו יכולה לסייע בהבהרת השתתפותם של PLC, Akt, Rab5, Rab7 ו- LC3 בהיווצרות PVs המושרים על ידי מיני לישמניה שונים. חשוב לציין שניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לחקור את השתתפותם של חלבונים אחרים המעורבים בהבשלת PV. מחקרים עתידיים ירחיבו את הידע סביב מנגנונים המעורבים באינטראקציה בין לישמניה לתא המארח ויתרמו לתכנון אסטרטגיות כימותרפיות חדשניות.

Protocol

התאים התקבלו מתורמים בריאים לאחר אישור נהלים על ידי ועדות האתיקה הלאומיות למחקר (ID: 94648218.8.0000.0040).

1. תרביות תאים

  1. מקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים
    הערה: כדי להשיג מקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים להתמיינות במבחנה למקרופאגים, לאסוף דם מתורמים בריאים ולטהר תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMC) כפי שתואר על ידי D. English ו- B. R. Andersen21.
    1. לאחר איסוף דם היקפי (50 מ"ל), יש לשפוך אותו לתוך צינור הפריני ולאחר מכן לדלל את הדם ביחס של 1:1 בתמיסת חיץ פוספט (PBS) בטמפרטורת החדר. מניחים בעדינות דם הפריני מדולל על גבי מדיום שיפוע צפיפות שהופץ בעבר.
    2. צנטריפוגה את הצינורות ב 252 × גרם במשך 30 דקות ב 24 מעלות צלזיוס כדי למנוע המוליזה.
      הערה: קבעו ניתוק צנטריפוגות כדי למנוע ערבוב של שכבות הדרגתיות. לאחר צנטריפוגה, שכבות הדרגתיות רציפות נוצרות מלמטה למעלה: אריתרוציטים, מדיום שיפוע צפיפות, טבעת PBMC ופלזמה.
    3. מעבירים את טבעת ה-PBMC, הממוקמת בין המדיום של שיפוע הצפיפות לשכבות הפלזמה, לצינור חדש וממלאים ב-PBS כדי לשטוף את המדיום ההדרגתי של צפיפות עודפת.
    4. לשטוף תאים פעם אחת צנטריפוגה ב 190 × גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    5. השליכו את ה-supernatant והחזירו את הכדור ב-1 מ"ל של מדיום RPMI שלם.
    6. ספרו את התאים והצלחת 2 × 106 תאים ב-500 מ"ל של מכון רוזוול פארק ממוריאל (RPMI) בתוספת 25 mM N-[2-הידרוקסיאתיל] פיפרזין-N′-[2-אתאן חומצה סולפונית] (HEPES), 2 גרם/ל' סודיום ביקרבונט, 2 מ"מ גלוטמין, 20 גרם/מ"ל ציפרופלוקסצין ו-10% סרום בקר עוברי מומת (FBS) (מדיום RPMI מלא) למשך 7 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% CO2 בצלחת של 24 בארות כדי לאפשר למונוציטים להתמיין למקרופאגים על ידי הידבקות.
  2. תרביות THP-1
    1. לגדל קו תאים THP-1 בריכוז של 2 × 105 תאים ב-10 מ"ל של מדיום RPMI שלם בבקבוקון תרבית בגודל 75 ס"מ2 .
    2. שמור על תרביות תאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת 5% CO2 למשך 7 ימים.
    3. תאי צנטריפוגה ב 720 × גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהשעות את הכדור במדיום RPMI מלא.
    4. ספירת תאים בתא נויבאואר.
    5. תאי צלחת על זכוכית 13 מ"מ מכסים בריכוז של 2 × 105 תאים לכל באר ב 500 μL של מדיום RPMI שלם המכיל 100 nM phorbol myristate אצטט (PMA) ב 37 °C תחת 5% CO2 כדי לאפשר התמיינות של תאי THP1 למקרופאגים.
    6. לאחר שלושה ימים, יש לשטוף פעמיים תאים עם תמיסת NaCl של 0.9% כדי להסיר מדיום המכיל PMA.
    7. דגירה של תאי THP-1 מובחנים במדיום RPMI שלם ללא PMA בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת 5% CO2 למשך יומיים נוספים לפני תחילת הניסוי.

