في سيتو استكشاف مورين ميغاكاريوبويز باستخدام المجهر الإلكتروني انتقال

Summary

هنا، نقدم بروتوكولا لتحليل البنية الفوقية للخلايا العملاقة في الموقع باستخدام المجهر الإلكتروني الإرسال (TEM). يتم جمع نخاع عظم مورين، ثابتة، جزءا لا يتجزأ من راتنج الايبوكسي وقطع في أقسام ultrathin. بعد تلطيخ التباين ، لوحظ نخاع العظم تحت مجهر TEM عند 120 كيلو فولت.

Abstract

يحدث التمايز ونضوج الخلايا الضخمة في ارتباط وثيق مع المكونات الخلوية وخارج الخلية لنخاع العظام. وتتميز هذه العمليات بالمظهر التدريجي للهياكل الأساسية في السيتوبلازم megakaryocyte مثل نواة متعددة الأضلاع وتعدد الأضلاع، وشبكة غشاء داخلي تسمى نظام غشاء الترسيم (DMS) وحبيبات كثيفة وألفا التي سيتم العثور عليها في الصفائح الدموية المتداولة. في هذه المقالة، نقوم بوصف بروتوكول موحد للدراسة فوق الهيكلية في الموقع لخلايا مورين الضخمة باستخدام المجهر الإلكتروني الإرسال (TEM)، مما يسمح بتحديد الخصائص الرئيسية التي تحدد مرحلة نضجها وكثافتها الخلوية في نخاع العظام. يتم مسح نخاع العظم، ثابتة، المجففة في الإيثانول، جزءا لا يتجزأ من الراتنج البلاستيك، وشنت لتوليد المقاطع العرضية. يتم إعداد أقسام شبه رقيقة ورقيقة لملاحظات الهسهولوجية وTEM، على التوالي. يمكن استخدام هذه الطريقة لأي خلية نخاع العظم، في أي مرفق EM ولها ميزة استخدام أحجام عينة صغيرة مما يسمح لمزيج من عدة نهج التصوير على نفس الماوس.

Introduction

Megakaryocytes هي خلايا متعددة الأضلاع كبيرة متخصصة ، مترجمة في نخاع العظام ، مسؤولة عن إنتاج الصفائح الدموية¹. أنها تنشأ من الخلايا الجذعية الدموية من خلال عملية نضوج معقدة، خلالها السلائف megakaryocyte زيادة تدريجيا في الحجم، في حين تمر تغييرات مورفولوجية المصاحبة واسعة النطاق في السيتوبلازم والنواة². أثناء النضج ، تطور الخلايا الضخمة عددا من العناصر الهيكلية المميزة بما في ذلك: نواة متعددة الأضلاع ، وثقب الغشاء السطحي الذي يشكل نظام غشاء الترسيم (DMS) ، ومنطقة محيطية خالية من العضيات محاطة بالشبكة الخلوية القائمة على actin ، والعديد من العضيات بما في ذلك حبيبات α ، والحبيبات الكثيفة ، والليسوسومات ، والعديد من مجمعات غولجي. على مستوى البنية الفائقة ، لوحظ تعديل كبير هو تقسيم السيتوبلازمية إلى مناطق منفصلة محددة بواسطة DMS³. هذا العرض الواسع من الأغشية سوف يغذي تمديد العمليات السيتوبلازمية الطويلة في المرحلة الأولية من إنتاج الصفائح الدموية ، والتي إعادة تشكيلها بعد ذلك إلى الصفائح الدموية داخل الدورة الدموية. أي عيب أثناء التمايز megakaryocyte والنضج يمكن أن تؤثر على إنتاج الصفائح الدموية من حيث عدد الصفائح الدموية و / أو وظيفة الصفائح الدموية.

