Sul posto Esplorazione della megacariopoiesi murina usando la microscopia elettronica a trasmissione

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per analizzare l'ultrastruttura dei megacariociti in situ utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM). I midolli ossei murini vengono raccolti, fissati, incorporati in resina epossidica e tagliati in sezioni ultrassteste. Dopo la colorazione di contrasto, il midollo osseo viene osservato al microscopio TEM a 120 kV.

Abstract

La differenziazione e la maturazione dei megacariociti avvengono in stretta associazione con i componenti cellulari ed extracellulari del midollo osseo. Questi processi sono caratterizzati dalla graduale comparsa di strutture essenziali nel citoplasma dei megacariociti come un nucleo poliploide e polilobulato, una rete di membrana interna chiamata sistema di membrana di demarcazione (DMS) e i granuli densi e alfa che si troveranno nelle piastrine circolanti. In questo articolo, descriviamo un protocollo standardizzato per lo studio ultrastrutturale in situ dei megacariociti murini utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM), consentendo l'identificazione delle caratteristiche chiave che definiscono il loro stadio di maturazione e la densità cellulare nel midollo osseo. I midollo osseo vengono lavati, fissati, disidratati in etanolo, incorporati in resina plastica e montati per generare sezioni trasversali. Sezioni semisottili e sottili sono preparate rispettivamente per osservazioni istologiche e TEM. Questo metodo può essere utilizzato per qualsiasi cellula del midollo osseo, in qualsiasi struttura EM e ha il vantaggio di utilizzare campioni di piccole dimensioni che consentono la combinazione di diversi approcci di imaging sullo stesso topo.

Introduzione

I megacariociti sono cellule poliploidi specializzate di grandi dimensioni, localizzate nel midollo osseo, responsabili della produzione piastrinica¹. Hanno origine da cellule staminali ematopoietiche attraverso un intricato processo di maturazione, durante il quale i precursori dei megacariociti aumentano progressivamente di dimensioni, mentre subiscono estesi cambiamenti morfologici concomitanti nel citoplasma e nel nucleo². Durante la maturazione, i megacariociti sviluppano una serie di elementi strutturali distinguibili tra cui: un nucleo polilobulato, invaginazioni della membrana superficiale che formano il sistema di membrana di demarcazione (DMS), una zona periferica priva di organelli circondata dalla rete citoscheletrica a base di actina e numerosi organelli tra cui α-granuli, granuli densi, lisosomi e complessi multipli di Golgi. A livello ultrastrutturale, una modifica importante osservata è la compartimentazione citoplasmatica in regioni discrete delimitate dal DMS³. Questa vasta fornitura di membrane alimenterà l'estensione di lunghi processi citoplasmatici nella fase iniziale della produzione piastrinica, che poi si rimodellerà in piastrine all'interno della circolazione. Qualsiasi difetto durante la differenziazione e la maturazione dei megacariociti può influenzare la produzione piastrinica in termini di conta piastrinica e/o funzione piastrinica.

La microscopia elettronica a trasmissione a strato sottile (TEM) è stata l'approccio di imaging di scelta per decenni fornendo un'ultrastruttura di alta qualità dei megacariociti che hanno plasmato la nostra comprensione della fisiologia della trombopoiesi^4,5. Questo documento si concentra su un metodo TEM standardizzato che consente di catturare il processo di biogenesi piastrinica che si verifica in situ all'interno del microambiente del midollo osseo nativo, che potrebbe anche servire come base per analizzare qualsiasi tipo di cellula del midollo osseo. Forniamo esempi ultrastrutturali dello sviluppo di megacariociti da immaturi a completamente maturi, che estendono i processi citoplasmatici nella microcircolazione delle sinusoidi⁶. Descriviamo anche una procedura semplice per quantificare le diverse fasi di maturazione dei megacariociti, istruendo sulla rigenerazione e sulla capacità di produzione piastrinica del midollo osseo.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le norme europee 2010/63/UE e il Comitato CREMEAS per l'etica degli esperimenti sugli animali dell'Università di Strasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). Il protocollo è schematicamente mostrato nella Figura 1.

1. Raccolta e fissazione del midollo osseo ( Figura 1A)

ATTENZIONE: Questa procedura include sostanze cancerogene, mutagene e/o tossiche e viene eseguita sotto un cappuccio di estrazione chimica. Indossare adeguati dispositivi di protezione come guanti e occhiali di protezione.

