JoVE Logo
Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Der Mechanismus, der mit Phagozytose bei Leishmanien-Infektionen verbunden ist, ist noch wenig verstanden. Hier beschreiben wir Methoden, um die frühen Ereignisse zu bewerten, die während der Leishmania-Interaktion mit den Wirtszellen auftreten.

Zusammenfassung

Phagozytose ist ein orchestrierter Prozess, der verschiedene Schritte umfasst: Erkennen, Binden und Verinnerlichen. Professionelle Phagozyten nehmen Leishmanien-Parasiten durch Phagozytose auf, die aus der Erkennung von Liganden auf Parasitenoberflächen durch mehrere Wirtszellrezeptoren besteht. Die Bindung von Leishmanien an Makrophagenmembranen erfolgt durch Komplementrezeptor Typ 1 (CR1) und Komplementrezeptor Typ 3 (CR3) und Mustererkennungsrezeptoren. Lipophosphoglycan (LPG) und 63 kDa Glykoprotein (gp63) sind die Hauptliganden, die an Makrophagen-Leishmanien-Interaktionen beteiligt sind. Nach der ersten Erkennung von Parasitenliganden durch Wirtszellrezeptoren werden Parasiten internalisiert, überleben und vermehren sich in parasitophoren Vakuolen. Der Reifungsprozess von Leishmanien-induzierten Vakuolen beinhaltet den Erwerb von Molekülen aus intrazellulären Vesikel, einschließlich des monomeren G-Proteins Rab 5 und Rab 7, des lysosomalen assoziierten Membranproteins 1 (LAMP-1), des lysosomalen assoziierten Membranproteins 2 (LAMP-2) und des Mikrotubuli-assoziierten Proteins 1A / 1B-Lichtkette 3 (LC3).

Hier beschreiben wir Methoden zur Bewertung der frühen Ereignisse, die während der Leishmania-Interaktion mit den Wirtszellen auftreten, mittels konfokaler Mikroskopie, einschließlich (i) Bindung, (ii) Internalisierung und (iii) Phagosomenreifung. Durch die Erweiterung des Wissens über diese Determinanten des Infektionsergebnisses hoffen wir, das Verständnis der Pathogenese der Leishmanien-Infektion zu verbessern und die Suche nach neuen chemotherapeutischen Zielen zu unterstützen.

Einleitung

Leishmaniose ist eine vernachlässigte Tropenkrankheit, die durch Protozoenparasiten der Gattung Leishmanien verursacht wird und zu einem breiten Spektrum klinischer Manifestationen im Wirbeltierwirt führt, einschließlich kutaner Leishmaniose, mukokutaner Leishmaniose und viszeraler Leishmaniose 1. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) schätzt, dass über eine Milliarde Menschen gefährdet sind, wobei mehr als eine Million neue Fälle pro Jahr gemeldetwerden 2.

Leishmania spp. sind obligate intrazelluläre Protozoen, die in Wirtszellen überleben, einschließlich Monozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen3. Leishmanien-Makrophagen-Interaktion ist ein komplexer Prozess, an dem mehrere Wirtszellrezeptoren und Parasitenliganden beteiligt sind, entweder durch direkte Interaktion oder durch Opsonisierung mit Komplementrezeptoren 4,5. Klassische Oberflächenrezeptoren wie CR1, CR3, Mannose-Fucose, Fibronektin, Toll-like- und Scavenger-Rezeptoren vermitteln die Parasitenbindung an Makrophagen 6,7,8. Diese Rezeptoren erkennen Moleküle auf der Oberfläche von Leishmania, darunter das 63 kDa-Glykoprotein (gp63) und das Glykolipid Lipophosphoglycan (LPG)9. Dies sind die am häufigsten vorkommenden Moleküle auf der Oberfläche von Promastigoten und spielen eine wesentliche Rolle bei der Subversion der Immunantwort des Wirts, was die Etablierung einer Parasiteninfektion in Säugetierzellen begünstigt10. Nachdem Parasitenoberflächenliganden an Makrophagenrezeptoren gebunden haben, reichert sich F-Aktin auf den Zelloberflächen von Säugetieren an und umgibt Parasiten, wenn sie phagozytiert werden. Anschließend führt dies zur Bildung eines parasiteninduzierten Kompartiments, das als parasitophoröse Vakuole (PV) bezeichnet wird und phagolysosomale Merkmale aufweist11. Sobald sie sich in diesen Phagolysosomen befinden, durchlaufen Parasiten mehrere Veränderungen, die für das Überleben und die Vermehrung unerlässlich sind3.