2. תרביות טפילים וכתמים אדומים של CellTracker

הערה: כדי להמחיש טפילים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, בצע צביעה באמצעות צבע פלואורסצנטי אדום CellTracker (CMTPX). לחלופין, ניתן להשתמש בסמנים אחרים, כולל carboxyfluorescein בהתאם להוראות היצרן או promastigotes המבטאים באופן מכונן GFP, RFP או גנים מדווחים פלואורסצנטיים אחרים. טפילים המשמשים להדבקת תאים הם אלה בשלב נייח של צמיחה המתקבלת מתרבית אקסנית פרומסטיגוטה של לא יותר מ -7 מעברים.

  1. לגדל לישמניה spp. promastigotes ב 1 x 10 5 טפילים לכל 1,000 μL של בינוני בבקבוק תרבית תאים המכיל5 מ"ל של המדיום של שניידר בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל gentamicin ו 10% FBS.
  2. לאחר דגירה של תרביות אקסניות טפיליות בביקוש חמצן ביוכימי (B.O.D.) בטמפרטורה של 24 מעלות צלזיוס, יש לבצע ספירה יומית בתא נויבאואר. בדוק את צורת הטפיל (דק, מוארך) וניידות במשך 5 ימים. טפילים נחשבים בשלב נייח של צמיחה כאשר שתי ספירות רצופות עם 8 שעות של מרווח להציג כמויות דומות.
  3. עם ההגעה לשלב הנייח של הצמיחה, דגירה של הטפילים ב 4 מ"ל של 0.9% תמיסת NaCl עם 1 μM CMTPX במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% CO2 הימנעות מגע עם אור.
  4. הוסיפו FBS ביחס של 1:1 ודגרו את השעיית הטפיל למשך דקה נוספת.
  5. לשטוף טפילים שלוש פעמים עם PBS, ואחריו צנטריפוגה ב 1,781 × גרם במשך 10 דקות.
  6. גלולת טפיל ב-1,000 μL של RPMI מדיום שלם.
  7. לספור טפילים בחדר נויבאואר.

3. הערכת לישמניה המקרופאגים

  1. זרע 2 × 10 5תאי THP-1 או מקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים ב-500 μL של מדיום RPMI שלם לכל באר על צלחת של 24 בארות עם כיסויי זכוכית 13 מ"מ.
  2. טפחו תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת 5% CO2 למשך 24 שעות.
  3. שטפו את התאים פעמיים עם תמיסת NaCl של 0.9% ודגרו במדיום RPMI שלם בטמפרטורה של 4°C למשך 10 דקות.
  4. הוסף פרומסטיגוטים פאזה נייחים כפי שתואר על ידי A. L. Petersen22 ביחס של 10:1 ללוחות באר, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 720 × גרם במשך 5 דקות מתחת ל -4 מעלות צלזיוס.
  5. לדגור ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  6. שטפו את התאים פעמיים עם תמיסת NaCl של 0.9% כדי להסיר פרומסטיגוטים שאינם מופנמים.
  7. מקבעים את התאים ב-4% פרפורמלדהיד למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. דגרו את הכיסויים עם 15 mM NH4Cl למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS 0.15% אלבומין בסרום בקר (BSA). דגירה עם תמיסת חסימה (3% BSA ב-PBS) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  10. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS ואז לחדור עם 0.15% PBS-Saponin למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  11. מוסיפים פאלוידין (מדולל 1:1,200) למשך שעה בטמפרטורת החדר ומגנים מפני אור.
  12. הרכב כיסויים באמצעות מדיית הרכבה.
  13. קבל תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי באמצעות מטרה של 63×/1.4.

