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要約

リーシュマニア感染における貪食作用に関連するメカニズムは、ほとんど解明されていないままである。ここでは、リーシュマニアと宿主細胞との相互作用の間に起こる初期事象を評価する方法について説明する。

要約

貪食作用は、認識、結合、および内在化という別個のステップを含む、調整されたプロセスです。プロの貪食細胞は、複数の宿主細胞受容体によって寄生虫表面上のリガンドを認識することからなる、貪食作用によって リーシュマニア 寄生虫を取り込む。 リーシュマニア のマクロファージ膜への結合は、補体受容体1型(CR1)および補体受容体3型(CR3)およびパターン認識受容体を介して起こる。リポホスホグリカン(LPG)および63kDa糖タンパク質(gp63)は、マクロファージ-リーシュマニア 相互作用に関与する主なリガンドである。宿主細胞受容体による寄生虫リガンドの最初の認識に続いて、寄生虫は内在化し、生存し、寄生性液胞内で増殖する。 リーシュマニア誘発液胞の成熟過程は、単量体Gタンパク質Rab 5およびRab 7、リソソーム関連膜タンパク質1(LAMP-1)、リソソーム関連膜タンパク質2(LAMP-2)、および微小管関連タンパク質1A/1B-軽鎖3(LC3)を含む細胞内小胞からの分子の獲得を含む。

ここでは、(i)結合(ii)インターナリゼーション、および(iii)ファゴソーム成熟を含む、共焦点顕微鏡法を用いて宿主細胞との リーシュマニア 相互作用中に生じる初期事象を評価する方法について説明する。感染転帰のこれらの決定要因を取り巻く知識体系に追加することにより、 我々はリーシュマニア 感染の病因の理解を改善し、新規化学療法標的の最終的な探索を支援することを望んでいる。

概要

リーシュマニア症は、 リーシュマニア属の原生動物寄生虫によって引き起こされる顧みられない熱帯病であり、脊椎動物宿主において、皮膚リーシュマニア症、皮膚粘膜リーシュマニア症および内臓リーシュマニア症を含む広範囲の臨床症状をもたらす1。世界保健機関(WHO)は、10億人以上の人々が危険にさらされており、年間100万人以上の新規症例が報告されていると推定しています2。

リーシュマニア属菌は、単球、マクロファージおよび樹状細胞を含む宿主細胞内で生存する義務性細胞内原生動物である3。リーシュマニア-マクロファージ相互作用は、直接相互作用を介して、または補体受容体を含むオプソニゼーションによって、複数の宿主細胞受容体および寄生虫リガンドを含む複雑なプロセスである4,5。CR1、CR3、マンノースフコース、フィブロネクチン、トール様およびスカベンジャー受容体などの古典的な表面受容体は、マクロファージへの寄生虫付着を媒介する6、7、8。これらの受容体は、63kDa糖タンパク質(gp63)および糖脂質リポホスホグリカン(LPG)9を含むリーシュマニアの表面上の分子を認識する。これらは、プロマスチゴテスの表面上で最も豊富な分子であり、宿主免疫応答の転覆に不可欠な役割を果たし、哺乳動物細胞における寄生虫感染の確立を促進する10。寄生虫表面リガンドがマクロファージ受容体に結合すると、F-アクチンは哺乳類の細胞表面に蓄積し、寄生虫が貪食されるにつれて寄生虫を取り囲む。続いて、これは寄生刺激性液胞(PV)と呼ばれる寄生虫誘発区画の形成をもたらし、これはファゴリソソームの特徴11を提示する。これらのファゴリソソームの内部に入ると、寄生虫は生存と増殖に不可欠ないくつかの変化を経験する3。