Die Biogenese von PVs ist ein stark regulierter Membrantransportprozess, der für das intrazelluläre Überleben dieses Erregers entscheidend ist12. Die Bildung dieses Kompartiments resultiert aus sequentiellen Fusionsereignissen zwischen Phagosomen und Kompartimenten des endozytären Signalwegs des Wirts. Klassische zellbiologische Studien haben gezeigt, dass die Reifung von PVs den Erwerb von monomeren G-Proteinen Rab 5 und Rab 7 beinhaltet, die hauptsächlich mit einer frühen bzw. späten Endosomenreifung assoziiert sind13. Zusätzlich erwerben diese Kompartimente die Lysosom-assoziierten Membranproteine 1 und 2 (LAMP 1, LAMP 2), die Hauptproteinbestandteile der lysosomalen Membran und des Mikrotubuli-assoziierten Proteins 1A/1B-Lichtkette 3 (LC3), einen Autophagosomenmarker14. Trotz offensichtlicher Ähnlichkeiten variieren die Kinetik der PV-Bildung15,16 und die Morphologie dieser Kompartimente je nach Leishmania-Spezies. Zum Beispiel induziert eine Infektion durch L. mexicana oder L. amazonensis die Bildung großer Kompartimente, die eine große Anzahl von Parasiten enthalten17. Im Gegensatz dazu bilden andere Arten, wie L. braziliensis und L. infantum, kleinere Vakuolen, die normalerweise nur einen oder zwei Parasiten in jeder Vakuoleenthalten 18.

Trotz dieses Wissens über die Interaktion zwischen Wirtszelle und Leishmanie sind die anfänglichen Ereignisse, die durch den Kontakt zwischen Wirtsrezeptoren und Parasitenliganden ausgelöst werden, nicht vollständig aufgeklärt. Es ist bekannt, dass diese Ereignisse Determinanten des Ergebnisses einer Parasiteninfektion sind und von der Parasitenart, der Art der Wirtszellrezeptoren, die zur Erkennung von Parasiten rekrutiert werden, und der Aktivierung von Makrophagen-Signalwegen abhängen19,20. Daher ist es wichtig, die Moleküle zu identifizieren, die an der Biogenese von Leishmanien-induzierten PVs beteiligt sind, und die Rolle(n) zu bestimmen, die diese Moleküle bei der Etablierung und dem Ergebnis von Infektionen spielen. Hier beschreiben wir eine Methode zur Überwachung früher Ereignisse, die während der Phagozytose von Leishmania auftreten, einschließlich Bindung, Internalisierung, Phagosomenbildung und Reifung. Diese Arbeit könnte dazu beitragen, die Beteiligung von PLC, Akt, Rab5, Rab7 und LC3 an der Bildung von PVs zu klären, die durch verschiedene Leishmania-Arten induziert werden. Wichtig ist, dass dieses Protokoll verwendet werden kann, um die Beteiligung anderer Proteine zu untersuchen, die an der PV-Reifung beteiligt sind. Zukünftige Studien werden das Wissen über die Mechanismen der Leishmania-Wirtszellinteraktion erweitern und zur Entwicklung neuartiger chemotherapeutischer Strategien beitragen.

Protokoll

Die Zellen wurden von gesunden Spendern nach Genehmigung der Verfahren durch die Nationalen Forschungsethikkommissionen gewonnen (ID: 94648218.8.0000.0040).

