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Resumo

O mecanismo associado à fagocitose na infecção por Leishmania permanece mal compreendido. Aqui, descrevemos métodos para avaliar os primeiros eventos ocorridos durante a interação da Leishmania com as células hospedeiras.

Resumo

A fagocitose é um processo orquestrado que envolve etapas distintas: reconhecimento, vinculação e internalização. Faócitos profissionais tomam parasitas leishmania por fagocitose, consistindo em reconhecer ligantes em superfícies parasitas por múltiplos receptores de células hospedeiras. A ligação da Leishmania às membranas macrófagos ocorre através do receptor complementar tipo 1 (CR1) e do receptor complementar tipo 3 (CR3) e receptores de reconhecimento de padrões. Lipofosfoglicano (GLP) e 63 kDa glicoproteína (gp63) são os principais ligantes envolvidos nas interações macrófago-Leishmania. Após o reconhecimento inicial de ligantes parasitas por receptores de células hospedeiras, os parasitas se internalizam, sobrevivem e se multiplicam dentro de vacólos parasitoforosos. O processo de maturação de vacuoles induzidos por Leishmania envolve a aquisição de moléculas de vesículas intracelulares, incluindo a proteína G monomérica Rab 5 e Rab 7, proteína de membrana associada à lisesomal 1 (LAMP-1), proteína de membrana associada lysomal 2 (LAMP-2) e proteína associada a microtúbulos 1A/1B-cadeia de luz 3 (LC3).

Aqui, descrevemos métodos para avaliar os eventos precoces ocorridos durante a interação da Leishmania com as células hospedeiras utilizando microscopia confocal, incluindo (i) internalização (ii) vinculante e (iii) maturação fágora. Ao agregar ao corpo de conhecimento em torno desses determinantes do desfecho da infecção, esperamos melhorar a compreensão da patogênese da infecção por Leishmania e apoiar a eventual busca por novos alvos quimioterápicos.

Introdução

A leishmaniose é uma doença tropical negligenciada causada por parasitas protozoários do gênero Leishmania, resultando em um amplo espectro de manifestações clínicas no hospedeiro vertebrado, incluindo leishmaniose cutânea, leishmaniose mucocutânea e leishmaniose visceral1. A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que mais de um bilhão de pessoas estão em risco, com mais de um milhão de novos casos notificados por ano2.

Leishmania spp. são protozoários intracelulares obrigatórios que sobrevivem dentro de células hospedeiras, incluindo monócitos, macrófagos e células dendríticas3. A interação leishmania-macrófago é um processo complexo que envolve múltiplos receptores de células hospedeiras e ligantes parasitas, seja por interação direta ou por opssonização envolvendo receptores complementares 4,5. Receptores de superfície clássicas, como CR1, CR3, mannose-fucose, fibronectina, receptores de pedágio e carniceiro, mediam o apego do parasita aos macrófagos 6,7,8. Esses receptores reconhecem moléculas na superfície da Leishmania, incluindo a glicoproteína de 63 kDa (gp63) e lipofosfoglicano glicópide (GLP)9. Estas são as moléculas mais abundantes na superfície dos promastigotes e desempenham um papel essencial na subversão da resposta imune hospedeira, favorecendo o estabelecimento de infecção por parasitas em células mamíferas10. Depois que os ligantes da superfície parasita se ligam aos receptores de macrófago, f-actin se acumula em superfícies de células de mamíferos, circundam parasitas à medida que são fagocitados. Posteriormente, isso leva à formação de um compartimento induzido por parasitas denominado vacuole parasitoforoso (PV), que apresenta características fagolisossomais11. Uma vez dentro desses faólises, os parasitas sofrem várias alterações essenciais à sobrevivência e multiplicação3.

