使用共聚焦显微镜研究 利什曼原虫 的吞噬作用

摘要

利 什曼原虫 感染中与吞噬作用相关的机制仍然知之甚少。在这里，我们描述了评估 利什曼原虫 与宿主细胞相互作用期间发生的早期事件的方法。

摘要

吞噬作用是一个精心策划的过程，涉及不同的步骤:识别，结合和内化。专业吞噬细胞通过吞噬作用吸收 利什曼原虫 寄生虫，包括通过多个宿主细胞受体识别寄生虫表面上的配体。 利什曼原虫 与巨噬细胞膜的结合通过补体受体1型（CR1）和补体受体3型（CR3）和模式识别受体发生。脂磷聚糖（LPG）和63 kDa糖蛋白（gp63）是参与巨噬细胞 - 利什曼原虫 相互作用的主要配体。在宿主细胞受体最初识别寄生虫配体之后，寄生虫在寄生液泡内化，存活并繁殖。 利什曼原虫诱导的液泡的成熟过程涉及从细胞内囊泡中获取分子，包括单体G蛋白Rab 5和Rab 7，溶酶体相关膜蛋白1（LAMP-1），溶酶体相关膜蛋白2（LAMP-2）和微管相关蛋白1A / 1B-轻链3（LC3）。

在这里，我们描述了使用共聚焦显微镜评估 利什曼原虫 与宿主细胞相互作用期间发生的早期事件的方法，包括（i）结合（ii）内化和（iii）吞噬体成熟。通过增加围绕这些感染结果决定因素的知识体系，我们希望提高对 利什曼原虫 感染发病机制的理解，并支持最终寻找新的化疗靶点。

引言

利什曼病是一种被忽视的热带病，由 利什曼原虫属的原生动物寄生虫引起，导致脊椎动物宿主的广泛临床表现，包括皮肤利什曼病、皮肤黏膜利什曼病和内脏利什曼病¹。世界卫生组织（WHO）估计，超过10亿人处于危险之中，每年报告的新病例超过100万²。

利什曼原虫 属是专性细胞内原生动物，在宿主细胞内存活，包括单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞³. 利什曼原虫 - 巨噬细胞相互作用是一个复杂的过程，通过直接相互作用或通过涉及补体受体的调理作用涉及多个宿主细胞受体和寄生虫配体^4，5。经典的表面受体，如CR1，CR3，甘露糖 - 岩藻糖，纤连蛋白，Toll样和清道夫受体，介导寄生虫附着到巨噬细胞^6，7，8。这些受体识别 利什曼原虫表面的分子，包括63 kDa糖蛋白（gp63）和糖脂脂脂磷酸聚糖（LPG）⁹。这些是前鞭毛虫表面最丰富的分子，在破坏宿主免疫反应中起着至关重要的作用，有利于在哺乳动物细胞中建立寄生虫感染¹⁰。在寄生虫表面配体与巨噬细胞受体结合后，F-肌动蛋白积聚在哺乳动物细胞表面，在寄生虫被吞噬时围绕它们。随后，这导致形成寄生虫诱导的隔室，称为寄生液泡（PV），其呈现吞噬溶酶体特征¹¹。一旦进入这些吞噬溶酶体，寄生虫就会经历生存和繁殖所必需的几种改变³。

PV的生物发生是一种高度调控的膜运输过程，对这种病原体¹²的细胞内存活至关重要。该区室的形成是由吞噬体和宿主内吞途径的区室之间的连续融合事件引起的。经典细胞生物学研究表明，PV的成熟涉及单体G蛋白Rab 5和Rab 7蛋白的获取，这主要与早期和晚期内体成熟有关，分别是¹³。此外，这些区室获取溶酶体相关膜蛋白1和2（LAMP 1，LAMP 2），溶酶体膜的主要蛋白质成分和微管相关蛋白1A / 1B-轻链3（LC3），自噬体标记物¹⁴。尽管有明显的相似性，但PV形成^15，16 的动力学和这些区室的形态因 利什曼原虫 物种而异。例如，由 墨西哥乳杆菌 或 亚马逊乳杆菌 引起的感染诱导形成含有大量寄生虫的大隔室¹⁷。相比之下，其他物种，如 巴西乳杆菌 和 婴儿乳杆菌， 形成较小的液泡，通常每个液泡¹⁸中只含有一到两个寄生虫。