1. Preparare la soluzione fissativa costituita da glutaraldeide al 2,5% in tampone di cacodilato (vedere File supplementare).
2. Raccolta del midollo osseo
   1. Utilizzare topi adulti C57BL/6 di entrambi i sessi 12-18 settimane di età. Eutanasia dei topi mediante asfissia di CO₂ e lussazione cervicale.
   2. Con un paio di forbici sottili, tagliare la pelle intorno alla coscia e usare una pinzetta per staccare la pelle. Rimuovere l'estremità della zampa e quindi tagliare tra l'anca e la coscia. Staccare la tibia dal femore tagliando l'articolazione del ginocchio e rimuovere il tessuto aderente su tibie e femori usando un bisturi.
   3. Rimuovere le epifisi con una lama di rasoio affilata. Mentre si tiene il femore con una pinzetta, utilizzare una siringa da 5 mL riempita con tampone cacodilato con un ago da 21 G per lavare il midollo osseo in un tubo da 15 ml riempito con tampone cacodilato da 2 ml. Per fare ciò, inserire la smussatura dell'ago nell'apertura del midollo osseo e premere lentamente lo stantuffo fino a quando il midollo non viene espulso.
3. Fissazione del midollo osseo mediante rapida immersione nel fissativo.
   1. Immediatamente dopo il lavaggio, utilizzare una pipetta di plastica per trasferire il cilindro del midollo osseo in 1 mL di soluzione fissativa di glutaraldeide fresca (precedentemente preparata in 1.1) per 60 minuti a temperatura ambiente.
      NOTA: Per preservare il tessuto, assicurarsi che l'intero processo, dalla dissezione ossea alla fase di fissazione, sia completato in meno di 10 minuti. Per la fissazione, assicurarsi che la soluzione fissativa sia a temperatura ambiente per evitare shock termici.

2. Incorporare il midollo osseo nell'agarose

NOTA: il tessuto midollare non è sufficientemente coeso per mantenere la sua integrità durante le diverse fasi di lavaggio e il materiale può essere facilmente perso. Per superare questo problema, il midollo è coperto da un gel di agar prima della disidratazione.

1. Preparare la soluzione di agarose come descritto nel file supplementare.
2. Lavare il midollo fisso dal punto 1.3 in tampone cacodilato e trasferirlo accuratamente su un vetrino usando una pipetta di plastica. Utilizzando una pipetta calda, applicare rapidamente una goccia di agar liquido al 2% sul cilindro del midollo osseo.
   NOTA: L'agar si solidifica rapidamente durante il raffreddamento. Per garantire una copertura omogenea del midollo osseo, la soluzione di agar deve essere mantenuta calda fino a quando non si deposita sul vetrino.
3. Posizionare rapidamente lo scivolo sul ghiaccio fino a quando l'agar si solidifica (1-2 min).
4. Al microscopio, utilizzare una lama di rasoio affilata per tagliare e scartare le estremità del cilindro del midollo osseo a causa della possibile compressione del tessuto in queste aree. Trasferire i blocchi di midollo in tubi microcentrifuga da 1,5 mL contenenti 1 mL di tampone di cacodilato.

3. Incorporare il midollo osseo nella resina

ATTENZIONE: i componenti in resina sono tossici; alcuni sono cancerogeni e devono essere maneggiati con cura sotto una cappa di estrazione chimica. Utilizzare dispositivi di protezione appropriati come guanti e occhiali di protezione. Il tetrexide di osmio è altamente volatile a temperatura ambiente e i suoi vapori sono molto dannosi per gli occhi, il naso e la gola. Prima di essere scartato, il tetrexuro di osmio al 2% deve essere neutralizzato aggiungendo il doppio del suo volume di olio vegetale.

1. Preparare la resina epossidica come descritto nel file supplementare.
2. Incorporamento in resina
   NOTA: Conservare i campioni nelle stesse provette di microcentrifuga durante le incubazioni in bagni successivi di osmio, acetato di uranile ed etanolo. Aspirare i supernatanti con una pipetta Pasteur. Il volume di soluzione utilizzato per ciascun bagno deve essere pari ad almeno 10 volte il volume del campione.
   1. Post-fissare i blocchi con osmio all'1% in tampone cacodilato per 1 ora a 4 °C, lavare una volta in tampone cacodilato e poi una volta in acqua distillata.
   2. Macchiare con acetato di uranile al 4% in acqua distillata per 1 ora, lavare due volte in acqua distillata.
   3. Disidratare attraverso una serie graduata di etanolo in acqua distillata: 4 volte in etanolo al 75% per 5 minuti, seguito da 3 volte in etanolo al 95% per 20 minuti e poi 3 volte in etanolo al 100% per 20 minuti. A questo punto, togliere una siringa di resina epossidica dal congelatore.
      NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa in etanolo al 100% per 1 ora.
   4. Per ottenere un'infiltrazione e polimerizzazione uniforme della resina epossidica all'interno del midollo, incubare prima i blocchi in 2 bagni successivi di ossido di propilene per 15 min.
   5. Aggiungere una miscela 1:1 di ossido di propilene al 100% e resina epossidica e incubare per 1 ora. Posizionare i campioni su uno shaker rotativo lento a temperatura ambiente.
   6. Aggiungere 100% resina epossidica lasciare il campione per l'incubazione notturna sotto agitazione.
   7. Aggiungere resina epossidica al 100% per 2 ore di incubazione, ancora in agitazione.
   8. Al microscopio, posizionare i blocchi di midollo in stampi in silicone piatti. Orientare i campioni per consentire il successivo sezionamento trasversale dell'intero midollo osseo. Riempire gli stampi con resina epossidica e posizionarli a 60 °C per 48 ore.
      NOTA: Tutte le soluzioni (ad eccezione dell'etanolo e dell'ossido di propilene) vengono filtrate attraverso un filtro da 0,22 μm per evitare la contaminazione dei campioni. Per garantire un'adeguata polimerizzazione della resina, evitare bolle durante il riempimento degli stampi.

4. Sezionamento ultrasebrisante (Figura 1B)

NOTA: La trasmissione EM richiede sezioni di tessuto sottili attraverso le quali gli elettroni possono passare generando un'immagine di proiezione dell'interno delle cellule, della struttura e dell'organizzazione degli organelli interni (granuli, reticolo endoplasmatico, Golgi) e la disposizione delle membrane cellulari intracellulari.

1. Montare il blocco campione in un supporto ultra-microtome. Mettilo sul portase campioni. Tagliare i campioni a 45° per rimuovere l'eccesso di resina intorno al tessuto con una fresa rotante a diamante o tungsteno.
2. Montare i campioni sull'ultramicrotomo con una lama diamanta dotata di un serbatoio d'acqua. Taglio di sezioni trasversali di spessore 500 nm e 100 nm per analisi istologiche e TEM, rispettivamente. Raccogli sezioni galleggianti sulla superficie dell'acqua con un anello.
3. Depositare la sezione spessa 500 nm su una diapositiva di vetro e le sezioni spesse 100 nm su griglie di rame a barra sottile a 200 maglie con un filtro di carta sottostante. Preparare cinque griglie per una condizione: macchiare prima due griglie e mantenere le tre griglie rimanenti come backup, se necessario.

5. Colorazione blu toluidina per istologia

NOTA: La colorazione delle sezioni per l'istologia è importante per tre motivi: 1) per assicurarsi che il tessuto sia effettivamente tagliato e non la resina, 2) per verificare la qualità dell'inclusione e 3) per valutare rapidamente il campione di midollo. Se questo non è corretto, taglia più in profondità nel blocco.

1. Asciugare le sezioni semisottili scorrere su una piastra termica (60 °C).
2. Aggiungere l'1% di toluidina blu filtrato/l'1% di borato di sodio in acqua distillata sui vetrini e riscaldare su una piastra calda (60 °C) per 1-2 min. Lavare i vetrini con acqua distillata e lasciarli asciugare sulla piastra termica.
3. Montare sezioni su coverslips con una goccia di mezzo di montaggio Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) ed esaminare al microscopio ottico.

6. Colorazione di metalli pesanti per l'osservazione TEM (Figura 1C)

NOTA: Per il contrasto, il lato superiore delle griglie viene invertito su gocce da 100 μL di ogni bagno successivo con un anello. Prima dell'uso, ogni soluzione viene filtrata con 0,22 μm. Rimuovere l'eccesso di liquido tra ogni bagno contattando delicatamente il lato griglia su una carta da filtro.

1. Macchiare con acetato di uranile al 4% in acqua distillata per 5 min.
2. Lavare 3 volte in acqua distillata per 5 min.
3. Macchiare con citrato di piombo per 3 min.
4. Lavare 3 volte in acqua distillata per 5 min.
5. Depositare le griglie sul lato inferiore a contatto con la carta da filtro per lasciarle asciugare.
   NOTA: I metalli pesanti reagiscono in presenza di anidride carbonica. Per ridurre al minimo i precipitati, evitare lo spostamento d'aria durante il contrasto, non parlare, mantenere l'ambiente calmo e spegnere l'aria condizionata.

7. TEM (Figura 1E)

NOTA: Le sezioni vengono introdotte in un microscopio TEM ed esaminate a 120 kV.

1. Esaminare innanzitutto le sezioni a basso ingrandimento (< 500x) per apprezzare l'aspetto generale della preparazione (assenza di foro nella resina, pieghe/compressione nelle sezioni, precipitati dovuti alla colorazione).
2. Quindi esaminare le sezioni a ingrandimento più elevato (~ 2000x che consente di distinguere lo stadio di maturazione). Contare manualmente i megacariociti di ogni fase di maturazione su intere sezioni trasversali (vedere Risultati rappresentativi su come identificare visivamente ogni fase).
   NOTA: Ogni quadrato delle griglie è definito come un'area per l'esame (che equivale a 16000 μm2 per 200 griglie di rame a maglie).
3. Per valutare il numero di megacariociti, quantificare solo i quadrati che sono completamente coperti da una sezione. Per fare ciò, utilizzare un modello basato sullo screening degli intervalli. Osserva una prima gamma di quadrati da un'estremità della sezione a un'altra, poi un'altra gamma allo stesso modo, ecc. Utilizzando questa procedura, schermare completamente e sistematicamente l'intero midollo trasversale sezione quadrato per quadrato.
4. Per ogni quadrato, segna il numero di megacariociti dello stadio I, II o III.
   NOTA: sono necessari ingrandimenti più elevati per analizzare i granuli, l'organizzazione DMS, la dimensione dei territori citoplasmatici e il nucleo polilobulato.

Risultati

Istologia del midollo osseo
L'osservazione dell'istologia blu toluidina del midollo osseo al microscopio ottico è la chiave per analizzare rapidamente l'architettura complessiva del tessuto in termini, ad esempio, di compattezza dei tessuti, continuità dei microvasi e dimensioni e forma dei megacariociti (Figura 1D). Viene eseguito prima di sezioni ultrassanteli per determinare la necessità di tagliare più in profondità nel blocco del midollo osseo. ...

Discussione

L'esame diretto dei megacariociti nel loro ambiente nativo è essenziale per comprendere la megacariopoiesi e la formazione piastrinica. In questo manoscritto, forniamo un metodo di microscopia elettronica a trasmissione che combina il lavaggio del midollo osseo e la fissazione per immersione, consentendo di sezionare in situ le caratteristiche morfologiche dell'intero processo di morfogenesi dei megacariociti che si svolge nel midollo osseo.

Il rossore del midollo osseo è un passagg...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30)	Ladd Research Industries, USA	21310
Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar	Electron Microscopy Sciences, USA	1670-B
CaCl2 Calcium chloride hexahydrate	Merck, Germany	2083
Copper grids 200 mesh thin-bar	Oxford Instrument, Agar Scientifics, England	T200-CU
Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate	Merck, Germany	8.20670.0250
Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA)	Ladd Research Industries, USA	21340
Double Edge Stainless Razor blade	Electron Microscopy Sciences-EMS, USA	EM-72000
Ethanol absolut	VWR International, France	20821296
Filter paper, 90 mm diameter	Whatman, England	512-0326
Flat embedding silicone mould	Oxford Instrument, Agar Scientific, England	G3533
Glutaraldehyde 25%	Electron Microscopy Sciences-EMS, USA	16210
Heat plate Leica EMMP	Leica Microsystems GmbH, Austria	705402
Histo Diamond Knife 45°	Diatome, Switzerland	1044797
JEOL 2100 Plus TEM microscope	JEOL, Japan	EM-21001BU
Lead citrate - Ultrostain 2	Leica Microsystems GmbH, Austria	70 55 30 22
LX-112 resin	Ladd Research Industries, USA	21310
MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate	Sigma, France	M2393-100g
Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate)	Electron Microscopy Sciences-EMS, USA	15320
Nadic Methyl Anhydride (NMA)	Ladd Research Industries, USA	21350
Osmium tetroxide 2%	Merck, Germany	19172
Propylene oxide (1.2-epoxypropane)	Sigma, France	82320-250ML
Saline injectable solution 0.9% NaCl	C.D.M Lavoisier, France	MA 575 420 6
Scalpel Surgical steel blade	Swann-Morton, England	.0508
Sodium tetraborate - Borax	Sigma, France	B-9876
Sucrose	Merck, Germany	84100-1KG
Syringe filter 0.2µm	Pall Corporation, USA	514-4126
Toluidine blue	Ladd Research Industries, USA	N10-70975
Trimmer EM TRIM2	Leica Microsystems GmbH, Austria	702801
Ultramicrotome Ultracut UCT	Leica Microsystems GmbH, Austria	656201
Uranyl acetate	Ladd Research Industries, USA	23620