A biogênese dos PVs é um processo de tráfico de membrana altamente regulamentado crítico para a sobrevivência intracelular deste patógeno12. A formação deste compartimento resulta de eventos de fusão sequencial entre fágoras e compartimentos da via endocítica hospedeira. Estudos de biologia celular clássica revelaram que o amadurecimento dos PVs envolve a aquisição de proteínas G monoméricas Rab 5 e Rab 7, que estão principalmente associadas à maturação precoce e tardia, respectivamente13. Além disso, esses compartimentos adquirem proteínas de membrana associadas ao lissomo 1 e 2 (LAMP 1, LAMP 2), os principais componentes proteicos da membrana lisosômica e proteína associada a microtúbulos 1A/1B-light chain 3 (LC3), um marcador autofagossomo14. Apesar das semelhanças aparentes, a cinética da formaçãode PV 15,16 e a morfologia desses compartimentos variam dependendo da espécie Leishmania. Por exemplo, a infecção causada por L. mexicana ou L. amazonensis induz a formação de grandes compartimentos contendo um grande número de parasitas17. Em contraste, outras espécies, como L. braziliensis e L. infantum, formam vacuoles menores que normalmente contêm apenas um ou dois parasitas em cada vacuole18.

Apesar desse conhecimento em torno da interação célula hospedeira-Leishmania, os eventos iniciais desencadeados pelo contato entre receptores hospedeiros e ligantes parasitas não foram totalmente elucidados. Esses eventos são conhecidos por serem determinantes do resultado da infecção por parasitas e dependem de espécies parasitas, o tipo de receptores de células hospedeiras recrutados para reconhecer parasitas e a ativação de vias de sinalização de macrófagos19,20. Portanto, é essencial identificar as moléculas envolvidas na biogênese dos PVs induzidos pela Leishmania e determinar o papel dessas moléculas no estabelecimento e desfecho da infecção. Aqui, descrevemos um método de monitoramento dos primeiros eventos ocorridos durante a fagocitose da Leishmania, incluindo vinculação, internalização, formação de fágoras e maturação. Este trabalho poderia auxiliar no esclarecimento da participação de PLC, Akt, Rab5, Rab7 e LC3 na formação de PVs induzidos por diferentes espécies de Leishmania. É importante ressaltar que esse protocolo pode ser utilizado para investigar a participação de outras proteínas envolvidas na maturação de PV. Estudos futuros ampliarão o conhecimento em torno dos mecanismos envolvidos na interação celular hospedeira da Leishmania e contribuirão para o desenho de novas estratégias quimioterápicos.

Protocolo

As células foram obtidas de doadores saudáveis após a aprovação dos procedimentos pelos Comitês Nacionais de Ética em Pesquisa (ID: 94648218.8.0000.0040).

1. Culturas celulares

  1. Macrófagos derivados de monócitos humanos
    NOTA: Para obter macrófagos derivados do monócito humano para diferenciação in vitro em macrófagos, coletar sangue de doadores saudáveis e purificar células mononucleares de sangue periféricos (PBMC), conforme descrito por D. English e B. R. Andersen21.
    1. Depois de coletar sangue periférico (50 mL), despeje-o em um tubo heparinizado e, em seguida, dilua o sangue 1:1 em uma solução tampão de fosfato (PBS) à temperatura ambiente. Coloque suavemente sangue heparinizado diluído em cima do meio de gradiente de densidade previamente distribuído.
    2. Centrifugar os tubos a 252 × g por 30 min a 24 °C para evitar hemólise.
      NOTA: Defina a quebra da centrífuga para evitar a mistura de camadas gradientes. Após a centrifugação, camadas de gradiente descontínuo são formadas da parte inferior ao topo: eritrócitos, gradiente de densidade, anel PBMC e plasma.
    3. Transfira o anel PBMC, localizado entre as camadas de gradiente de densidade e plasma, para um novo tubo e encha com PBS para lavar o meio gradiente de densidade em excesso.
    4. Lave as células uma vez e centrífugas a 190 × g por 10 min a 4 °C.
    5. Descarte a pelota supernasce e resuspend em 1 mL de meio RPMI completo.
    6. Conte as células e a placa 2 × 106 células em 500 mL do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementadas com 25 mM N-[2-hidroxitil] piperazina-N′-[2-ácido sulfônico de etano] (HEPES), 2 g/L bicarbonato de sódio, 2 mM de glutamina, 20 g/mL ciprofloxacina e 10% de soro bovino fetal inativado (FBS) (meio RPMI completo) por 7 dias a 37 °C sob 5% de CO2 em uma placa de 24 poços para permitir que os monócitos se diferenciem em macrófagos por adesão.
  2. Culturas THP-1
    1. Cresça a linha celular THP-1 a uma concentração de 2 × 105 células em 10 mL de meio RPMI completo em frasco de cultura de 75 cm2 .
    2. Manter culturas celulares em uma incubadora a 37 °C abaixo de 5% de CO2 por 7 dias.
    3. As células centrífugas a 720 × g por 10 min a 4 °C e resuspensam a pelota em meio RPMI completo.
    4. Conte células em uma câmara de Neubauer.
    5. Células de placa em tampas de vidro de 13 mm a uma concentração de 2 × 105 células por poço em 500 μL de meio RPMI completo contendo 100 nM de acetato de myristato phorbol (PMA) a 37 °C sob 5% CO2 para permitir a diferenciação de células THP1 em macrófagos.
    6. Após três dias, lave duas células com solução de 0,9% NaCl para remover o meio contendo PMA.
    7. Incubar células THP-1 diferenciadas no meio RPMI completo livre de PMA a 37 °C abaixo de 5% de CO2 por mais 2 dias antes de iniciar a experimentação.