尽管对宿主细胞-利什曼原虫 相互作用有这种了解，但由宿主受体和寄生虫配体之间接触引发的初始事件尚未完全阐明。已知这些事件是寄生虫感染结果的决定因素，并且取决于寄生虫种类，招募以识别寄生虫的宿主细胞受体的类型以及巨噬细胞信号通路的激活^19，20。因此，必须鉴定参与 利什曼原虫诱导的PV的生物发生的分子，并确定这些分子在感染建立和结果中的作用。在这里，我们描述了一种监测 利什曼原虫吞噬过程中发生的早期事件的方法，包括结合，内化，吞噬体形成和成熟。这项工作有助于澄清PLC，Akt，Rab5，Rab7和LC3参与由不同 利什曼原虫 物种诱导的PP的形成。重要的是，该方案可用于研究参与PV成熟的其他蛋白质的参与。未来的研究将扩大利 什曼原虫 - 宿主细胞相互作用所涉及的机制的知识，并有助于设计新的化疗策略。

研究方案

细胞是在国家研究伦理委员会批准程序后从健康供体获得的（ID:94648218.8.0000.0040）。

1. 细胞培养

1. 人单核细胞来源的巨噬细胞
   注意:要获得用于 体外 分化为巨噬细胞的人单核细胞，请从健康供体收集血液并纯化D.英语和B.R.Andersen²¹描述的外周血单核细胞（PBMC）。
   1. 收集外周血（50毫升）后，将其倒入肝素化管中，然后在室温下在磷酸盐缓冲溶液（PBS）中以1:1稀释血液。将稀释的肝素化血液轻轻地放在先前分布的密度梯度培养基的顶部。
   2. 在24°C下以252× g 离心管30分钟以避免溶血。
      注意:设置离心机断裂以避免梯度层混合。离心后，从底部到顶部形成不连续的梯度层:红细胞，密度梯度培养基，PBMC环和血浆。
   3. 将位于密度梯度介质和等离子体层之间的PBMC环转移到新管中，并用PBS填充以洗去多余的密度梯度介质。
   4. 洗涤细胞一次，并在4°C下以190×g离心10分钟。
   5. 弃去上清液并将沉淀重悬于1mL完全RPMI培养基中。
   6. × 在⁵⁰⁰ mL罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）中，在500 mL中补充25 mM N-[2-羟乙基]哌嗪-N′-[2-乙烷磺酸]（HEPES），2 g / L碳酸氢钠，2 mM谷氨酰胺，20g / mL环丙沙星和10%灭活胎牛血清（FBS）（完全RPMI培养基）中，在24孔板中在37°C下5%CO₂ 下，7天，使单核细胞分化成巨噬细胞通过附着力。
2. 全血细胞增多糖-1 培养物
   1. 在⁷⁵ cm 2培养瓶中的10mL完全RPMI培养基中以2×10 5个细胞的浓度生长^THP-1 细胞系。
   2. 在37°C的5%CO₂ 下将细胞培养物在37°C下保持7天。
   3. 在4°C下以720×g离心细胞10分钟，并将沉淀重悬于完全RPMI培养基中。
   4. 在诺伊鲍尔腔室中计数细胞。
   5. 在含有100nM醋酸间苯二酚醛（PMA）的500μL完全RPMI培养基中，在37°C下在⁵ %CO₂ 下以每孔2×10 5个细胞的浓度在13mm玻璃盖玻片上平板细胞，以允许THP1细胞分化为巨噬细胞。
   6. 三天后，用0.9%NaCl溶液洗涤两次细胞以除去含有PMA的培养基。
   7. 在开始实验之前，将分化的THP-1细胞在37°C的无PMA完全RPMI培养基中在5%CO₂ 下再孵育2天。

2. 寄生虫培养物和细胞追踪器红色染色

注意:要通过荧光显微镜观察寄生虫，请使用细胞追踪器红色荧光染料（CMTPX）进行染色。或者，其它标记物，包括羧基荧光素，可以按照制造商的说明使用或组成性表达GFP、RFP或其它荧光报告基因的促凝子。用于感染细胞的寄生虫是从不超过7个传代的前鞭毛虫轴烯培养物中获得的处于静止生长阶段的寄生虫。