4. הערכה של לישמניה פאגוציטוזה על ידי מקרופאגים

  1. זרע 2 × 10 5תאי THP-1 או מקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים ב-500 μL של מדיום RPMI שלם לכל באר על צלחת של 24 בארות עם כיסויי זכוכית 13 מ"מ.
  2. טפח תאים במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת 5% CO2.
  3. יש לשטוף תאים פעמיים בתמיסת NaCl של 0.9% ולדגור במדיום RPMI שלם בצלחת של 24 מעלות צלזיוס בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  4. הוסף פאזה נייחת Leishmania spp. כפי שתואר על ידי A. L. Petersen22 ביחס של 10:1 (טפיל:תא מארח), ולאחר מכן צנטריפוגה ב 720 × גרם במשך 10 דקות מתחת 4 מעלות צלזיוס.
  5. לדגור תאים ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
  6. שטפו את התאים פעמיים עם תמיסת NaCl של 0.9% כדי להסיר פרומסטיגוטים שאינם מופנמים.
  7. דגירה של התאים במדיום RPMI בתוספת ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
  8. לתקן את התאים עם 4% paraformaldehyde במשך 15 דקות.
  9. הרכב כיסויים באמצעות מדיית הרכבה מועדפת.
  10. ספרו לא פחות מ-400 תאים בשדות אקראיים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות מטרה של 100×/1.4.

5. הערכה של לישמניה - התבגרות vacuole המושרה

הערה: העברת תאי THP-1 צריכה להתבצע כמתואר על ידי M. B. Maess, B. Wittig ו- S. Lorkowski 23. כאן אנו מסכמים פרוטוקול זה, עם שינויים מינימליים. נוקלאופקציה היא שיטת טרנספקציה ספציפית הדורשת נוקלאופקטור. כשיטה חלופית, תאים יכולים להיות transfected באמצעות lipofectamine24 ו lentivirus התמרה25.

  1. כדי לחקור את הביוגנזה של PV המושרה על ידי לישמניה, טרנספקט תאי THP1 עם PLC 26,27, Akt 26,27, Rab 5 28,29,30 או Rab 728,29,31 פלסמידים.
    הערה: ניתן להשתמש במתודולוגיה זו כדי להעביר תאי THP-1 עם גנים אחרים מאלה המפורטים לעיל.
  2. זרע THP-1 תאים ב 1.5 x 107 ב 75 סמ"ר צלוחיות תרבית רקמה המכיל 10 מ"ל מדיום RPMI מלא בתוספת 100 ng/mL PMA ו 50 μM 2-mercaptoethanol במשך 48 שעות.
  3. יש לשטוף את התאים פעם אחת בתמיסת NaCl של 0.9%.
  4. נתקו תאים באמצעות תמיסת דיסוציאציה של תאים לא אנזימטיים וצנטריפוגה (250 × גרם) למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. יש לתלות תאי THP-1 במדיום RPMI של 1 מ"ל ולבצע ספירות בתא נויבאואר.
  6. צנטריפוגה THP-1 תאים שוב ב 250 × גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופר-נטנט.
  7. יש לתלות 2 × 106 תאים ב-100 μL של תמיסת Nucleofector ולדגור עם 0.5 מיקרוגרם של קידוד פלסמיד עבור החלבון המעניין, המתויג עם חלבון פלואורסצנטי.
  8. העבר את התרחיף המכיל תאי THP-1 וחומצת גרעין ל- Nucleofector cuvette.
  9. טרנספקט THP1 תאים באמצעות תוכנית Nucleofector Y-001.
  10. לשחזר את התאים שעברו טרנספקציה (2x106) ואת הזרעים במדיום 500 μL RPMI על לוחות 24 בארות עם כיסויי זכוכית 13 מ"מ (4 בארות / transfection).
  11. דגירה של תאי THP-1 במדיום RPMI שלם ב-37 מעלות צלזיוס למשך 0.5, 2, 4, 6, 12 ו-24 שעות.
  12. חזור על שלבים 3.13 ו- 3.13.