2. Culturas de parasitas e coloração de celltracker vermelho

NOTA: Para visualizar parasitas através da microscopia de fluorescência, realize a coloração usando corante fluorescente CellTracker Red (CMTPX). Alternativamente, outros marcadores, incluindo carboxyfluoresceína podem ser usados de acordo com as instruções do fabricante ou promastigotes expressando com constitutivamente GFP, RFP ou outros genes de repórter fluorescentes. Parasitas usados para infectar células são aqueles em fase estacionária de crescimento obtida a partir de uma cultura axenic promastigote de no máximo 7 passagens.

  1. Cresça Leishmania spp. promastigotes a 1 x 105 parasitas por 1.000 μL de meio em um frasco de cultura celular contendo 5 mL do médio de Schneider suplementado com 50 μg/mL gentamicin e 10% FBS.
  2. Depois de incubar culturas axenicaes parasitas em uma demanda bioquímica de oxigênio (B.O.D.) a 24 °C, realize a contagem diária em uma câmara de Neubauer. Verifique se há forma de parasita (fina, alongada) e mobilidade por 5 dias. Os parasitas são considerados em fase estacionária de crescimento quando duas contagens consecutivas com 8 horas de intervalo exibem quantidades semelhantes.
  3. Ao chegar à fase estacionária de crescimento, incubar os parasitas em 4 mL de solução NaCl de 0,9% com CMTPX de 1 μM por 15 min a 37 °C sob 5% de CO2 evitando contato com a luz.
  4. Adicione FBS a uma proporção de 1:1 e incubar a suspensão do parasita por mais 1 min.
  5. Lavagem de parasitas três vezes com PBS, seguido de centrifugação a 1.781 × g por 10 min.
  6. Ressuspend pelotas parasitas em 1.000 μL de meio completo RPMI.
  7. Conte parasitas em uma câmara de Neubauer.

3. Avaliação da leishmania vincula-se aos macrófagos

  1. Semente 2 × 10células THP-1 ou macrófagos derivados de monócito humano em 500 μL de meio RPMI completo por poço em uma placa de 24 poços com tampas de vidro de 13 mm.
  2. Cultivar células a 37 °C sob 5% de CO2 por 24 h.
  3. Lave as células duas vezes com solução naCl de 0,9% e incubar em meio RPMI completo a 4 °C por 10 min.
  4. Adicione promastigotes de fase estacionária como descrito por A. L. Petersen22 em uma proporção de 10:1 para placas de poço, e depois centrífuga a 720 × g por 5 min abaixo de 4 °C.
  5. Incubar a 4 °C por 5 min.
  6. Lave as células duas vezes com solução naCl de 0,9% para remover quaisquer promastigotes não internalizados.
  7. Fixar as células em 4% de paraformaldeído por 15 minutos à temperatura ambiente.
  8. Incubar as tampas com 15 mM NH4Cl por 15 min a temperatura ambiente.
  9. Lave três vezes com PBS 0,15% de albumina de soro bovino (BSA). Incubar com solução de bloqueio (3% BSA em PBS) por 1h à temperatura ambiente.
  10. Lave três vezes com PBS e depois permeabilize com 0,15% pbs-saponina por 15 min a temperatura ambiente.
  11. Adicione a falooidina (diluída 1:1.200) por 1h à temperatura ambiente e proteja-se contra a luz.
  12. Montagem de tampas usando mídia de montagem.
  13. Adquira imagens através de um microscópio de fluorescência confocal usando um objetivo de 63×/1.4.