1. 种植利什曼原虫属 在含有⁵ mL施耐德培养基的细胞培养瓶中，每1，000μL培养基中以1×10 5个寄生虫预吸，并补充50μg/ mL庆大霉素和10%FBS。
2. 在24°C的生化需氧量（B.O.D.）中孵育寄生虫轴作用培养物后，在Neubauer室中进行每日计数。检查寄生虫形态（薄，细长）和活动能力5天。当两个间隔8小时的连续计数显示相似的数量时，将寄生虫视为处于静止生长阶段。
3. 在达到生长的固定阶段时，将寄生虫在4mL的0.9%NaCl溶液中与1μM CMTPX在37°C下在5%CO₂ 下孵育15分钟，避免与光接触。
4. 以1:1的比例加入FBS，并将寄生虫悬浮液再孵育1分钟。
5. 用PBS洗涤寄生虫三次，然后在1，781×g下离心10分钟。
6. 将寄生虫沉淀重悬于1，000μLRPI完全培养基中。
7. 在纽鲍尔腔室中计数寄生虫。

3. 利什曼原虫 与巨噬细胞结合的评估

1. 在具有13mm玻璃盖玻片的24孔板上，将2×10个⁵ THP-1细胞或人单核细胞来源的巨噬细胞放入每孔500μL完全RPMI培养基中。
2. 在37°C下在5%CO₂ 下培养细胞24小时。
3. 用0.9%NaCl溶液洗涤细胞两次，并在4°C的完全RPMI培养基中孵育10分钟。
4. 按照A.L.Petersen²² 所述，以10:1的比例加入固定相前促构子与孔板，然后在4°C下以720×g离心5分钟。
5. 在4°C下孵育5分钟。
6. 用0.9%NaCl溶液洗涤细胞两次，以除去任何非内化的促凝物。
7. 将细胞在室温下固定在4%多聚甲醛中15分钟。
8. 将盖玻片与15 mM NH₄Cl在室温下孵育15分钟。
9. 用 PBS 0.15% 牛血清白蛋白 （BSA） 洗涤三次。在室温下与封闭溶液（PBS中3%BSA）孵育1小时。
10. 用PBS洗涤三次，然后在室温下用0.15%PBS-皂苷透化15分钟。
11. 在室温下加入鬼臼蛋白（稀释1:1，200）1小时，避光。
12. 使用安装介质安装盖玻片。
13. 使用63×/1.4物镜通过共聚焦荧光显微镜获取图像。

4. 巨噬细胞吞噬利 什曼原虫 的评估

1. 在具有13mm玻璃盖玻片的24孔板上，将2×10个⁵ THP-1细胞或人单核细胞来源的巨噬细胞放入每孔500μL完全RPMI培养基中。
2. 在37°C下在5%CO 2下培养细胞₂₄小时。
3. 在0.9%NaCl溶液中洗涤细胞两次，并在4°C下在24孔板中的完全RPMI培养基中孵育10分钟。
4. 加入A.L.彼得森²²描述的固定相利什曼原虫属，以10:1（寄生虫:宿主细胞）的比例，然后在4°C下以720×g离心10分钟。
5. 将细胞在4°C下孵育5分钟。
6. 用0.9%NaCl溶液洗涤细胞两次，以除去任何非内化的促凝物。
7. 将细胞在37°C的补充RPMI培养基中孵育1小时。
8. 用4%多聚甲醛固定细胞15分钟。
9. 使用首选安装介质安装盖玻片。
10. 使用100×/ 1.4物镜在荧光显微镜下的随机场中计数不少于400个细胞。

5. 利什曼原虫 诱导的液泡成熟度的评估

注意:THP-1细胞转染应按照梅斯、威蒂格和洛科夫斯基 ²³的描述进行。在这里，我们总结了该协议，并进行了最小的修改。核切片是一种特定的转染方法，需要核切片器。作为替代方法，可以使用脂质切除胺²⁴ 和慢病毒转导²⁵转染细胞。