1. Zellkulturen

  1. Humane Monozyten-abgeleitete Makrophagen
    HINWEIS: Um humane Monozyten-abgeleitete Makrophagen für die In-vitro-Differenzierung in Makrophagen zu erhalten, sammeln Sie Blut von gesunden Spendern und reinigen Sie periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC), wie von D. English und B. R. Andersen beschrieben21.
    1. Nachdem Sie peripheres Blut (50 ml) gesammelt haben, gießen Sie es in ein heparinisiertes Röhrchen und verdünnen Sie das Blut 1: 1 in einer Phosphatpufferlösung (PBS) bei Raumtemperatur. Legen Sie verdünntes heparinisiertes Blut vorsichtig auf das zuvor verteilte Dichtegradientenmedium.
    2. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 252 × g für 30 min bei 24 °C, um eine Hämolyse zu vermeiden.
      HINWEIS: Stellen Sie den Zentrifugenabbruch ein, um eine Vermischung von Verlaufsschichten zu vermeiden. Nach der Zentrifugation bilden sich diskontinuierliche Gradientenschichten von unten nach oben: Erythrozyten, Dichtegradientenmedium, PBMC-Ring und Plasma.
    3. Übertragen Sie den PBMC-Ring, der sich zwischen dem Dichtegradientenmedium und den Plasmaschichten befindet, in ein neues Rohr und füllen Sie ihn mit PBS, um das überschüssige Dichtegradientenmedium auszuwaschen.
    4. Die Zellen einmal waschen und bei 190 × g 10 min bei 4 °C zentrifugieren.
    5. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml vollständigem RPMI-Medium.
    6. Zählen Sie die Zellen und die Platte 2 × 106 Zellen in 500 ml des Roswell Park Memorial Institute (RPMI), ergänzt mit 25 mM N-[2-hydroxyethyl] piperazin-N′-[2-ethansulfonsäure] (HEPES), 2 g/L Natriumbicarbonat, 2 mM Glutamin, 20 g/ml Ciprofloxacin und 10% inaktiviertem Fetal Bovine Serum (FBS) (vollständiges RPMI-Medium) für 7 Tage bei 37 °C unter 5%CO2 in einer 24-Well-Platte, damit sich Monozyten zu Makrophagen differenzieren können durch Adhäsion.
  2. THP-1 Kulturen
    1. THP-1-Zelllinie in einer Konzentration von 2 × 105 Zellen in 10 ml vollständigem RPMI-Medium in 75 cm2 Kulturkolben züchten.
    2. Zellkulturen 7 Tage lang in einem Inkubator bei 37 °C unter 5%CO2 halten.
    3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 720 × g für 10 min bei 4 °C und resuspendieren Sie das Pellet in vollständigem RPMI-Medium.
    4. Zellen in einer Neubauer-Kammer zählen.
    5. Plattenzellen auf 13 mm Glasdeckgläsern in einer Konzentration von 2 × 10 5 Zellen pro Vertiefung in 500 μL komplettem RPMI-Medium mit 100 nM Phorbolmyristatacetat (PMA) bei 37 °C unter5 %CO2 , um die Differenzierung von THP1-Zellen in Makrophagen zu ermöglichen.
    6. Nach drei Tagen die Zellen zweimal mit 0,9% iger NaCl-Lösung waschen, um PMA-haltiges Medium zu entfernen.
    7. Inkubieren Sie differenzierte THP-1-Zellen in PMA-freiem vollständigem RPMI-Medium bei 37 °C unter 5%CO2 für weitere 2 Tage, bevor Sie mit dem Experimentieren beginnen.

2. Parasitenkulturen und CellTracker Red Färbung

HINWEIS: Um Parasiten durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen, führen Sie eine Färbung mit CellTracker Red fluoreszierendem Farbstoff (CMTPX) durch. Alternativ können andere Marker, einschließlich Carboxyfluorescein, gemäß den Anweisungen des Herstellers oder Promastigoten verwendet werden, die GFP, RFP oder andere fluoreszierende Reportergene konstitutiv exprimieren. Parasiten, die zur Infektion von Zellen verwendet werden, sind diejenigen in der stationären Wachstumsphase, die aus einer promastigoten axenischen Kultur von nicht mehr als 7 Passagen gewonnen werden.

  1. Leishmania spp. Promastigoten bei 1 x 10 5 Parasiten pro 1.000 μL Medium in einem Zellkulturkolben mit5 mL Schneider-Medium, ergänzt mit 50 μg/ml Gentamicin und 10% FBS.
  2. Nach der Inkubation von axenischen Parasitenkulturen in einem biochemischen Sauerstoffbedarf (B.O.D.) bei 24 °C wird täglich in einer Neubauer-Kammer gezählt. Überprüfen Sie auf Parasitenform (dünn, länglich) und Mobilität für 5 Tage. Parasiten werden in der stationären Wachstumsphase betrachtet, wenn zwei aufeinanderfolgende Zählungen mit 8 Stunden Intervall ähnliche Mengen anzeigen.
  3. Nach Erreichen der stationären Wachstumsphase inkubieren Sie die Parasiten in 4 ml 0,9% NaCl-Lösung mit 1 μM CMTPX für 15 min bei 37 °C unter 5%CO2 , wobei der Kontakt mit Licht vermieden wird.
  4. Fügen Sie FBS im Verhältnis 1:1 hinzu und inkubieren Sie die Parasitensuspension für weitere 1 Min.
  5. Parasiten dreimal mit PBS waschen, gefolgt von einer Zentrifugation bei 1.781 × g für 10 min.
  6. Parasitenpellet in 1.000 μL RPMI Komplettmedium resuspendieren.
  7. Zählen Sie Parasiten in einer Neubauer-Kammer.