4. Avaliação da fagocitose de Leishmania por macrófagos

  1. Semente 2 × 10células THP-1 ou macrófagos derivados de monócito humano em 500 μL de meio RPMI completo por poço em uma placa de 24 poços com tampas de vidro de 13 mm.
  2. Cultivar células por 24 h a 37 °C abaixo de 5% de CO2.
  3. Lave as células duas vezes em solução naCl de 0,9% e incuba em meio RPMI completo em placa de 24 poços a 4 °C por 10 min.
  4. Adicione a fase estacionária Leishmania spp. como descrito por A. L. Petersen22 em uma proporção de 10:1 (parasita:célula hospedeira) e, em seguida, centrífuga a 720 × g por 10 min abaixo de 4 °C.
  5. Incubar células a 4 °C por 5 min.
  6. Lave as células duas vezes com solução naCl de 0,9% para remover quaisquer promastigotes não internalizados.
  7. Incubar as células em meio RPMI suplementado a 37 °C por 1 h.
  8. Conserte as células com 4% de paraformaldeído por 15 minutos.
  9. Montagem de tampas usando mídia de montagem preferida.
  10. Conte nada menos que 400 células em campos aleatórios sob um microscópio de fluorescência usando um objetivo de 100×/1.4.

5. Avaliação da maturação de vacuole induzida por Leishmania

NOTA: A transfecção celular THP-1 deve ser realizada conforme descrito por M. B. Maess, B. Wittig e S. Lorkowski 23. Aqui resumimos este protocolo, com modificações mínimas. Nucleofection é um método específico de transfecção que requer um nucleofector. Como método alternativo, as células podem ser transfeminadas usando lipofectamina24 e transdução de lentivírus25.

  1. Para investigar a biogênese de Pv induzido pela Leishmania, transfectam células THP1 com PLC26,27, Akt26,27, Rab 5 28,29,30 ou Rab 7 28,29,31 plasmids.
    NOTA: Esta metodologia pode ser usada para transfetar células THP-1 com outros genes do que os listados acima.
  2. Células seed THP-1 a 1,5 x 107 em 75 cm² frascos de cultura tecidual contendo 10 mL meio RPMI completo suplementado com 100 ng/mL PMA e 50 μM 2-mercaptoetanol por 48 h.
  3. Lave células uma vez em solução de 0,9% NaCl.
  4. Desapegue células usando uma solução de dissociação celular não enzimática e centrífuga (250 × g) por 5 minutos à temperatura ambiente.
  5. Resuspend células THP-1 em 1 mL de meio RPMI e conta em uma câmara de Neubauer.
  6. Centrífuga células THP-1 novamente a 250 × g por 10 minutos à temperatura ambiente. Descarte o supernatante.
  7. Resuspende 2 × 106 células em 100 μL de solução nucleofectora e incubar com 0,5 μg da codificação plasmida para a proteína de interesse, marcada com uma proteína fluorescente.
  8. Transfira a suspensão contendo células THP-1 e ácido nucleico para o cuvette nucleofectador.
  9. Células Transfect THP1 usando o Programa Nucleofector Y-001.
  10. Recupere as células transfeinadas (2x106) e a semente em meio RPMI de 500 μL em placas de 24 poços com tampas de vidro de 13 mm (4 poços/transfecção).
  11. Incubar células THP-1 em meio RPMI completo a 37 °C para 0,5, 2, 4, 6, 12 e 24 h.
  12. Repita as etapas 3.13 e 3.13.

6. Avaliação do recrutamento de LC3 para Leishmania spp. PVs

NOTA: O marcador de membrana autofágica LC3 pode ser usado para investigar se os faósias apresentam características autofágicas. O recrutamento LC3 para PVs induzidos por Leishmania pode ser avaliado durante a infecção por células imunolabelling com o anticorpo anti-LC3, como descrito anteriormente por C. Matte32 e B. R. S. Dias33.