6. הערכת הגיוס של LC3 לישמניה spp. PVs

הערה: ניתן להשתמש בסמן הממברנה האוטופגית LC3 כדי לחקור אם פאגוזומים מציגים תכונות אוטופגיות. ניתן להעריך את גיוס LC3 ל- PVs הנגרמים על ידי לישמניה במהלך ההדבקה על ידי תאים חיסוניים עם הנוגדן anti-LC3, כפי שתואר קודם לכן על ידי C. Matte32 ו- B. R. S. Dias33.

  1. זרע 2 × 10 5תאי THP-1 או מקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים במדיום RPMI שלם של 500 μL על צלחת 24 בארות עם כיסויי זכוכית 13 מ"מ.
  2. טפח תאים במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת 5% CO2.
  3. יש לשטוף תאים פעמיים בתמיסת NaCl של 0.9% ולדגור במדיום RPMI מלא.
  4. הוסף פאזה נייחת Leishmania spp. promastigotes כפי שתואר על ידי A. L. Petersen22 ביחס של 10:1 (טפיל: תאים מארחים) ותאי צנטריפוגה ב 720 × גרם במשך 5 דקות מתחת ל -4 מעלות צלזיוס.
  5. דגירה ב-37°C למשך 30 דקות או 4 שעות. לאחר מכן יש לשטוף פעמיים ולקבע את התאים כדי להעריך את גיוס ה-LC3 לקרום ה-PV הנגרם על-ידי לישמניה בשלבים המוקדמים של ההדבקה.
    1. לחלופין, כדי להעריך את גיוס LC3 לממברנות PV בשלבים מאוחרים יותר של ההדבקה, יש לשטוף פעמיים קבוצת מקרופאגים נוספת ב-4 שעות של זיהום כדי להסיר פרומסטיגוטים שאינם מופנמים. לדגום תאים נגועים במדיום RPMI שלם במשך 12 שעות ו -24 שעות נוספות, כדי סוף סוף לשטוף פעמיים ולתקן.
      הערה: ניתן לשמור תאים קבועים ב-PBS או בתמיסת NaCl של 0.9% בטמפרטורה של 4°C עד לתיוג.
  6. בו זמנית לחסום ולחדור את התאים הקבועים ב 0.1% Triton X-100, 1% BSA, 20% סרום עזים רגיל, 6% חלב יבש ללא שומן, ו 50% FBS במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. לדגום את התאים עם נוגדן אנטי-LC3 (1: 200) מדולל ב- PBS במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
    הערה: כבקרה שלילית על החיסון החיסוני, קבוצת תאים צריכה להיות מודגרת עם אימונוגלובולין G (IgG) מהחיה ממוצא נוגדנים ראשוני בריכוז שווה ערך לזה המשמש לנוגדן הראשוני.
  8. שטפו את התאים שלוש פעמים עם תמיסת NaCl של 0.9% בטמפרטורת החדר.
  9. לדגום את התאים עם AlexaFluor 488-מצומד עז נגד ארנב IgG (1:500) או נוגדנים משניים מצומדים צבע פלואורסצנטי מועדף במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  10. שטפו את התאים שלוש פעמים עם תמיסת NaCl של 0.9% בטמפרטורת החדר.
  11. הרכב כיסויים באמצעות מדיית הרכבה מועדפת.
  12. קבל תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי באמצעות מטרה של 63x/1.4.

7. רכישת מיקרוסקופיה קונפוקלית וכימות פיג'י

הערה: יש לבצע רכישת תמונות אימונופלואורסצנטיות באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. כדי להגיע לרזולוציה טובה יותר, השתמש בעדשה אובייקטיבית של 63x טבילה בשמן.