3. Beurteilung der Leishmania-Bindung an Makrophagen

  1. Seed 2 × 105 THP-1-Zellen oder humane Monozyten-abgeleitete Makrophagen in 500 μL komplettem RPMI-Medium pro Vertiefung auf einer 24-Well-Platte mit 13 mm Glasdeckgläsern.
  2. Zellen bei 37 °C unter 5%CO2 für 24 h kultivieren.
  3. Die Zellen werden zweimal mit 0,9% NaCl-Lösung gewaschen und 10 min lang in vollständigem RPMI-Medium bei 4 °C inkubiert.
  4. Stationäre Phasenpromastigoten, wie von A. L. Petersen22 beschrieben, im Verhältnis 10:1 zu Vertiefungsplatten zugeben und dann bei 720 × g für 5 min unter 4 °C zentrifugieren.
  5. Bei 4 °C 5 min inkubieren.
  6. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 0,9% NaCl-Lösung, um nicht internalisierte Promastigoten zu entfernen.
  7. Fixieren Sie die Zellen in 4% Paraformaldehyd für 15 min bei Raumtemperatur.
  8. Die Deckgläser mit 15 mMNH4Cl 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  9. Dreimal mit PBS 0,15% Rinderserumalbumin (BSA) waschen. Mit Blockierlösung (3% BSA in PBS) für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
  10. Dreimal mit PBS waschen und dann mit 0,15% PBS-Saponin für 15 min bei Raumtemperatur permeabilisieren.
  11. Phalloidin (verdünnt 1:1.200) für 1 h bei Raumtemperatur zugeben und vor Licht schützen.
  12. Deckgläser mit Montagemedien montieren.
  13. Erfassen Sie Bilder über ein konfokales Fluoreszenzmikroskop mit einem 63×/1,4-Objektiv.

4. Beurteilung der Leishmania-Phagozytose durch Makrophagen

  1. Seed 2 × 105 THP-1-Zellen oder humane Monozyten-abgeleitete Makrophagen in 500 μL komplettem RPMI-Medium pro Vertiefung auf einer 24-Well-Platte mit 13 mm Glasdeckgläsern.
  2. Zellen 24 h bei 37 °C unter 5%CO2 kultivieren.
  3. Die Zellen werden zweimal in 0,9%iger NaCl-Lösung gewaschen und in vollständigem RPMI-Medium in einer 24-Well-Platte bei 4 °C für 10 min inkubiert.
  4. Die stationäre Phase Leishmania spp. wie von A. L. Petersen22 beschrieben in einem Verhältnis von 10:1 (Parasit:Wirtszelle) zugeben und dann bei 720 × g für 10 min unter 4 °C zentrifugieren.
  5. Zellen bei 4 °C für 5 min inkubieren.
  6. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 0,9% NaCl-Lösung, um nicht internalisierte Promastigoten zu entfernen.
  7. Inkubieren Sie die Zellen in ergänztem RPMI-Medium bei 37 °C für 1 h.
  8. Fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 15 min.
  9. Montieren Sie Deckgläser mit bevorzugten Montagemedien.
  10. Zählen Sie nicht weniger als 400 Zellen in zufälligen Feldern unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem 100×/1,4-Objektiv.

5. Bewertung der Leishmanien-induzierten Vakuolenreifung

HINWEIS: Die THP-1-Zelltransfektion sollte wie von M. B. Maess, B. Wittig und S. Lorkowski 23 beschrieben durchgeführt werden. Hier fassen wir dieses Protokoll mit minimalen Änderungen zusammen. Nukleofektion ist eine spezifische Transfektionsmethode, die einen Nukleofector erfordert. Als alternative Methode können Zellen mit Lipofectamin24 und Lentivirus-Transduktion25 transfiziert werden.