  1. Semente 2 × 10células THP-1 ou macrófagos derivados de monócitos humanos em 500 μL meio RPMI completo em uma placa de 24 poços com tampas de vidro de 13 mm.
  2. Cultivar células por 24 h a 37 °C abaixo de 5% de CO2.
  3. Lave as células duas vezes em solução NaCl de 0,9% e incuba em meio RPMI completo.
  4. Adicione a fase estacionária Leishmania spp. promastigotes como descrito por A. L. Petersen22 em uma proporção de 10:1 (parasita: células hospedeiras) e células centrífugas a 720 × g por 5 min abaixo de 4 °C.
  5. Incubar a 37 °C por 30 min ou 4 h. Em seguida, lave duas vezes e fixe as células para avaliar o recrutamento LC3 para membranas fotovoltaicas induzidas pela Leishmania nos estágios iniciais da infecção.
    1. Alternativamente, para avaliar o recrutamento de LC3 para membranas FOTO EM estágios posteriores de infecção, lave duas vezes outro grupo de macrófagos a 4h de infecção para remover quaisquer promastigotes não internalizados. Incubar células infectadas em meio RPMI completo por mais 12 h e 24 horas, para finalmente lavar duas vezes e corrigir.
      NOTA: As células fixas podem ser mantidas em solução PBS ou 0,9% NaCl a 4 °C até a rotulagem.
  6. Bloqueie e permeabilize simultaneamente as células fixas em 0,1% Triton X-100, 1% BSA, 20% soro normal de cabra, 6% leite seco sem gordura e 50% FBS por 20 minutos em temperatura ambiente.
  7. Incubar as células com anticorpo anti-LC3 (1: 200) diluído em PBS por 2 h à temperatura ambiente.
    NOTA: Como controle negativo da imunostaining, um grupo de células deve ser incubado com imunoglobulina G (IgG) do animal de origem primária de anticorpos em uma concentração equivalente à usada para o anticorpo primário.
  8. Lave as células três vezes com solução de 0,9% NaCl à temperatura ambiente.
  9. Incubar as células com AlexaFluor 488-conjugado anti-coelho IgG (1:500) ou os anticorpos secundários conjugados de cor fluorescente preferidos por 1 h à temperatura ambiente.
  10. Lave as células três vezes com solução de 0,9% NaCl à temperatura ambiente.
  11. Montagem de tampas usando mídia de montagem preferida.
  12. Adquira imagens através de microscópio de fluorescência confocal usando um objetivo 63x/1.4.

7. Aquisição de microscopia confocal e quantificação de Fiji

NOTA: A aquisição de imagens de imunofluorescência deve ser realizada usando um microscópio de varredura a laser confocal. Para obter uma melhor resolução, use uma lente objetiva de imersão a óleo 63x.

  1. Deixe as tampas de vidro de 13 mm à temperatura ambiente e proteja-as da luz pelo menos 30 minutos antes da aquisição.
  2. Limpe as tampas com um tecido absorvente.
  3. Adicione uma gota de óleo de imersão ao objetivo e adicione o slide.
  4. Mova o objetivo até que o óleo toque o escorregador.
  5. Observe e ajuste o foco no microscópio e escolha a opção 63x objetivo com óleo.
  6. Abra o programa Leica e ajuste os lasers nos comprimentos de onda 488, 552 e 405.
  7. Selecione a resolução de imagem 1.024 x 1.024.
  8. Clique no botão Viver , defina a pilha Z e pressione a opção Iniciar. Em seguida, faça de novo e pressione o botão End . Recomendamos 20 μm para espessura de fatia para obter imagens confocal com boas resoluções.
  9. Aguarde a aquisição da imagem e selecione a opção "Projeção Máxima" nas ferramentas Leica.
  10. Guarde a experiência.
  11. Exporte as imagens do formato lif ou tiff para um computador e abra o programa FIJI.
  12. Abra o experimento e defina a pilha de visualizações com a pilha de hipercompramento. Em seguida, selecione arquivos abertos individualmente e costurá as telhas.
  13. Selecione a ferramenta mãos livres na barra de ferramentas fiji e trace a célula cuidadosamente manualmente.
  14. Pressione o botão Analisar e meça para visualizar a intensidade da fluorescência.
  15. Repita este processo para cada célula por grupo.
  16. Salve as medidas e exporte-as para um editor de planilhas.
  17. Adicione esses dados a um programa de análise estatística e faça a análise estatística.

8. Análise estatística

NOTA: Para análise de dados e gráficos, utilize um programa de análise estatística.

  1. Abra o programa.
  2. Insira os dados obtidos e teste os parâmetros de normalidade.
  3. Para dados com distribuição normal, use o teste T do Student e para testes não paramétricos, teste Mann-Whitney.
  4. Considere dados com uma diferença estatisticamente significativa quando o valor p for inferior a 0,05.
  5. Elaborar gráficos representando os dados, com medidas de tendência central (média ou mediana) e medidas de variação.

Resultados

Este relatório tem como objetivo avaliar os primeiros eventos ocorridos durante a fagocitose de L. braziliensis isolados de pacientes que apresentam L. braziliensis-LCL ou L. braziliensis-DL forma de CL. Utilizando microscopia confocal, foram investigados os principais eventos associados à fagocitose dos parasitas: vinculação, internalização e maturação fleuomol. Primeiro avaliamos a ligação L. braziliensis-LCL ou L. braziliensis-DL por macrófagos derivados de monó...

Discussão

A interação leishmania-macrófago é um processo complexo e envolve várias etapas que podem influenciar o desenvolvimento da doença5. Para entender melhor os mecanismos envolvidos na interação da Leishmania nãoopsonizada e das células hospedeiras, descrevemos um protocolo que emprega microscopia de fluorescência confocal para avaliar a fagocitose desde os estágios iniciais até os estágios finais da infecção por Leishmania . O uso de técnicas de fluorescên...

Divulgações

Os financiadores não tiveram papel na concepção do estudo, coleta ou análise de dados, na decisão de publicar ou na elaboração do manuscrito. Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Agradecimentos

Agradecemos ao Instituto Gonçalo Moniz, à Fiocruz Bahia, ao Brasil e ao departamento de microscopia pela assistência. Este trabalho foi apoiado pelo número INOVA-FIOCRUZ 79700287000, P.S.T.V. detém uma bolsa de produtividade em pesquisa do CNPq (305235/2019-2). Plasmids foram gentilmente fornecidos por Mauricio Terebiznik, Universidade de Toronto, CA. Os autores gostariam de agradecer a Andris K. Walter pela revisão da língua inglesa e assistência de cópia do manuscrito.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
2-mercaptoethanolThermo Fisher Scientific21985023
AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificTem varios no site
anti-LC3 antibodyNovus BiologicalsNB600-1384
Bovine serum albumin (BSA)Thermo Fisher ScientificX
CellStripperCorning25-056-CI
CellTracker Red (CMTPX) DyeThermo Fisher ScientificC34552
CentrífugaThermo Fisher Scientific
CiprofloxacinIsofarmaX
CO2 incubatorThermo Fisher ScientificX
Confocal fluorescence microscope (Leica SP8)LeicaLeica SP8
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco10270106
Fluorescence microscope (Olympus Lx73)OlympusOlympus Lx73
GentamicinGibco15750045
GlutamineThermo Fisher Scientific35050-061
HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid)GibcoX
HistopaqueSigma10771
M-CSFPeprotech300-25
NH4ClSigmaA9434
Normal goat serumSigmaNS02L
Nucleofector 2b DeviceLonzaAAB-1001
Nucleofector solutionLonzaVPA-1007
ParaformaldehydeSigma158127
PhalloidinInvitrogenA12379
Phorbol myristate acetate (PMA)SigmaP1585
Phosphate buffer solution (PBS)Thermo Fisher Scientific10010023
ProLong Gold Antifade kitLife TechnologiesP36931
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mediumGibco11875-093
SaponinThermo Fisher ScientificX
Schneider's Insect mediumSigmaS0146
Sodium bicarbonateSigmaS5761
Sodium pyruvateSigmaS8636
Triton X-100SigmaX

Referências

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