  1. השאירו את כיסויי הזכוכית בקוטר 13 מ"מ בטמפרטורת החדר והגנו עליהם מפני האור לפחות 30 דקות לפני הרכישה.
  2. נקו את הכיסויים בעזרת רקמה סופגת.
  3. הוסיפו טיפת שמן טבילה למטרה והוסיפו את השקופית.
  4. הזיזו את המטרה כלפי מעלה עד שהשמן ייגע בשקופית.
  5. התבוננו והתאימו את הפוקוס למיקרוסקופ ובחרו את המטרה 63x עם שמן.
  6. פתח את תוכנית Leica והתאם את הלייזרים באורכי הגל 488, 552 ו- 405.
  7. בחר ברזולוציית התמונה 1,024 x 1,024.
  8. לחץ על כפתור Live , הגדר את ערימת Z ולחץ על האפשרות התחל . לאחר מכן, עשה זאת שוב ולחץ על כפתור הסיום . אנו ממליצים על 20 מיקרומטר לעובי פרוסה כדי לקבל תמונות קונפוקליות עם רזולוציות טובות.
  9. המתן לרכישת התמונה ולאחר מכן בחר באפשרות "הקרנה מרבית" בכלי לייקה.
  10. שמור את הניסוי.
  11. ייצא את התמונות בפורמט lif או tiff למחשב ופתח את תוכנית FIJI.
  12. פתח את הניסוי והגדר את ערימת התצוגה עם ערימת-העל. לאחר מכן בחר קבצים פתוחים בנפרד ותפר אריחים.
  13. בחר בכלי הידיים החופשיות בסרגל הכלים של פיג'י ועקוב אחר התא בקפידה ביד.
  14. לחץ על לחצן נתח ומדוד כדי להמחיש את עוצמת הפלואורסצנטיות.
  15. חזור על תהליך זה לכל תא בכל קבוצה.
  16. שמור את המידות וייצא אותן לעורך גיליונות אלקטרוניים.
  17. הוסף נתונים אלה לתוכנית ניתוח סטטיסטי ובצע את הניתוח הסטטיסטי.

8. ניתוח סטטיסטי

הערה: לניתוח נתונים וגרפיקה, השתמש בתוכנית ניתוח סטטיסטי.

  1. פתח את התוכנית.
  2. הכנס את הנתונים המתקבלים ובדוק את פרמטרי הנורמליות.
  3. עבור נתונים עם התפלגות נורמלית, השתמש במבחן t סטודנט ולמבחנים לא-פאראמטריים, מבחן מאן-וויטני.
  4. שקול נתונים עם הבדל מובהק סטטיסטית כאשר ערך p קטן מ- 0.05.
  5. הכן גרפיקה המייצגת את הנתונים, עם מדדי נטייה מרכזיים (ממוצע או חציון) ומדדי וריאציה.

תוצאות

דו"ח זה נועד להעריך את האירועים המוקדמים המתרחשים במהלך הפאגוציטוזה של L. braziliensis שבודדה מחולים המציגים L. braziliensis-LCL או L. braziliensis-DL צורה של CL. באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, חקרנו את האירועים העיקריים הקשורים לפאגוציטוזה של טפילים: קשירה, הפנמה והבשלה של פגוזומים. הערכנו לראשונ?...

Discussion

אינטראקציה בין לישמניה-מקרופאגים היא תהליך מורכב וכולל מספר שלבים שיכולים להשפיע על התפתחות המחלה5. כדי להבין טוב יותר את המנגנונים המעורבים באינטראקציה של לישמניה לא מנוצלת ותאים מארחים, תיארנו פרוטוקול המשתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית כדי להעריך פאגו...

Disclosures

למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר, באיסוף הנתונים או בניתוחם, בהחלטה לפרסם או בהכנת כתב היד. המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.