طبقة رقيقة انتقال المجهر الإلكتروني (TEM) وقد تم نهج التصوير المفضل لعقود توفير ultrastructure عالية الجودة من megakaryocytes التي شكلت فهمنا لعلم وظائف الأعضاء من خثار^4،5. تركز هذه الورقة على طريقة TEM موحدة تسمح بالتقاط عملية التكوين الحيوي للصفائح الدموية التي تحدث في الموقع داخل البيئة الدقيقة لنخاع العظم الأصلي ، والتي يمكن أن تكون أيضا بمثابة أساس لتحليل أي نوع من خلايا نخاع العظم. نحن نقدم أمثلة فائقة البنية لتطوير الخلايا الضخمة من غير ناضجة إلى ناضجة تماما ، والتي تمتد العمليات السيتوبلازمية في دوران الأوعية الدقيقة من الجيوب^{الأنفية 6}. كما نقوم بوصف إجراء سهل لقياس مراحل نضوج الخلايا الضخمة المختلفة، مع إرشادك إلى قدرة إنتاج التجدد والصفائح الدموية لنخاع العظم.

Protocol

وأجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمعايير الأوروبية 2010/63/EU ولجنة CREMEAS المعنية بأخلاقيات التجارب على الحيوانات التابعة لجامعة ستراسبورغ (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). يتم عرض البروتوكول تخطيطيا في الشكل 1.

1. جمع نخاع العظم والتثبيت ( الشكل 1A)

تنبيه: يشمل هذا الإجراء المواد المسببة للسرطان، والطفرات، و/أو السامة، ويتم تنفيذه تحت غطاء للاستخراج الكيميائي. ارتداء معدات الحماية المناسبة مثل القفازات والنظارات الحماية.

1. إعداد الحل التثبيتي الذي يتكون من 2.5٪ غلوتارارالدهيد في المخزن المؤقت cacodylate (انظر الملف التكميلي).
2. جمع نخاع العظم
   1. استخدام الفئران C57BL/6 الكبار من أي من الجنسين 12-18 أسابيع من العمر. قتل الفئران عن طريق اختناق_ثاني أكسيد الكربون وخلع عنق الرحم.
   2. مع زوج من مقص رقيقة، وقطع الجلد حول الفخذ واستخدام ملاقط لتقشير الجلد قبالة. إزالة أقصى مخلب ثم قطع بين الورك والفخذ. فصل الساق من عظم الفخذ عن طريق قطع في مفصلية الركبة وإزالة الأنسجة الملتصقة على الساق وعظم الفخذ باستخدام مشرط.
   3. إزالة epiphyses مع شفرة حلاقة حادة. أثناء الإمساك بعظم الفخذ بالملاقط، استخدم حقنة سعة 5 مل مليئة بحاجز cacodylate مع إبرة 21 G لغسل نخاع العظم في أنبوب 15 مل مملوء بحاجز كاكوديلات 2 مل. للقيام بذلك، أدخل شطبة الإبرة في فتحة نخاع العظم واضغط ببطء على المكبس حتى يتم طرد النخاع.
3. تثبيت نخاع العظم عن طريق الغمر السريع في التثبيت.
   1. مباشرة بعد التنظيف، استخدم ماصة بلاستيكية لنقل أسطوانة نخاع العظم إلى 1 مل من محلول تثبيت الغلوتاراالدهيد الطازج (الذي تم إعداده سابقا في 1.1) لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: للحفاظ على الأنسجة، تأكد من اكتمال العملية بأكملها، من تشريح العظام إلى خطوة التثبيت، في أقل من 10 دقائق. لتثبيت, تأكد من أن الحل التثبيت في درجة حرارة الغرفة لتجنب صدمة الحرارة.

2. تضمين نخاع العظم في الآغروز

ملاحظة: أنسجة النخاع ليست متماسكة بما فيه الكفاية للحفاظ على سلامتها خلال خطوات الغسيل المختلفة ويمكن بسهولة فقدان المواد. للتغلب على هذه المشكلة ، يتم تغطية النخاع في هلام من أجار قبل الجفاف.

1. إعداد الحل agarose كما هو موضح في الملف التكميلي.
2. غسل النخاع الثابت من القسم 1.3 في العازلة cacodylate ونقله بعناية إلى شريحة زجاجية باستخدام ماصة بلاستيكية. باستخدام ماصة دافئة، وتطبيق بسرعة قطرة من 2٪ أجار السائل إلى اسطوانة نخاع العظام.
   ملاحظة: أجار يقوي بسرعة أثناء التبريد. لضمان تغطية متجانسة لنخاع العظام ، يجب الحفاظ على محلول أجار دافئا حتى يتم إيداعه على الشريحة.
3. بسرعة وضع الشريحة بسرعة على الجليد حتى يتماسك أجار (1-2 دقيقة).
4. تحت المجهر، استخدم شفرة حلاقة حادة لقطع وتخلص من أطراف أسطوانة نخاع العظم بسبب ضغط الأنسجة المحتمل في هذه المناطق. نقل كتل النخاع في أنابيب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل التي تحتوي على 1 مل من العازلة cacodylate.

3. تضمين نخاع العظم في الراتنج

تنبيه: مكونات الراتنج سامة. بعضها مسرطن ويجب التعامل معها بعناية تحت غطاء محرك السيارة استخراج المواد الكيميائية. استخدام معدات الحماية المناسبة مثل القفازات ونظارات الحماية. بيروكسيد أوزميوم شديد التطاير في درجة حرارة الغرفة وأبخرته ضارة جدا للعيون والأنف والحنجرة. قبل التخلص منها، يجب تحييد 2٪ من التيتروكسيد أوسميوم بإضافة ضعف حجمها من الزيت النباتي.

1. إعداد راتنج الايبوكسي كما هو موضح في الملف التكميلي.
2. تضمين الراتنج
   ملاحظة: احتفظ بالعينات في نفس أنابيب الطرد المركزي الدقيق أثناء الحضانات في الحمامات المتعاقبة من الأوسميوم وخلات الأورانيل والإيثانول. يستنشق الناطور مع ماصة باستور. حجم الحل المستخدم لكل حمام يجب أن يساوي على الأقل 10x حجم العينة.
   1. بعد إصلاح الكتل مع 1٪ أوسميوم في العازلة cacodylate لمدة 1 ساعة في 4 درجة مئوية، وغسل مرة واحدة في العازلة cacodylate ثم مرة واحدة في الماء المقطر.
   2. وصمة عار مع خلات أورانيل 4٪ في الماء المقطر لمدة 1 ساعة، وغسل مرتين في الماء المقطر.
   3. الجفاف من خلال سلسلة متدرج من الإيثانول في الماء المقطر: 4 مرات في الإيثانول 75٪ لمدة 5 دقائق، تليها 3 مرات في الإيثانول 95٪ لمدة 20 دقيقة ثم 3 مرات في الإيثانول 100٪ لمدة 20 دقيقة. في هذه الخطوة، خذ حقنة واحدة من راتنج الايبوكسي من الثلاجة.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة ساعة واحدة.
   4. للحصول على تسلل موحد وبلمرة من راتنج الايبوكسي داخل النخاع، واحتضان أول كتل في 2 حمامات متتالية من أكسيد البروبيلين لمدة 15 دقيقة.
   5. إضافة خليط 1:1 من أكسيد البروبيلين 100٪ والراتنج الايبوكسي واحتضان لمدة 1 ساعة. ضع العينات على شاكر دوار بطيء في درجة حرارة الغرفة.
   6. إضافة 100٪ راتنج الايبوكسي ترك العينة لاحتضان بين عشية وضحاها تحت التحريض.
   7. إضافة 100٪ راتنج الايبوكسي لحضانة 2 ساعة، لا تزال تحت التحريض.
   8. تحت المجهر، ضع كتل النخاع في قوالب السيليكون المسطحة. عينات موجهة للسماح بالقسم المستعرض اللاحق لنخاع العظم بأكمله. ملء قوالب مع راتنج الايبوكسي ووضعها في 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
      ملاحظة: تتم تصفية جميع المحاليل (باستثناء الإيثانول وأكسيد البروبيلين) من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر لتجنب تلوث العينات. لضمان البلمرة الكافية للراتنج، تجنب الفقاعات أثناء ملء القوالب.

4. تقسيم Ultrathin (الشكل 1B)

ملاحظة: يتطلب انتقال EM أقسام الأنسجة الرقيقة التي يمكن أن تمر عبر الإلكترونات توليد صورة الإسقاط من الداخل من الخلايا، وهيكل، وتنظيم العضيات الداخلية (الحبيبات، reticulum endoplasmic، غولجي) وترتيب أغشية الخلايا داخل الخلايا.

1. قم بتركيب كتلة العينة في دعم microtome فائقة. ضعه على حامل العينة تقليم العينات في 45° من أجل إزالة فائض من الراتنج حول الأنسجة مع الماس الدورية أو قطع الطحن التنغستن.
2. قم بتركيب العينات على الصفن الفائق مع شفرة سكين ماسية مجهزة بخزان مياه. قطع المقاطع العرضية من 500 نانومتر و 100 نانومتر سمك للتحليلات الهستورية وTEM، على التوالي. جمع المقاطع العائمة على سطح الماء مع حلقة.
3. إيداع مقطع 500 نانومتر سميكة على شريحة زجاجية و 100 نانومتر أقسام سميكة على 200 شبكة رقيقة شريط شبكات النحاس مع مرشح ورقة تحت. إعداد خمس شبكات لشرط واحد: وصمة عار شبكتين أولا والحفاظ على الشبكات الثلاث المتبقية كدعم إذا لزم الأمر.

5. Toluidine الأزرق تلطيخ لعلم الأنسجة

ملاحظة: أقسام تلطيخ لعلم النسيج مهم لثلاثة أسباب: 1) للتأكد من أن يتم قطع الأنسجة فعلا وليس الراتنج، 2) للتحقق من نوعية إدراج، و 3) لتقييم عينة النخاع بسرعة. إذا لم يكن هذا صحيحا، قطع أعمق في الكتلة.

1. جفف الشرائح شبه الرقيقة على طبق حراري (60 درجة مئوية).
2. إضافة تصفية 1٪ toluidine الأزرق / 1 ٪ بورات الصوديوم في الماء المقطر على الشرائح والحرارة على لوحة ساخنة (60 درجة مئوية) لمدة 1-2 دقيقة. غسل الشرائح بالماء المقطر والسماح لها الجافة على لوحة الحرارة.
3. جبل المقاطع على coverlips مع قطرة من بولي (بوتيل ميثاكريلات-ميثيل ميثاكريلات) تركيب المتوسطة وفحص تحت المجهر الخفيف.

6. تلطيخ المعادن الثقيلة للمراقبة TEM (الشكل 1C)

ملاحظة: بالنسبة للتباين، يتم عكس الجانب العلوي من الشبكات على قطرات 100 ميكرولتر من كل حمام متتابع مع حلقة. قبل الاستخدام، يتم تصفية كل حل 0.22 ميكرومتر. قم بإزالة فائض السائل بين كل حمام عن طريق الاتصال بلطف بجانب الشبكة على ورقة تصفية.

1. وصمة عار مع خلات أورانيل 4٪ في الماء المقطر لمدة 5 دقائق.
2. يغسل 3 مرات في الماء المقطر لمدة 5 دقائق.
3. وصمة عار مع سترات الرصاص لمدة 3 دقائق.
4. يغسل 3 مرات في الماء المقطر لمدة 5 دقائق.
5. قم بإيداع الشبكات من الجانب السفلي ملامسة لورق التصفية للسماح لها بالجفاف.
   ملاحظة: تتفاعل المعادن الثقيلة في وجود ثاني أكسيد الكربون. لتقليل الرواسب، تجنب إزاحة الهواء أثناء التباين، لا تتكلم، حافظ على هدوء البيئة وأطفئ تكييف الهواء.

7. TEM (الشكل 1E)

ملاحظة: يتم إدخال المقاطع في مجهر TEM وفحصها عند 120 كيلو فولت.

1. أولا فحص الأقسام في التكبير منخفضة (< 500x) لتقدير الجانب العام لإعداد (عدم وجود ثقب في الراتنج، طيات / ضغط في الأقسام، ويترسب بسبب تلطيخ).
2. ثم فحص المقاطع في التكبير أعلى (~ 2000x السماح للتمييز بين مرحلة النضج). عد يدويا الخلايا الضخمة من كل مرحلة من مراحل النضج على أقسام عرضية كاملة (انظر النتائج التمثيلية حول كيفية تحديد بصريا كل مرحلة).
   ملاحظة: يتم تعريف كل مربع من الشبكات كمنطقة للفحص (والتي تساوي 16000 ميكرومتر مربع ل 200 شبكة نحاسية شبكية).
3. لتقييم عدد الخلايا الضخمة، قم بتحديد المربعات التي يتم تغطيتها بالكامل بقسم فقط. للقيام بذلك، استخدم نموذجا يستند إلى فحص النطاقات. مراقبة مجموعة أولى من المربعات من أقصى القسم إلى آخر، ثم مجموعة أخرى بنفس الطريقة، الخ. باستخدام هذا الإجراء، الشاشة بشكل كامل ومنهجي كامل نخاع المقطع العرضي مربع بمربع.
4. لكل مربع، يسجل عدد من المرحلة الأولى والثانية والثالثة megakaryocytes.
   ملاحظة: مطلوب تكبيرات أعلى لتحليل الحبيبات، وتنظيم DMS، وحجم الأراضي السيتوبلازمية والنواة متعددة الأضلاع.

النتائج

أنسجة نخاع العظم
مراقبة النسيج الأزرق التولويدين نخاع العظم تحت المجهر الخفيف هو المفتاح لتحليل بسرعة بنية الأنسجة الشاملة من حيث مثل، ضغط الأنسجة، واستمرارية microvessel، وحجم وشكل megakaryocytes (الشكل 1D). يتم إجراؤه قبل أقسام فائقة لتحديد الحاجة إلى قطع أعمق في...

Discussion

الفحص المباشر للخلايا الضخمة في بيئتها الأصلية أمر ضروري لفهم الخلايا الضخمة وتشكيل الصفائح الدموية. في هذه المخطوطة، نقدم طريقة المجهر الإلكتروني انتقال الجمع بين مسح نخاع العظم والتثبيت عن طريق الغمر، مما يسمح لتشريح في الموقع خصائص مورفولوجيا العملية برمتها من مورفوجينيسيس megakar...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30)	Ladd Research Industries, USA	21310
Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar	Electron Microscopy Sciences, USA	1670-B
CaCl2 Calcium chloride hexahydrate	Merck, Germany	2083
Copper grids 200 mesh thin-bar	Oxford Instrument, Agar Scientifics, England	T200-CU
Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate	Merck, Germany	8.20670.0250
Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA)	Ladd Research Industries, USA	21340
Double Edge Stainless Razor blade	Electron Microscopy Sciences-EMS, USA	EM-72000
Ethanol absolut	VWR International, France	20821296
Filter paper, 90 mm diameter	Whatman, England	512-0326
Flat embedding silicone mould	Oxford Instrument, Agar Scientific, England	G3533
Glutaraldehyde 25%	Electron Microscopy Sciences-EMS, USA	16210
Heat plate Leica EMMP	Leica Microsystems GmbH, Austria	705402
Histo Diamond Knife 45°	Diatome, Switzerland	1044797
JEOL 2100 Plus TEM microscope	JEOL, Japan	EM-21001BU
Lead citrate - Ultrostain 2	Leica Microsystems GmbH, Austria	70 55 30 22
LX-112 resin	Ladd Research Industries, USA	21310
MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate	Sigma, France	M2393-100g
Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate)	Electron Microscopy Sciences-EMS, USA	15320
Nadic Methyl Anhydride (NMA)	Ladd Research Industries, USA	21350
Osmium tetroxide 2%	Merck, Germany	19172
Propylene oxide (1.2-epoxypropane)	Sigma, France	82320-250ML
Saline injectable solution 0.9% NaCl	C.D.M Lavoisier, France	MA 575 420 6
Scalpel Surgical steel blade	Swann-Morton, England	.0508
Sodium tetraborate - Borax	Sigma, France	B-9876
Sucrose	Merck, Germany	84100-1KG
Syringe filter 0.2µm	Pall Corporation, USA	514-4126
Toluidine blue	Ladd Research Industries, USA	N10-70975
Trimmer EM TRIM2	Leica Microsystems GmbH, Austria	702801
Ultramicrotome Ultracut UCT	Leica Microsystems GmbH, Austria	656201
Uranyl acetate	Ladd Research Industries, USA	23620