PVの生合成は、この病原体の細胞内生存に不可欠な高度に調節された膜輸送プロセスである12。このコンパートメントの形成は、宿主エンドサイトーシス経路のファゴソームとコンパートメントとの間の逐次的な融合事象から生じる。古典的な細胞生物学研究は、PVの成熟が単量体Gタンパク質Rab 5およびRab 7タンパク質の獲得を含むことを明らかにしており、これらはそれぞれ初期および後期エンドソーム成熟にそれぞれ関連している13。さらに、これらの区画は、リソソーム膜の主要タンパク質構成成分であるリソソーム関連膜タンパク質1および2(LAMP 1、LAMP 2)およびオートファゴソームマーカー14である微小管関連タンパク質1A/1B軽鎖3(LC3)を獲得する。明らかな類似性にもかかわらず、PV形成15,16の動態およびこれらの区画の形態は、リーシュマニア種によって異なる。例えば、L. mexicanaまたはL. amazonensisによって引き起こされる感染は、多数の寄生虫を含む大きな区画の形成を誘導する17。対照的に、L. braziliensisやL. infantumなどの他の種は、通常、各液胞に1つまたは2つの寄生虫のみを含むより小さな液胞を形成する18。

宿主細胞とリーシュマニア の相互作用に関するこの知識にもかかわらず、宿主受容体と寄生虫リガンドとの間の接触によって引き起こされる初期事象は完全には解明されていない。これらの事象は、寄生虫感染の結果の決定因子であることが知られており、寄生虫種、寄生虫を認識するために動員される宿主細胞受容体のタイプ、およびマクロファージシグナル伝達経路の活性化に依存する19、20。したがって、 リーシュマニア誘発PVの生合成に関与する分子を同定し、感染の確立および転帰においてこれらの分子が果たす役割を決定することが不可欠である。ここでは、結合、内在化、ファゴソーム形成および成熟を含む、 リーシュマニアの貪食作用の間に起こる初期事象をモニターする方法について説明する。この研究は、異なる リーシュマニア 種によって誘導されるPVの形成におけるPLC、Akt、Rab5、Rab7およびLC3の関与を明らかにするのに役立つ可能性がある。重要なことに、このプロトコルは、PV成熟に関与する他のタンパク質の関与を調査するために使用することができる。今後の研究は、 リーシュマニアと宿主細胞の相互作用に関与するメカニズムに関する知識を広げ、新しい化学療法戦略の設計に貢献するでしょう。

プロトコル

細胞は、国家研究倫理委員会(ID:94648218.8.0000.0040)による手順の承認に従って、健康なドナーから入手した。

1. 細胞培養

  1. ヒト単球由来マクロファージ
    注:マクロファージへの in vitro 分化のためのヒト単球由来マクロファージを得るには、健康なドナーから血液を採取し、D. EnglishおよびB. R. Andersen21によって記述されているように末梢血単核球(PBMC)を精製する。
    1. 末梢血(50mL)を採取した後、ヘパリン処理チューブに注ぎ、室温でリン酸緩衝液(PBS)で血液を1:1希釈する。希釈したヘパリン化血液を、以前に分布した密度勾配媒体の上に静かに置きます。
    2. 溶血を避けるために、チューブを252 × g で24°Cで30分間遠心分離します。
      注: 遠心分離機ブレークオフを設定して、グラデーション層の混合を回避します。遠心分離後、赤血球、密度勾配培地、PBMCリングおよび血漿:下から上に不連続な勾配層が形成される。
    3. 密度勾配媒体とプラズマ層の間に位置するPBMCリングを新しいチューブに移し、PBSで満たして過剰な密度勾配媒体を洗い流します。
    4. 細胞を1回洗浄し、190×gで4°Cで10分間遠心分離する。
    5. 上清を捨て、ペレットを1mLの完全RPMI培地に再懸濁する。
    6. 25 mM N-[2×-ヒドロキシエチル]ピペラジン-N′-[2-エタンスルホン酸](HEPES)、2 g/L炭酸水素ナトリウム、2 mM グルタミン、20 g/mLシプロフロキサシンおよび10%不活化ウシ胎児血清(FBS)(完全RPMI培地)を24ウェルプレート中で5%CO2未満で37°Cで7日間、37°Cで5%CO2未満で7日間、細胞とプレート2を計数し、24ウェルプレートで5%CO2未満で7日間、単球をマクロファージに分化させる接着によって。
  2. THP-1カルチャー
    1. 75cm2培養フラスコ中の10mLの完全RPMI培地中で2×105細胞の濃度でTHP-1細胞株を増殖させる。
    2. 細胞培養物を37°Cのインキュベーター内で5%CO2 下で7日間維持する。
    3. 細胞を720×gで4°Cで10分間遠心分離し、ペレットを完全RPMI培地に再懸濁した。
    4. ノイバウアーチャンバー内の細胞を数えます。
    5. 13 mmガラスカバーグラス上のプレート細胞を、5 %CO2下で37°Cで100 nMホルボールミリスチン酸酢酸(PMA)を含む500 μLの完全RPMI培地中で、1ウェルあたり2 × 105細胞の濃度で、THP1細胞のマクロファージへの分化を可能にする。
    6. 3日後、細胞を0.9%NaCl溶液で2回洗浄し、PMAを含む培地を除去した。
    7. 分化したTHP-1細胞をPMA非含有完全RPMI培地中で、5%CO2 下で37°Cでさらに2日間インキュベートしてから実験を開始する。