1. 为了研究利什曼原虫诱导的PV的生物发生，用PLC^26，27，Akt^26，27，Rab 5 ^28，29，30或Rab 7^28，29，31质粒转染THP1细胞。
   注意:该方法可用于转染THP-1细胞与上述基因以外的其他基因。
2. 在含有10mL完全RPMI培养基的^1.5 ×10 7 7中接种THP-1细胞，其中补充100 ng / mL PMA和50μM 2-巯基乙醇48小时。
3. 在0.9%NaCl溶液中洗涤细胞一次。
4. 使用非酶促细胞解离溶液分离细胞，并在室温下离心（250×g）5分钟。
5. 将THP-1细胞重悬于1 mLRPI培养基中，并在诺伊鲍尔腔室中进行计数。
6. 在室温下再次以250×g离心THP-1细胞10分钟。弃去上清液。
7. 将2×10⁶ 个细胞重悬于100μL细胞核向量溶液中，并与编码目标蛋白质的0.5μg质粒一起孵育，用荧光蛋白标记。
8. 将含有THP-1细胞和核酸的悬浮液转移到细胞核比色皿中。
9. 使用细胞核细胞切除程序Y-001转染THP1细胞。
10. 回收转染的细胞（2x10⁶）并在500μLRPMI培养基中接种在24孔板上，用13mm玻璃盖玻片（4孔/转染）。
11. 将THP-1细胞在37°C的完全RPMI培养基中孵育0.5，2，4，6，12和24小时。
12. 重复步骤 3.13 和 3.13。

6. LC3招募到 利什曼原虫 属PP的评估

注意:自噬膜标记物LC3可用于研究吞噬体是否存在自噬特征。在感染期间，可以使用抗LC3抗体对抗LC3抗体进行免疫标记细胞来评估利什曼原虫诱导的PV的LC3募集，如先前由C.R.S.Dias³³描述的那样。

1. 在500μL完全RPMI培养基中，在具有13mm玻璃盖玻片的24孔板上，将2×10个⁵ THP-1细胞或人单核细胞来源的巨噬细胞。
2. 在37°C下在5%CO 2下培养细胞₂₄小时。
3. 在0.9%NaCl溶液中洗涤细胞两次，并在完全的RPMI培养基中孵育。
4. 加入A.L.彼得森²²描述的固定相利什曼原虫属前鞭毛虫以10:1（寄生虫:宿主细胞）的比例，并在4°C下以720×g离心细胞5分钟。
5. 在37°C下孵育30分钟或4小时。然后洗涤两次并固定细胞，以评估在感染的早期阶段将LC3募集到 利什曼原虫诱导的PV膜中。
   1. 或者，为了评估在感染后期PV膜的LC3募集，在感染4小时时洗涤另一个巨噬细胞组两次，以除去任何未内化的前突。将受感染的细胞在完全RPMI培养基中再孵育12小时和24小时，最后洗涤两次并固定。
      注意:固定的细胞可以保存在PBS或0.9%NaCl溶液中，在4°C下直到标记。
6. 在室温下，在0.1%曲拉通X-100，1%BSA，20%正常山羊血清，6%脱脂奶粉和50%FBS中同时阻断和透化固定细胞20分钟。
7. 将细胞与在室温下在PBS中稀释的抗LC3抗体（1:200）孵育2小时。
   注意:作为免疫染色的阴性对照，一组细胞应与来自一抗来源的动物的免疫球蛋白G（IgG）一起孵育，其浓度与用于一抗的浓度相当。
8. 在室温下用0.9%NaCl溶液洗涤细胞三次。
9. 在室温下用AlexaFluor 488偶联的山羊抗兔IgG（1:500）或优选的荧光染料偶联二抗孵育细胞1小时。
10. 在室温下用0.9%NaCl溶液洗涤细胞三次。
11. 使用首选安装介质安装盖玻片。
12. 使用63x/1.4物镜通过共聚焦荧光显微镜获取图像。