  1. Um die Biogenese von Leishmania-induzierter PV zu untersuchen, transfizieren THP1-Zellen mit PLC 26,27, Akt 26,27, Rab 5 28,29,30 oder Rab 728,29,31 Plasmiden.
    HINWEIS: Diese Methode kann verwendet werden, um THP-1-Zellen mit anderen Genen als den oben aufgeführten zu transfizieren.
  2. Seed THP-1 Zellen an 1,5 x 107 in 75 cm² Gewebekulturkolben mit 10 mL vollständigem RPMI-Medium, ergänzt mit 100 ng/mL PMA und 50 μM 2-Mercaptoethanol für 48 h.
  3. Die Zellen einmal in 0,9%iger NaCl-Lösung waschen.
  4. Zellen mit einer nicht-enzymatischen Zelldissoziationslösung lösen und 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren (250 × g).
  5. Resuspendieren Sie THP-1-Zellen in 1 ml RPMI-Medium und führen Sie Zählungen in einer Neubauer-Kammer durch.
  6. THP-1-Zellen erneut bei 250 × g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand.
  7. Resuspendieren Sie 2 × 106 Zellen in 100 μL Nucleofector-Lösung und inkubieren Sie mit 0,5 μg des Plasmids, das für das interessierende Protein kodiert, markiert mit einem fluoreszierenden Protein.
  8. Die Suspension, die THP-1-Zellen und Nukleinsäure enthält, wird in die Nucleofector-Küvette überführt.
  9. Transfizieren Sie THP1-Zellen mit dem Nucleofector-Programm Y-001.
  10. Gewinnung der transfizierten Zellen (2x106) und Aussaat in 500 μL RPMI-Medium auf 24-Well-Platten mit 13 mm Glasdeckgläsern (4 Wells/Transfektion).
  11. Inkubieren Sie THP-1-Zellen in vollständigem RPMI-Medium bei 37 °C für 0,5, 2, 4, 6, 12 und 24 h.
  12. Wiederholen Sie die Schritte 3.13 und 3.13.

6. Bewertung der Rekrutierung von LC3 für Leishmania spp. PVs

HINWEIS: Der autophagische Membranmarker LC3 kann verwendet werden, um zu untersuchen, ob Phagosomen autophagische Merkmale aufweisen. Die LC3-Rekrutierung zu Leishmanien-induzierten PVs kann während der Infektion durch Immunmarkierung von Zellen mit dem Anti-LC3-Antikörper beurteilt werden, wie zuvor von C. Matte 32 und B. R. S. Dias 33 beschrieben.

  1. Seed 2 × 105 THP-1 Zellen oder humane Monozyten-abgeleitete Makrophagen in 500 μL komplettes RPMI-Medium auf einer 24-Well-Platte mit 13 mm Glasdeckgläsern.
  2. Zellen 24 h bei 37 °C unter 5%CO2 kultivieren.
  3. Die Zellen zweimal in 0,9% NaCl-Lösung waschen und in vollständigem RPMI-Medium inkubieren.
  4. Fügen Sie stationäre Phase Leishmania spp. promastigotes wie von A. L. Petersen22 beschrieben im Verhältnis 10:1 (Parasit: Wirtszellen) und Zentrifugenzellen bei 720 × g für 5 min unter 4 °C hinzu.
  5. Bei 37 °C für 30 min oder 4 h inkubieren. Dann waschen Sie zweimal und fixieren Sie die Zellen, um die LC3-Rekrutierung auf Leishmanien-induzierte PV-Membranen in den frühen Stadien der Infektion zu bewerten.
    1. Alternativ, um LC3-Rekrutierung zu PV-Membranen in späteren Stadien der Infektion zu beurteilen, waschen Sie zweimal eine andere Makrophagengruppe nach 4 Stunden der Infektion, um alle nicht internalisierten Promastigoten zu entfernen. Inkubieren Sie infizierte Zellen in vollständigem RPMI-Medium für weitere 12 h und 24 h, um schließlich zweimal zu waschen und zu fixieren.
      HINWEIS: Festsitzende Zellen können bis zur Etikettierung in PBS oder 0,9% NaCl-Lösung bei 4 °C aufbewahrt werden.
  6. Gleichzeitig blockieren und permeabilisieren Sie die fixierten Zellen in 0,1% Triton X-100, 1% BSA, 20% normalem Ziegenserum, 6% fettfreier Trockenmilch und 50% FBS für 20 min bei Raumtemperatur.
  7. Inkubieren Sie die Zellen mit Anti-LC3-Antikörper (1: 200), verdünnt in PBS für 2 h bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Als Negativkontrolle der Immunfärbung sollte eine Gruppe von Zellen mit Immunglobulin G (IgG) aus dem Tier primären Antikörperursprungs in einer Konzentration inkubiert werden, die der für den primären Antikörper verwendeten entspricht.
  8. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 0,9% iger NaCl-Lösung bei Raumtemperatur.
  9. Inkubieren Sie die Zellen mit AlexaFluor 488-konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (1:500) oder den bevorzugten fluoreszierenden Farbstoff-konjugierten sekundären Antikörpern für 1 h bei Raumtemperatur.
  10. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 0,9% iger NaCl-Lösung bei Raumtemperatur.
  11. Montieren Sie Deckgläser mit bevorzugten Montagemedien.
  12. Nehmen Sie Bilder mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop mit einem 63x/1,4-Objektiv auf.