Acknowledgements

אנו מודים למכון גונסאלו מוניז, פיוקרוז באהיה, ברזיל ולמחלקת המיקרוסקופיה על הסיוע. עבודה זו נתמכה על ידי INOVA-FIOCRUZ מספר 79700287000, P.S.T.V. מחזיקה במענק לפרודוקטיביות במחקר מ- CNPq (305235/2019-2). פלסמידים סופקו בחביבות על ידי מאוריציו טרביזניק, אוניברסיטת טורונטו, קליפורניה. המחברים רוצים להודות לאנדריס ק. וולטר על התיקון בשפה האנגלית ועל הסיוע בהעתקת כתבי יד.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-mercaptoethanolThermo Fisher Scientific21985023
AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificTem varios no site
anti-LC3 antibodyNovus BiologicalsNB600-1384
Bovine serum albumin (BSA)Thermo Fisher ScientificX
CellStripperCorning25-056-CI
CellTracker Red (CMTPX) DyeThermo Fisher ScientificC34552
CentrífugaThermo Fisher Scientific
CiprofloxacinIsofarmaX
CO2 incubatorThermo Fisher ScientificX
Confocal fluorescence microscope (Leica SP8)LeicaLeica SP8
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco10270106
Fluorescence microscope (Olympus Lx73)OlympusOlympus Lx73
GentamicinGibco15750045
GlutamineThermo Fisher Scientific35050-061
HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid)GibcoX
HistopaqueSigma10771
M-CSFPeprotech300-25
NH4ClSigmaA9434
Normal goat serumSigmaNS02L
Nucleofector 2b DeviceLonzaAAB-1001
Nucleofector solutionLonzaVPA-1007
ParaformaldehydeSigma158127
PhalloidinInvitrogenA12379
Phorbol myristate acetate (PMA)SigmaP1585
Phosphate buffer solution (PBS)Thermo Fisher Scientific10010023
ProLong Gold Antifade kitLife TechnologiesP36931
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mediumGibco11875-093
SaponinThermo Fisher ScientificX
Schneider's Insect mediumSigmaS0146
Sodium bicarbonateSigmaS5761
Sodium pyruvateSigmaS8636
Triton X-100SigmaX