2. 寄生虫培養とセルトラッカーレッド染色

注:蛍光顕微鏡で寄生虫を可視化するには、CellTracker 赤色蛍光色素(CMTPX)を使用して染色を実行します。あるいは、カルボキシフルオレセインを含む他のマーカーは、製造業者の指示に従って、またはGFP、RFP、または他の蛍光レポーター遺伝子を恒常的に発現するプロマスチゴットを使用することができる。細胞に感染するために使用される寄生虫は、7継代以下のプロマスティゴート軸索培養物から得られる増殖の固定期にあるものである。

  1. リーシュマニア属を育てる。 50 μg/mLのゲンタマイシンおよび10%FBSを添加した5 mLのシュナイダー培地を含む細胞培養フラスコ中の培地1,000 μLあたり1 x 105の寄生虫でプロマスチゴテス。
  2. 寄生虫軸索培養物を24°Cの生化学的酸素要求量(B.O.D.)中でインキュベートした後、ノイバウアーチャンバー内で毎日計数を行う。寄生虫の形態(薄く、細長い)と可動性を5日間確認してください。寄生虫は、8時間の間隔で2つの連続したカウントが同様の量を表示する場合、成長の静止期にあると考えられる。
  3. 成長の固定期に達したら、4 mLの0.9%NaCl溶液に1 μM CMTPXを加え、光との接触を避けて5%CO2 下で37°Cで15分間インキュベートします。
  4. FBSを1:1の割合で加え、寄生虫懸濁液をさらに1分間インキュベートする。
  5. 寄生虫をPBSで3回洗浄し、続いて1,781 × gで10分間遠心分離する。
  6. 寄生虫ペレットを1,000 μLのRPMI完全培地に懸濁します。
  7. ノイバウアー室の寄生虫を数えます。

3. マクロファージに対する リーシュマニア 結合の評価

  1. 種子2×105THP-1細胞またはヒト単球由来マクロファージを、13mmガラスカバースリップを備えた24ウェルプレート上の1ウェルあたり500μLの完全RPMI培地に塗布した。
  2. 細胞を37°Cで5%CO2下で24 時間培養する。
  3. 細胞を0.9%NaCl溶液で2回洗浄し、完全なRPMI培地中で4°Cで10分間インキュベートする。
  4. A. L. Petersen22 によって記述されている固定相プロマスチゴットをウェルプレートに 10:1 の比率で加え、次いで 720 × g で 4 °C 下で 5 分間遠心分離します。
  5. 4°Cで5分間インキュベートする。
  6. 0.9%NaCl溶液で細胞を2回洗浄し、インターナライズされていないプロマスチゴットを除去します。
  7. 細胞を4%パラホルムアルデヒド中で室温で15分間固定する。
  8. カバースリップを15 mM NH4Clと共に室温で15分間インキュベートします。
  9. PBS 0.15%ウシ血清アルブミン(BSA)で3回洗う。ブロッキング溶液(PBS中の3%BSA)と共に室温で1時間インキュベートする。
  10. PBSで3回洗った後、0.15%PBS-サポニンで室温で15分間透過処理します。
  11. ファロイジン(希釈1:1,200)を室温で1時間加え、光から保護する。
  12. カバースリップは、取り付けメディアを使用して取り付けます。
  13. 63×/1.4の対物レンズを用いて共焦点蛍光顕微鏡で画像を取得します。