7. Konfokalmikroskopische Erfassung und Fidschi-Quantifizierung

HINWEIS: Die Aufnahme von Immunfluoreszenzbildern sollte mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop durchgeführt werden. Um eine bessere Auflösung zu erreichen, verwenden Sie ein Ölimmersionsobjektiv mit 63-fachem Objektiv.

  1. Lassen Sie die 13 mm Glasdeckgläser bei Raumtemperatur stehen und schützen Sie sie mindestens 30 min vor der Aufnahme vor dem Licht.
  2. Reinigen Sie die Deckgläser mit einem saugfähigen Tuch.
  3. Fügen Sie einen Tropfen Tauchöl zum Objektiv hinzu und fügen Sie den Objektträger hinzu.
  4. Bewegen Sie das Objektiv nach oben, bis das Öl den Objektträger berührt.
  5. Beobachten und justieren Sie den Fokus am Mikroskop und wählen Sie die Option 63x Objektiv mit Öl.
  6. Öffnen Sie das Leica Programm und stellen Sie die Laser in den Wellenlängen 488, 552 und 405 ein.
  7. Wählen Sie die Bildauflösung 1.024 x 1.024.
  8. Klicken Sie auf die Schaltfläche Live , stellen Sie den Z-Stack ein und drücken Sie die Option Begin . Wiederholen Sie dann den Vorgang und drücken Sie die Taste Beenden . Wir empfehlen 20 μm für die Schichtdicke, um konfokale Bilder mit guten Auflösungen zu erhalten.
  9. Warten Sie auf die Bildaufnahme und wählen Sie dann in den Leica Werkzeugen die Option "Maximale Projektion".
  10. Speichern Sie das Experiment.
  11. Exportieren Sie die Bilder im LIF- oder TIFF-Format auf einen Computer und öffnen Sie das FIJI-Programm.
  12. Öffnen Sie das Experiment, und legen Sie den Ansichtsstapel mit dem Hyperstapel fest. Wählen Sie dann Dateien einzeln öffnen aus und fügen Sie Kacheln zusammen.
  13. Wählen Sie das Freihandwerkzeug in der Fidschi-Symbolleiste aus und zeichnen Sie die Zelle sorgfältig von Hand nach.
  14. Drücken Sie die Schaltfläche Analyze (Analysieren ) und messen Sie, um die Fluoreszenzintensität zu visualisieren.
  15. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Zelle pro Gruppe.
  16. Speichern Sie die Messungen und exportieren Sie sie in einen Tabellenkalkulationseditor.
  17. Fügen Sie diese Daten einem statistischen Analyseprogramm hinzu und führen Sie die statistische Analyse durch.

8. Statistische Auswertung

HINWEIS: Verwenden Sie für Datenanalysen und Grafiken ein statistisches Analyseprogramm.

  1. Öffnen Sie das Programm.
  2. Fügen Sie die erhaltenen Daten ein und testen Sie die Normalitätsparameter.
  3. Verwenden Sie für Daten mit Normalverteilung den Student-t-Test und für nichtparametrische Tests den Mann-Whitney-Test.
  4. Betrachten Sie Daten mit einem statistisch signifikanten Unterschied, wenn der p-Wert kleiner als 0,05 ist.
  5. Bereiten Sie Grafiken vor, die die Daten darstellen, mit zentralen Tendenzmessungen (Mittelwert oder Median) und Variationsmaßen.

Ergebnisse

Dieser Bericht zielt darauf ab, die frühen Ereignisse zu bewerten, die während der Phagozytose von L. braziliensis auftreten, die von Patienten mit L. braziliensis-LCL- oder L. braziliensis-DL-Form von CL isoliert wurden. Mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie untersuchten wir die wichtigsten Ereignisse, die mit der Phagozytose von Parasiten verbunden sind: Bindung, Internalisierung und Phagosomenreifung. Wir untersuchten zuerst die L. braziliensis-LCL- oder L. braziliensis-DL-Bindung ...

Diskussion

Leishmanien-Makrophagen-Interaktion ist ein komplexer Prozess und umfasst mehrere Schritte, die die Krankheitsentwicklung beeinflussen können5. Um die Mechanismen der Interaktion von nicht opsonisierten Leishmanien und Wirtszellen besser zu verstehen, haben wir ein Protokoll beschrieben, das konfokale Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Phagozytose vom frühen bis zum späten Stadium der Leishmanien-Infektion zu beurteilen. Die Verwendung von Fluoreszenztechniken m...