References

  1. Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A. Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2), 293-307 (2012).
  2. World Health Organization. Control of the leishmaniases. World Health Organization Technical Report Series. (949), 1 (2010).
  3. Alexander, J., Russell, D. G. The interaction of Leishmania species with macrophages. Advances in Parasitology. 31, 175-254 (1992).
  4. Mosser, D. M., Rosenthal, L. A. Leishmania-macrophage interactions: multiple receptors, multiple ligands and diverse cellular responses. Seminars in Cell Biology. 4 (5), 315-322 (1993).
  5. Awasthi, A., Mathur, R. K., Saha, B. Immune response to Leishmania infection. Indian Journal of Medical Research. 119 (6), 238-258 (2004).
  6. Blackwell, J. M. Role of macrophage complement and lectin-like receptors in binding Leishmania parasites to host macrophages. Immunology Letters. 11 (3-4), 227-232 (1985).
  7. Mosser, D. M., Edelson, P. J. The mouse macrophage receptor for C3bi (CR3) is a major mechanism in the phagocytosis of Leishmania promastigotes. Journal of Immunology. 135 (4), 2785-2789 (1985).
  8. Gough, P. J., Gordon, S. The role of scavenger receptors in the innate immune system. Microbes and Infection. 2 (3), 305-311 (2000).
  9. Russell, D. G., Wilhelm, H. The involvement of the major surface glycoprotein (gp63) of Leishmania promastigotes in attachment to macrophages. Journal of Immunology. 136 (7), 2613-2620 (1986).
  10. Handman, E., Goding, J. W. The Leishmania receptor for macrophages is a lipid-containing glycoconjugate. EMBO J. 4 (2), 329-336 (1985).
  11. Holm, A., Tejle, K., Magnusson, K. E., Descoteaux, A., Rasmusson, B. Leishmania donovani lipophosphoglycan causes periphagosomal actin accumulation: correlation with impaired translocation of PKCalpha and defective phagosome maturation. Cellular Microbiology. 3 (7), 439-447 (2001).
  12. Vergne, I., et al. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4033-4038 (2005).
  13. Courret, N., Lang, T., Milon, G., Antoine, J. C. Intradermal inoculations of low doses of Leishmania major and Leishmania amazonensis metacyclic promastigotes induce different immunoparasitic processes and status of protection in BALB/c mice. International Journal for Parasitology. 33 (12), 1373-1383 (2003).
  14. Gutierrez, M. G., et al. Autophagy induction favours the generation and maturation of the Coxiella-replicative vacuoles. Cellular Microbiology. 7 (7), 981-993 (2005).
  15. Dermine, J. F., Scianimanico, S., Prive, C., Descoteaux, A., Desjardins, M. Leishmania promastigotes require lipophosphoglycan to actively modulate the fusion properties of phagosomes at an early step of phagocytosis. Cellular Microbiology. 2 (2), 115-126 (2000).
  16. Desjardins, M., Descoteaux, A. Inhibition of phagolysosomal biogenesis by the Leishmania lipophosphoglycan. Journal of Experimental Medicine. 185 (12), 2061-2068 (1997).
  17. Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages. Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).
  18. Alexander, J., et al. An essential role for IL-13 in maintaining a non-healing response following Leishmania mexicana infection. European Journal of Immunology. 32 (10), 2923-2933 (2002).
  19. Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annual Review of Immunology. 17, 593-623 (1999).
  20. Olivier, M., Gregory, D. J., Forget, G. Subversion mechanisms by which Leishmania parasites can escape the host immune response: a signaling point of view. Clinical Microbiology Reviews. 18 (2), 293-305 (2005).
  21. English, D., Andersen, B. R. Single-step separation of red blood cells. Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradients of Ficoll-Hypaque. Journal of Immunology Methods. 5 (3), 249-252 (1974).
  22. Petersen, A. L., et al. 17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages. PLoS One. 7 (11), 49496 (2012).
  23. Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
  24. Berges, R., et al. End-binding 1 protein overexpression correlates with glioblastoma progression and sensitizes to Vinca-alkaloids in vitro and in vivo. Oncotarget. 5 (24), 12769-12787 (2014).
  25. Franco, L. H., et al. The Ubiquitin Ligase Smurf1 Functions in Selective Autophagy of Mycobacterium tuberculosis and Anti-tuberculous Host Defense. Cell Host & Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).
  26. Corbett-Nelson, E. F., Mason, D., Marshall, J. G., Collette, Y., Grinstein, S. Signaling-dependent immobilization of acylated proteins in the inner monolayer of the plasma membrane. Journal of Cell Biology. 174 (2), 255-265 (2006).
  27. Yeung, T., et al. Receptor activation alters inner surface potential during phagocytosis. Science. 313 (5785), 347-351 (2006).
  28. Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cellular Microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).
  29. Vieira, O. V., et al. Modulation of Rab5 and Rab7 recruitment to phagosomes by phosphatidylinositol 3-kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (7), 2501-2514 (2003).
  30. Roberts, R. L., Barbieri, M. A., Ullrich, J., Stahl, P. D. Dynamics of rab5 activation in endocytosis and phagocytosis. Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 627-632 (2000).
  31. Vitelli, R., et al. Role of the small GTPase Rab7 in the late endocytic pathway. Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4391-4397 (1997).
  32. Matte, C., et al. Leishmania major Promastigotes Evade LC3-Associated Phagocytosis through the Action of GP63. PLoS Pathogens. 12 (6), 1005690 (2016).
  33. Dias, B. R. S., et al. Autophagic Induction Greatly Enhances Leishmania major Intracellular Survival Compared to Leishmania amazonensis in CBA/j-Infected Macrophages. Frontiers in Microbiology. 9, 1890 (2018).
  34. Babcock, G. F. Quantitation of phagocytosis by confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, 319-328 (1999).
  35. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 071795 (2014).
  36. Lennartz, M. R. Phospholipases and phagocytosis: the role of phospholipid-derived second messengers in phagocytosis. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 31 (3-4), 415-430 (1999).
  37. Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G. Visualizing the Early Stages of Phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. (120), e54646 (2017).
  38. Ramarao, N., Meyer, T. F. Helicobacter pylori resists phagocytosis by macrophages: quantitative assessment by confocal microscopy and fluorescence-activated cell sorting. Infection and Immunity. 69 (4), 2604-2611 (2001).
  39. Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 131-139 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

173

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved