共焦点顕微鏡を用いた リーシュマニア の貪食作用の調査

要約

リーシュマニア感染における貪食作用に関連するメカニズムは、ほとんど解明されていないままである。ここでは、リーシュマニアと宿主細胞との相互作用の間に起こる初期事象を評価する方法について説明する。

要約

貪食作用は、認識、結合、および内在化という別個のステップを含む、調整されたプロセスです。プロの貪食細胞は、複数の宿主細胞受容体によって寄生虫表面上のリガンドを認識することからなる、貪食作用によって リーシュマニア 寄生虫を取り込む。 リーシュマニア のマクロファージ膜への結合は、補体受容体1型(CR1)および補体受容体3型(CR3)およびパターン認識受容体を介して起こる。リポホスホグリカン(LPG)および63kDa糖タンパク質(gp63)は、マクロファージ-リーシュマニア 相互作用に関与する主なリガンドである。宿主細胞受容体による寄生虫リガンドの最初の認識に続いて、寄生虫は内在化し、生存し、寄生性液胞内で増殖する。 リーシュマニア誘発液胞の成熟過程は、単量体Gタンパク質Rab 5およびRab 7、リソソーム関連膜タンパク質1(LAMP-1)、リソソーム関連膜タンパク質2(LAMP-2)、および微小管関連タンパク質1A/1B-軽鎖3(LC3)を含む細胞内小胞からの分子の獲得を含む。

ここでは、(i)結合(ii)インターナリゼーション、および(iii)ファゴソーム成熟を含む、共焦点顕微鏡法を用いて宿主細胞との リーシュマニア 相互作用中に生じる初期事象を評価する方法について説明する。感染転帰のこれらの決定要因を取り巻く知識体系に追加することにより、 我々はリーシュマニア 感染の病因の理解を改善し、新規化学療法標的の最終的な探索を支援することを望んでいる。

概要

リーシュマニア症は、 リーシュマニア属の原生動物寄生虫によって引き起こされる顧みられない熱帯病であり、脊椎動物宿主において、皮膚リーシュマニア症、皮膚粘膜リーシュマニア症および内臓リーシュマニア症を含む広範囲の臨床症状をもたらす¹。世界保健機関(WHO)は、10億人以上の人々が危険にさらされており、年間100万人以上の新規症例が報告されていると推定しています²。

リーシュマニア属菌は、単球、マクロファージおよび樹状細胞を含む宿主細胞内で生存する義務性細胞内原生動物^である3。リーシュマニア-マクロファージ相互作用は、直接相互作用を介して、または補体受容体を含むオプソニゼーションによって、複数の宿主細胞受容体および寄生虫リガンドを含む複雑なプロセスである^4,5。CR1、CR3、マンノースフコース、フィブロネクチン、トール様およびスカベンジャー受容体などの古典的な表面受容体は、マクロファージへの寄生虫付着を媒介する⁶、^7、

プロトコル

細胞は、国家研究倫理委員会(ID:94648218.8.0000.0040)による手順の承認に従って、健康なドナーから入手した。

1. 細胞培養

1. ヒト単球由来マクロファージ
   注:マクロファージへの in vitro 分化のためのヒト単球由来マクロファージを得るには、健康なドナーから血液を採取し、D. EnglishおよびB. R. Andersen²¹によって記述されているように末梢血単核球(PBMC)を精製する。
   1. 末梢血(50mL)を採取した後、ヘパリン処理チューブに注ぎ、室温でリン酸緩衝液(PBS)で血液を1:1希釈する。希釈したヘパリン化血液を、以前に分布した密度勾配媒体の上に静かに置きます。
   2. 溶血を避けるために、チューブを252 × g で24°Cで30分間遠心分離します。
      注: 遠心分離機ブレークオフを設定して、グラデーション層の混合を回避します。遠心分離後、赤血球、密度勾配培地、PBMCリングおよび血漿:下から上に不連続な勾配層が形成される。
   3. 密度勾配媒体とプラズマ層の間に位置するPBMCリングを新しいチューブに移し、PBSで満たして過剰な密度勾配媒体を洗い流します。
   4. 細胞を1回洗浄し、190×gで4°Cで10分間遠心分離する。
   5. 上清を捨て、ペレット....

結果

この報告書は、L. braziliensis-LCLまたはL. braziliensis-DL形態のCLを提示する患者から単離されたL. braziliensisの貪食作用の間に起こる初期の事象を評価することを目的としており、共焦点顕微鏡を用いて、寄生虫の貪食に関連する主な事象(結合、内在化、および貪食成熟)を調査した。 我々はまず、ヒト単球由来マクロファージによるL.ブラジリエンシス-LCLまたはL.ブラ.......

ディスカッション

リーシュマニアとマクロファージの相互作用は複雑なプロセスであり、疾患の発症に影響を与える可能性のあるいくつかのステップを伴い^ます5。オプソニン化されていないリーシュマニアと宿主細胞の相互作用に関与するメカニズムをよりよく理解するために、我々は、共焦点蛍光顕微鏡法を用いてリーシュマニア感染の初期段階から後期段階までの貪食作用.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	21985023
AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	Tem varios no site
anti-LC3 antibody	Novus Biologicals	NB600-1384
Bovine serum albumin (BSA)	Thermo Fisher Scientific	X
CellStripper	Corning	25-056-CI
CellTracker Red (CMTPX) Dye	Thermo Fisher Scientific	C34552
Centrífuga	Thermo Fisher Scientific
Ciprofloxacin	Isofarma	X
CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	X
Confocal fluorescence microscope (Leica SP8)	Leica	Leica SP8
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270106
Fluorescence microscope (Olympus Lx73)	Olympus	Olympus Lx73
Gentamicin	Gibco	15750045
Glutamine	Thermo Fisher Scientific	35050-061
HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid)	Gibco	X
Histopaque	Sigma	10771
M-CSF	Peprotech	300-25
NH4Cl	Sigma	A9434
Normal goat serum	Sigma	NS02L
Nucleofector 2b Device	Lonza	AAB-1001
Nucleofector solution	Lonza	VPA-1007
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Phalloidin	Invitrogen	A12379
Phorbol myristate acetate (PMA)	Sigma	P1585
Phosphate buffer solution (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010023
ProLong Gold Antifade kit	Life Technologies	P36931
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	Gibco	11875-093
Saponin	Thermo Fisher Scientific	X
Schneider's Insect medium	Sigma	S0146
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium pyruvate	Sigma	S8636
Triton X-100	Sigma	X