4. マクロファージによる リーシュマニア 貪食作用の評価

  1. 種子2×105THP-1細胞またはヒト単球由来マクロファージを、13mmガラスカバースリップを備えた24ウェルプレート上の1ウェルあたり500μLの完全RPMI培地に塗布した。
  2. 細胞を5%CO2下で37°Cで24時間培養する。
  3. 細胞を0.9%NaCl溶液で2回洗浄し、24ウェルプレート中の完全RPMI培地中で4°Cで10分間インキュベートする。
  4. A. L. Petersen22によって記述された固定相リーシュマニア属菌を10:1(寄生虫:宿主細胞)比で加え、次いで720×gで4°C下で10分間遠心分離する。
  5. 細胞を4°Cで5分間インキュベートする。
  6. 0.9%NaCl溶液で細胞を2回洗浄し、インターナライズされていないプロマスチゴットを除去します。
  7. 補充されたRPMI培地中で細胞を37°Cで1時間インキュベートする。
  8. 細胞を4%パラホルムアルデヒドで15分間固定する。
  9. カバースリップは、お好みの取り付け用メディアを使用して取り付けます。
  10. 100×/1.4 対物レンズを使用して、蛍光顕微鏡下でランダム フィールドで 400 個以上の細胞をカウントします。

5. リーシュマニア 誘発液胞成熟の評価

注:THP-1細胞トランスフェクションは、M. B. Maess、B. WittigおよびS. Lorkowski 23によって記述されているように実施されるべきである。ここでは、このプロトコルを最小限の変更で要約します。ヌクレオフェクションは、ヌクレオフェクターを必要とする特定のトランスフェクション法です。代替方法として、細胞は、リポフェクタミン24 およびレンチウイルス形質導入25を用いてトランスフェクトされ得る。

  1. リーシュマニア誘導PVの生合成を調べるために、THP1細胞をPLC 26、27、Akt26、27、Rab 5 28、29、30またはRab 728、29、31プラスミドでトランスフェクトします。
    注:この方法論は、THP-1細胞を上記以外の遺伝子でトランスフェクトするために使用することができる。
  2. 100 ng/mL PMA および 50 μM 2-メルカプトエタノールを 48 時間添加した 10 mL 完全 RPMI 培地を含む75 cm² 組織培養フラスコに 1.5 x 107 個の THP-1 細胞をシードします。
  3. 細胞を0.9%NaCl溶液で1回洗浄する。
  4. 非酵素細胞解離溶液を用いて細胞を剥離し、室温で5分間遠心分離機(250×g)する。
  5. THP-1細胞を1mLのRPMI培地に再懸濁し、ノイバウアーチャンバー内でカウントを行う。
  6. THP-1細胞を再び250×gで室温で10分間遠心分離する。上清を捨てる。
  7. 2 ×106 個の細胞を 100 μL の Nucleofector 溶液に再懸濁し、蛍光タンパク質でタグ付けされた目的のタンパク質をコードするプラスミドを 0.5 μg と共にインキュベートします。
  8. THP-1細胞および核酸を含む懸濁液をヌクレオフェクターキュベットに移す。
  9. ヌクレオフェクタープログラムY-001を用いてTHP1細胞をトランスフェクトする。
  10. トランスフェクションした細胞(2x106)を回収し、13 mmガラスカバースリップ(4ウェル/トランスフェクション)を備えた24ウェルプレート上の500 μL RPMI培地にシードします。
  11. THP-1細胞を完全RPMI培地中で37°Cで0.5、2、4、6、12および24時間インキュベートする。
  12. 手順 3.13 と 3.13 を繰り返します。

6. リーシュマニア 属PVへのLC3の募集の評価

注:オートファジー膜マーカーLC3は、ファゴソームがオートファジー機能を示すかどうかを調べるために使用することができる。 リーシュマニア誘発PVsへのLC3動員は、C. Matte 32およびB. R. S. Dias33 によって以前に記載されたように、抗LC3抗体による免疫標識細胞によって感染中に評価することができる。

  1. 種子2×105THP-1細胞またはヒト単球由来マクロファージを500 μL完全RPMI培地中、13 mmガラスカバースリップを備えた24ウェルプレート上に塗布します。
  2. 細胞を5%CO2下で37°Cで24時間培養する。
  3. 0.9%NaCl溶液で細胞を2回洗浄し、完全なRPMI培地中でインキュベートする。
  4. A. L. Petersen22によって記載されているように固定期Leishmania spp. promastitesを10:1(寄生虫:宿主細胞)比で加え、細胞を720×gで4°C下で5分間遠心分離する。
  5. 37°Cで30分または4時間インキュベートする。その後、2回洗浄して細胞を固定し、感染の初期段階で リーシュマニア誘発PV膜へのLC3動員を評価した。
    1. あるいは、感染の後期段階でPV膜へのLC3動員を評価するために、感染の4時間で別のマクロファージ群を2回洗浄して、非内在化プロマスチゴットを除去する。感染細胞を完全RPMI培地中でさらに12時間および24時間インキュベートし、最後に2回洗浄して固定する。
      注:固定細胞は、標識するまで4°CのPBSまたは0.9%NaCl溶液中に保持することができます。
  6. 0.1% Triton X-100、1% BSA、20% 正常ヤギ血清、6% 脱脂粉乳、および 50% FBS で固定細胞を同時にブロックし、室温で 20 分間透過させます。
  7. PBSで希釈した抗LC3抗体(1:200)で細胞を室温で2時間インキュベートする。
    注:免疫染色のネガティブコントロールとして、一次抗体起源の動物由来の免疫グロブリンG(IgG)と一次抗体に使用した濃度と同等の濃度で細胞群をインキュベートする必要があります。
  8. 室温で0.9%NaCl溶液で細胞を3回洗浄する。
  9. AlexaFluor 488結合ヤギ抗ウサギIgG(1:500)または好ましい蛍光色素結合二次抗体と細胞を室温で1時間インキュベートする。
  10. 室温で0.9%NaCl溶液で細胞を3回洗浄する。
  11. カバースリップは、お好みの取り付け用メディアを使用して取り付けます。
  12. 63x/1.4対物レンズを使用して共焦点蛍光顕微鏡で画像を取得します。

7. 共焦点顕微鏡の取得とフィジーの定量化

注:免疫蛍光画像の取得は、共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して実行する必要があります。より良い解像度を得るには、油浸63x対物レンズを使用してください。

  1. 13 mm のガラス製カバースリップは室温で放置し、取得の少なくとも 30 分前に光から保護します。
  2. カバースリップを吸収性ティッシュで拭きます。
  3. 目的物に浸漬油を一滴加え、スライドを追加します。
  4. オイルがスライドに触れるまで、対物レンズを上に動かします。
  5. 顕微鏡で焦点を観察して調整し、オイルで63x対物レンズオプションを選択します。
  6. Leica プログラムを開き、488、552、および 405 波長のレーザーを調整します。
  7. 画像解像度 1,024 x 1,024 を選択します。
  8. [ ライブ ]ボタンをクリックし、Zスタックを設定して、[ 開始] オプションを押します。次に、もう一度やり直して 、終了 ボタンを押します。良好な解像度の共焦点画像を得るために、スライスの厚さに20μmを推奨します。
  9. 画像の取得を待ってから、Leicaツールの「最大投影」オプションを選択します。
  10. 実験を保存します。
  11. LIFまたはTIFF形式の画像をコンピュータにエクスポートし、FIJIプログラムを開きます。
  12. 実験を開き、ハイパースタックでビュースタックを設定します。次に、開いているファイルを個別に選択し、タイルをステッチします。
  13. フィジーのツールバーのフリーハンドツールを選択し、手でセルを慎重にトレースします。
  14. 分析ボタンを押して測定し、蛍光強度を視覚化します。
  15. グループごとに各セルに対してこのプロセスを繰り返します。
  16. 測定値を保存し、スプレッドシートエディタにエクスポートします。
  17. このデータを統計分析プログラムに追加し、統計分析を行います。

8. 統計解析

メモ: データ分析およびグラフィックスの場合は、統計分析プログラムを使用してください。

  1. プログラムを開きます。
  2. 得られたデータを挿入し、正規性パラメータをテストします。
  3. 正規分布のデータにはスチュー デントのt検定を使用し、ノンパラメトリック検定にはマン・ホイットニー検定を使用します。
  4. p値が0.05未満の場合に統計的に有意な差を持つデータを考えてみましょう。
  5. 中心傾向メジャー (平均または中央値) と変動メジャーを使用して、データを表すグラフィックスを準備します。

結果

この報告書は、L. braziliensis-LCLまたはL. braziliensis-DL形態のCLを提示する患者から単離されたL. braziliensisの貪食作用の間に起こる初期の事象を評価することを目的としており、共焦点顕微鏡を用いて、寄生虫の貪食に関連する主な事象(結合、内在化、および貪食成熟)を調査した。 我々はまず、ヒト単球由来マクロファージによるL.ブラジリエンシス-LCLまたはL.ブラ...

ディスカッション

リーシュマニアとマクロファージの相互作用は複雑なプロセスであり、疾患の発症に影響を与える可能性のあるいくつかのステップを伴います5。オプソニン化されていないリーシュマニアと宿主細胞の相互作用に関与するメカニズムをよりよく理解するために、我々は、共焦点蛍光顕微鏡法を用いてリーシュマニア感染の初期段階から後期段階までの貪食作用...

開示事項

資金提供者は、研究デザイン、データ収集または分析、出版の決定、または原稿の準備において何の役割も持っていませんでした。著者らは、この研究は、潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または財政的関係がない場合に実施されたことを宣言する。

謝辞

Gonçalo Moniz Institute、Fiocruz Bahia、ブラジル、顕微鏡検査部門の支援に感謝します。この研究は、INOVA-FIOCRUZ番号79700287000によって支援され、P.S.T.V.はCNPq(305235/2019-2)から研究における生産性のための助成金を保持しています。プラスミドは、カリフォルニア州トロント大学のMauricio Terebiznikによって親切に提供されました。著者らは、英語の改訂と原稿のコピーエディットの支援について、Andris K. Walter 氏に感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
2-mercaptoethanolThermo Fisher Scientific21985023
AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificTem varios no site
anti-LC3 antibodyNovus BiologicalsNB600-1384
Bovine serum albumin (BSA)Thermo Fisher ScientificX
CellStripperCorning25-056-CI
CellTracker Red (CMTPX) DyeThermo Fisher ScientificC34552
CentrífugaThermo Fisher Scientific
CiprofloxacinIsofarmaX
CO2 incubatorThermo Fisher ScientificX
Confocal fluorescence microscope (Leica SP8)LeicaLeica SP8
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco10270106
Fluorescence microscope (Olympus Lx73)OlympusOlympus Lx73
GentamicinGibco15750045
GlutamineThermo Fisher Scientific35050-061
HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid)GibcoX
HistopaqueSigma10771
M-CSFPeprotech300-25
NH4ClSigmaA9434
Normal goat serumSigmaNS02L
Nucleofector 2b DeviceLonzaAAB-1001
Nucleofector solutionLonzaVPA-1007
ParaformaldehydeSigma158127
PhalloidinInvitrogenA12379
Phorbol myristate acetate (PMA)SigmaP1585
Phosphate buffer solution (PBS)Thermo Fisher Scientific10010023
ProLong Gold Antifade kitLife TechnologiesP36931
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mediumGibco11875-093
SaponinThermo Fisher ScientificX
Schneider's Insect mediumSigmaS0146
Sodium bicarbonateSigmaS5761
Sodium pyruvateSigmaS8636
Triton X-100SigmaX

参考文献

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