Offenlegungen

Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung oder -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts. Die Autoren erklären, dass die Forschung ohne kommerzielle oder finanzielle Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Danksagungen

Wir danken dem Gonçalo Moniz Institut, Fiocruz Bahia, Brasilien und der Abteilung für Mikroskopie für ihre Unterstützung. Diese Arbeit wurde von INOVA-FIOCRUZ Nummer 79700287000 unterstützt, P.S.T.V. hält einen Zuschuss für Produktivität in der Forschung von CNPq (305235/2019-2). Plasmide wurden freundlicherweise von Mauricio Terebiznik, University of Toronto, CA, zur Verfügung gestellt. Die Autoren danken Andris K. Walter für die Überarbeitung der englischen Sprache und die Unterstützung beim Manuskriptlektorat.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
2-mercaptoethanolThermo Fisher Scientific21985023
AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificTem varios no site
anti-LC3 antibodyNovus BiologicalsNB600-1384
Bovine serum albumin (BSA)Thermo Fisher ScientificX
CellStripperCorning25-056-CI
CellTracker Red (CMTPX) DyeThermo Fisher ScientificC34552
CentrífugaThermo Fisher Scientific
CiprofloxacinIsofarmaX
CO2 incubatorThermo Fisher ScientificX
Confocal fluorescence microscope (Leica SP8)LeicaLeica SP8
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco10270106
Fluorescence microscope (Olympus Lx73)OlympusOlympus Lx73
GentamicinGibco15750045
GlutamineThermo Fisher Scientific35050-061
HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid)GibcoX
HistopaqueSigma10771
M-CSFPeprotech300-25
NH4ClSigmaA9434
Normal goat serumSigmaNS02L
Nucleofector 2b DeviceLonzaAAB-1001
Nucleofector solutionLonzaVPA-1007
ParaformaldehydeSigma158127
PhalloidinInvitrogenA12379
Phorbol myristate acetate (PMA)SigmaP1585
Phosphate buffer solution (PBS)Thermo Fisher Scientific10010023
ProLong Gold Antifade kitLife TechnologiesP36931
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mediumGibco11875-093
SaponinThermo Fisher ScientificX
Schneider's Insect mediumSigmaS0146
Sodium bicarbonateSigmaS5761
Sodium pyruvateSigmaS8636
Triton X-100SigmaX