7. 共聚焦显微镜采集和斐济定量

注意:获取免疫荧光图像应使用共聚焦激光扫描显微镜进行。要达到更好的分辨率，请使用油浸式63x物镜。

1. 将13毫米玻璃盖玻片置于室温下，并在采集前至少30分钟保护它们免受光线照射。
2. 用吸收性组织清洁盖玻片。
3. 在物镜上加入一滴浸油，然后加入载玻片。
4. 向上移动物镜，直到油接触到滑块。
5. 观察并调整显微镜上的焦点，并选择带油的63x物镜。
6. 打开徕卡程序并调整 488、552 和 405 波长的激光器。
7. 选择图像分辨率 1，024 x 1，024。
8. 单击" 实时 "按钮，设置 Z 堆栈，然后按" 开始 "选项。然后，再次执行此操作并按" 结束 "按钮。我们建议切片厚度为20μm，以获得具有良好分辨率的共聚焦图像。
9. 等待图像采集，然后在徕卡工具中选择"最大投影"选项。
10. 保存实验。
11. 将 lif 或 tiff 格式的图像导出到计算机，然后打开斐济程序。
12. 打开试验并使用超堆栈设置视图堆栈。然后选择单独打开文件并拼接磁贴。
13. 在斐济工具栏中选择"空手"工具，然后手动仔细跟踪单元格。
14. 按" 分析 "按钮并测量以可视化荧光强度。
15. 对每组的每个单元格重复此过程。
16. 保存测量值并将其导出到电子表格编辑器。
17. 将此数据添加到统计分析程序中并进行统计分析。

8. 统计分析

注意:对于数据分析和图形，请使用统计分析程序。

1. 打开程序。
2. 插入获得的数据并测试正态性参数。
3. 对于具有正态分布的数据，请使用学生 t 检验，对于非参数检验，请使用曼-惠特尼检验。
4. 当 p 值 小于 0.05 时，考虑具有统计显著性差异的数据。
5. 准备表示数据的图形，包括中心趋势度量（平均值或中位数）和变异度量。

结果

本报告旨在评估从呈现 巴西乳杆菌 -LCL或 巴西乳杆菌-DL形式的CL的患者中分离出的巴西 乳杆菌吞噬过程中发生的早期事件。我们首先评估了 人单核细胞来源的巨噬细胞对 巴西猪笼草-LCL或巴西猪笼草-DL的结合和吞噬作用。数据显示， 巴西乳杆菌-LCL和 巴西乳杆菌-DL与巨噬细胞的结合相似（图1）。此外，没有观察到宿主细胞对 <...

讨论

利什曼原虫 - 巨噬细胞相互作用是一个复杂的过程，涉及几个可能影响疾病发展的步骤⁵。为了更好地了解未被置 信化的利什曼原虫 和宿主细胞相互作用所涉及的机制，我们描述了一种方案，该方案采用共聚焦荧光显微镜来评估 利什曼原虫 感染早期至晚期的吞噬作用。使用涉及两个或多个荧光团的荧光技术来研究细胞生物学机制，包括免疫标记和荧光标记?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	21985023
AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	Tem varios no site
anti-LC3 antibody	Novus Biologicals	NB600-1384
Bovine serum albumin (BSA)	Thermo Fisher Scientific	X
CellStripper	Corning	25-056-CI
CellTracker Red (CMTPX) Dye	Thermo Fisher Scientific	C34552
Centrífuga	Thermo Fisher Scientific
Ciprofloxacin	Isofarma	X
CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	X
Confocal fluorescence microscope (Leica SP8)	Leica	Leica SP8
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270106
Fluorescence microscope (Olympus Lx73)	Olympus	Olympus Lx73
Gentamicin	Gibco	15750045
Glutamine	Thermo Fisher Scientific	35050-061
HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid)	Gibco	X
Histopaque	Sigma	10771
M-CSF	Peprotech	300-25
NH4Cl	Sigma	A9434
Normal goat serum	Sigma	NS02L
Nucleofector 2b Device	Lonza	AAB-1001
Nucleofector solution	Lonza	VPA-1007
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Phalloidin	Invitrogen	A12379
Phorbol myristate acetate (PMA)	Sigma	P1585
Phosphate buffer solution (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010023
ProLong Gold Antifade kit	Life Technologies	P36931
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	Gibco	11875-093
Saponin	Thermo Fisher Scientific	X
Schneider's Insect medium	Sigma	S0146
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium pyruvate	Sigma	S8636
Triton X-100	Sigma	X