Referenzen

  1. Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A. Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2), 293-307 (2012).
  2. World Health Organization. Control of the leishmaniases. World Health Organization Technical Report Series. (949), 1 (2010).
  3. Alexander, J., Russell, D. G. The interaction of Leishmania species with macrophages. Advances in Parasitology. 31, 175-254 (1992).
  4. Mosser, D. M., Rosenthal, L. A. Leishmania-macrophage interactions: multiple receptors, multiple ligands and diverse cellular responses. Seminars in Cell Biology. 4 (5), 315-322 (1993).
  5. Awasthi, A., Mathur, R. K., Saha, B. Immune response to Leishmania infection. Indian Journal of Medical Research. 119 (6), 238-258 (2004).
  6. Blackwell, J. M. Role of macrophage complement and lectin-like receptors in binding Leishmania parasites to host macrophages. Immunology Letters. 11 (3-4), 227-232 (1985).
  7. Mosser, D. M., Edelson, P. J. The mouse macrophage receptor for C3bi (CR3) is a major mechanism in the phagocytosis of Leishmania promastigotes. Journal of Immunology. 135 (4), 2785-2789 (1985).
  8. Gough, P. J., Gordon, S. The role of scavenger receptors in the innate immune system. Microbes and Infection. 2 (3), 305-311 (2000).
  9. Russell, D. G., Wilhelm, H. The involvement of the major surface glycoprotein (gp63) of Leishmania promastigotes in attachment to macrophages. Journal of Immunology. 136 (7), 2613-2620 (1986).
  10. Handman, E., Goding, J. W. The Leishmania receptor for macrophages is a lipid-containing glycoconjugate. EMBO J. 4 (2), 329-336 (1985).
  11. Holm, A., Tejle, K., Magnusson, K. E., Descoteaux, A., Rasmusson, B. Leishmania donovani lipophosphoglycan causes periphagosomal actin accumulation: correlation with impaired translocation of PKCalpha and defective phagosome maturation. Cellular Microbiology. 3 (7), 439-447 (2001).
  12. Vergne, I., et al. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4033-4038 (2005).
  13. Courret, N., Lang, T., Milon, G., Antoine, J. C. Intradermal inoculations of low doses of Leishmania major and Leishmania amazonensis metacyclic promastigotes induce different immunoparasitic processes and status of protection in BALB/c mice. International Journal for Parasitology. 33 (12), 1373-1383 (2003).
  14. Gutierrez, M. G., et al. Autophagy induction favours the generation and maturation of the Coxiella-replicative vacuoles. Cellular Microbiology. 7 (7), 981-993 (2005).
  15. Dermine, J. F., Scianimanico, S., Prive, C., Descoteaux, A., Desjardins, M. Leishmania promastigotes require lipophosphoglycan to actively modulate the fusion properties of phagosomes at an early step of phagocytosis. Cellular Microbiology. 2 (2), 115-126 (2000).
  16. Desjardins, M., Descoteaux, A. Inhibition of phagolysosomal biogenesis by the Leishmania lipophosphoglycan. Journal of Experimental Medicine. 185 (12), 2061-2068 (1997).
  17. Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages. Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).
  18. Alexander, J., et al. An essential role for IL-13 in maintaining a non-healing response following Leishmania mexicana infection. European Journal of Immunology. 32 (10), 2923-2933 (2002).
  19. Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annual Review of Immunology. 17, 593-623 (1999).
  20. Olivier, M., Gregory, D. J., Forget, G. Subversion mechanisms by which Leishmania parasites can escape the host immune response: a signaling point of view. Clinical Microbiology Reviews. 18 (2), 293-305 (2005).
  21. English, D., Andersen, B. R. Single-step separation of red blood cells. Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradients of Ficoll-Hypaque. Journal of Immunology Methods. 5 (3), 249-252 (1974).
  22. Petersen, A. L., et al. 17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages. PLoS One. 7 (11), 49496 (2012).
  23. Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
  24. Berges, R., et al. End-binding 1 protein overexpression correlates with glioblastoma progression and sensitizes to Vinca-alkaloids in vitro and in vivo. Oncotarget. 5 (24), 12769-12787 (2014).
  25. Franco, L. H., et al. The Ubiquitin Ligase Smurf1 Functions in Selective Autophagy of Mycobacterium tuberculosis and Anti-tuberculous Host Defense. Cell Host & Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).
  26. Corbett-Nelson, E. F., Mason, D., Marshall, J. G., Collette, Y., Grinstein, S. Signaling-dependent immobilization of acylated proteins in the inner monolayer of the plasma membrane. Journal of Cell Biology. 174 (2), 255-265 (2006).
  27. Yeung, T., et al. Receptor activation alters inner surface potential during phagocytosis. Science. 313 (5785), 347-351 (2006).
  28. Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cellular Microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).
  29. Vieira, O. V., et al. Modulation of Rab5 and Rab7 recruitment to phagosomes by phosphatidylinositol 3-kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (7), 2501-2514 (2003).
  30. Roberts, R. L., Barbieri, M. A., Ullrich, J., Stahl, P. D. Dynamics of rab5 activation in endocytosis and phagocytosis. Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 627-632 (2000).
  31. Vitelli, R., et al. Role of the small GTPase Rab7 in the late endocytic pathway. Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4391-4397 (1997).
  32. Matte, C., et al. Leishmania major Promastigotes Evade LC3-Associated Phagocytosis through the Action of GP63. PLoS Pathogens. 12 (6), 1005690 (2016).
  33. Dias, B. R. S., et al. Autophagic Induction Greatly Enhances Leishmania major Intracellular Survival Compared to Leishmania amazonensis in CBA/j-Infected Macrophages. Frontiers in Microbiology. 9, 1890 (2018).
  34. Babcock, G. F. Quantitation of phagocytosis by confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, 319-328 (1999).
  35. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 071795 (2014).
  36. Lennartz, M. R. Phospholipases and phagocytosis: the role of phospholipid-derived second messengers in phagocytosis. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 31 (3-4), 415-430 (1999).
  37. Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G. Visualizing the Early Stages of Phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. (120), e54646 (2017).
  38. Ramarao, N., Meyer, T. F. Helicobacter pylori resists phagocytosis by macrophages: quantitative assessment by confocal microscopy and fluorescence-activated cell sorting. Infection and Immunity. 69 (4), 2604-2611 (2001).
  39. Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 131-139 (2015).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

Immunologie und InfektionAusgabe 173

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten