In Situ İletim Elektron Mikroskopisi Kullanılarak Murine Megakaryopoez Keşfi

Özet

Burada, iletim elektron mikroskopisi (TEM) kullanılarak megakaryositlerin yerinde ultrayapısını analiz etmek için bir protokol sunuyoruz. Murine kemik ilikleri toplanır, sabitlenir, epoksi reçineye gömülür ve ultra ince bölümlerde kesilir. Kontrast boyamadan sonra kemik iliği 120 kV'da TEM mikroskobu altında gözlenir.

Özet

Megakaryositlerin farklılaşması ve olgunlaşması, kemik iliğinin hücresel ve hücre dışı bileşenleri ile yakın ilişki içinde ortaya çıkar. Bu işlemler, poliploid ve polilobulat çekirdek gibi megakaryosit sitoplazmasındaki temel yapıların, sınır membran sistemi (DMS) adı verilen bir iç membran ağının ve dolaşımdaki trombositlerde bulunacak yoğun ve alfa granüllerinin kademeli olarak ortaya çıkması ile karakterize edilir. Bu yazıda, iletim elektron mikroskopisi (TEM) kullanılarak murine megakaryositlerin yerinde ultrayapısal çalışması için standartlaştırılmış bir protokol açıklanmış haline getirilmiş ve kemik iliğindeki olgunlaşma evrelerini ve hücresel yoğunluklarını tanımlayan temel özelliklerin tanımlanmasını sağlamaktır. Kemik ilikleri yıkanır, sabitlenir, etanolde susuzlur, plastik reçineye gömülür ve kesitler oluşturmak için monte edilir. Histolojik ve TEM gözlemleri için sırasıyla yarı ince ve ince bölümler hazırlanır. Bu yöntem herhangi bir kemik iliği hücresi için, herhangi bir EM tesisinde kullanılabilir ve aynı fare üzerinde birkaç görüntüleme yaklaşımının kombinasyonuna izin sağlayan küçük örnek boyutları kullanma avantajına sahiptir.

Giriş

Megakaryositler, kemik iliğinde lokalize, trombosit üretiminden sorumlu özel büyük poliploid hücrelerdir^1. Sitoplazma ve çekirdek^2'dekapsamlı eşlik eden morfolojik değişikliklere uğrarken, megakaryosit öncüllerinin giderek arttığı karmaşık bir olgunlaşma süreci yoluyla hematopoetik kök hücrelerden kaynaklanırlar. Olgunlaşma sırasında, megakaryositler aşağıdakiler de dahil olmak üzere bir dizi ayırt edilebilir yapısal eleman geliştirir: polilobürlenmiş bir çekirdek, sınır membran sistemini (DMS) oluşturan yüzey zarının invaginasyonları, aktin bazlı sitoskeletal ağ ile çevrili organellerden yoksun bir periferik bölge ve α granüller, yoğun granüller, lizozomlar ve çoklu Golgi kompleksleri dahil olmak üzere çok sayıda organel. Ultrayapı düzeyinde, gözlenen önemli bir değişiklik, DMS³tarafından sınırlandırılan ayrık bölgelere sitoplazmik bölmelemedir. Bu geniş membran kaynağı, trombosit üretiminin ilk aşamasında uzun sitoplazmik süreçlerin uzatılmasını körükleyecek ve daha sonra sirkülasyonun içindeki trombositlere dönüşecektir. Megakaryosit farklılaşması ve olgunlaşması sırasındaki herhangi bir kusur trombosit sayısı ve/veya trombosit fonksiyonu açısından trombosit üretimini etkileyebilir.

İnce tabaka iletim elektron mikroskopisi (TEM), trombopoezis^4,5fizyolojisi anlayışımızı şekillendiren megakaryositlerin yüksek kaliteli ultrayapısını sağlayan onlarca yıldır tercih edilen görüntüleme yaklaşımıdır. Bu makale, herhangi bir kemik iliği hücre tipini analiz etmek için de temel teşkil edebilecek, yerli kemik iliği mikroçevriminde in situ meydana gelen trombosit biyogenez sürecini yakalamaya izin veren standartlaştırılmış bir TEM yöntemine odaklanmaktadır. Sitoplazmik süreçleri sinüzoidlerin mikrosirkülasyonuna genişleten olgunlaşmamışlıktan tamamen olgunluğa kadar megakaryositlerin gelişiminin ultrayapısal örneklerini sunuyoruz⁶. Ayrıca, kemik iliğinin rejenerasyon ve trombosit üretim kapasitesi konusunda talimat veren farklı megakaryosit olgunlaşma aşamalarını ölçmek için kolay bir prosedür açıklıyoruz.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri Avrupa standartlarına uygun olarak gerçekleştirildi 2010/63/EU ve CREMEAS Strazburg Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Komitesi (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). protokol şematik olarak Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. Kemik iliği toplama ve sabitleme ( Şekil 1A)

DİkKAT: Bu prosedür kanserojen, mutajenik ve/veya toksik maddeleri içerir ve kimyasal ekstraksiyon başlığı altında gerçekleştirilir. Eldiven ve koruma gözlüğü gibi uygun koruyucu ekipmanları giyin.

1. Cacodylate tamponunda% 2.5 glutaraldehitden oluşan fiksatif çözeltiyi hazırlayın(bkz. Ek Dosya).
2. Kemik iliği toplama
   1. Her iki cinsiyette de yetişkin C57BL / 6 fareleri kullanın 12-18 haftalık. Fareleri CO₂ boğulma ve servikal çıkık ile ötenazi.
   2. Bir çift ince makasla, uyluğun etrafındaki cildi kesin ve cildi soymak için cımbız kullanın. Pençenin ekstremitesini çıkarın ve ardından kalça ve uyluk arasında kesin. Diz eklemlenmesinde keserek kaval kemiğini uyluk kemiğinden ayırın ve neşter kullanarak kaval kemiği ve uyluk kemiği üzerindeki yapışık dokuyu çıkarın.
   3. Epifizleri keskin bir jiletle çıkarın. Uyluk kemiğini cımbızla tutarken, kemik iliğini 2 mL kakodylat tamponu ile dolu 15 mL'lik bir tüpe yıkamak için 21 G iğneli kakodylat tamponu ile dolu 5 mL şırınga kullanın. Bunu yapmak için, iğnenin eğimini kemik iliği açıklığı içine yerleştirin ve ilik dışarı atılana kadar pistona yavaşça bastırın.
3. Fiksatif içine hızlı daldırma ile kemik iliği fiksasyonu.
   1. Yıkamadan hemen sonra, kemik iliği silindirini oda sıcaklığında 60 dakika boyunca 1 mL taze glutaraldehit fiksatif çözeltisine (daha önce 1,1'de hazırlanmış) aktarmak için plastik bir pipet kullanın.
      NOT: Dokuyu korumak için kemik diseksiyonundan fiksasyon adımına kadar tüm işlemin 10 dakikadan kısa sürede tamamlandığından emin olun. Fiksasyon için, ısı şokunu önlemek için fiksatif çözeltinin oda sıcaklığında olduğundan emin olun.

2. Kemik iliğini agarose içine gömmek

NOT: İlik dokusu farklı yıkama adımları sırasında bütünlüğünü korumak için yeterince uyumlu değildir ve malzeme kolayca kaybolabilir. Bu sorunun üstesinden gelmek için, ilik dehidrasyondan önce bir agar jeli ile kaplanır.

1. Agarose çözeltisini Ek Dosya 'da açıklandığı gibi hazırlayın.
2. Bölüm 1.3'teki sabit iliği kaktüs tamponunda yıkayın ve plastik bir pipet kullanarak dikkatlice cam bir slayda aktarın. Ilık bir pipet kullanarak, kemik iliği silindirine hızlı bir şekilde% 2 sıvı agar damla uygulayın.
   NOT: Agar soğurken hızlı bir şekilde katılanın. Kemik iliğinin homojen bir şekilde kaplanmasını sağlamak için, agar çözeltisinin kaydırağa birikene kadar sıcak tutulması gerekir.
3. Agar katılanıncaya kadar (1-2 dk) kaydırağı hızla buza yerleştirin.
4. Mikroskop altında, bu bölgelerdeki olası doku sıkışması nedeniyle kemik iliği silindirinin ekstremitelerini kesmek ve atmak için keskin bir jilet kullanın. İlik bloklarını 1 mL kakadodylat tampon içeren 1,5 mL mikrosantrifüj tüplere aktarın.

3. Kemik iliğini reçineye gömmek

DİkKAT: Reçine bileşenleri toksiktir; bazıları kanserojendir ve kimyasal ekstraksiyon başlığı altında özenle ele alınmalıdır. Eldiven ve koruma gözlüğü gibi uygun koruyucu ekipmanları kullanın. Osmiyum tetroksit oda sıcaklığında oldukça uçucudur ve buharları göz, burun ve boğaz için çok zararlıdır. Atılmadan önce, % 2 osmiyum tetroksit, bitkisel yağ hacminin iki katı eklenerek nötralize edilmelidir.

1. Ek Dosya 'da açıklandığı gibi epoksi reçinesini hazırlayın.
2. Reçine gömme
   NOT: Osmiyum, uranil asetat ve etanol ardışık banyolarda inkübasyonlar sırasında numuneleri aynı mikrosantrifüj tüplerinde saklayın. Üstleri pasteur pipetle aspire edin. Her banyo için kullanılan çözelti hacmi, numunenin hacminin en az 10 katını eşit olmalıdır.
   1. Blokları 4 °C'de 1 saat boyunca kaktüs tamponunda% 1 osmiyum ile sabitle, bir kez cacodylate tamponunda ve sonra bir kez damıtılmış suda yıkayın.
   2. Damıtılmış suda% 4 uranil asetat ile 1 saat leke, damıtılmış suda iki kez yıkayın.
   3. Damıtılmış suda dereceli bir etanol serisinden susuzluk: 5 dakika boyunca% 75 etanolde 4 kez, ardından 20 dakika boyunca% 95 etanolde 3 kez ve ardından 20 dakika boyunca% 100 etanolde 3 kez. Bu adımda, dondurucudan bir şırınna epoksi reçinesi alın.
      NOT: Protokol 1 saat boyunca% 100 etanolde duraklatılabilir.
   4. İliğin içindeki epoksi reçinesinin tek tip infiltrasyonunu ve polimerizasyonunu elde etmek için, önce 15 dakika boyunca 2 ardışık propilen oksit banyosundaki blokları kuluçkaya yatırın.
   5. % 100 propilen oksit ve epoksi reçine karışımı ekleyin ve 1 saat kuluçkaya yatırın. Numuneleri oda sıcaklığında yavaş bir döner çalkalayıcıya yerleştirin.
   6. % 100 epoksi reçine ekleyin, numuneyi ajitasyon altında gece kuluçka için bırakın.
   7. 2 saat inkübasyon için% 100 epoksi reçine ekleyin, hala ajitasyon altında.
   8. Mikroskop altında, ilik bloklarını düz silikon kalıplara yerleştirin. Tüm kemik iliğinin daha sonra transversal kesitlerine izin vermek için örnekleri yönlendirin. Kalıpları epoksi reçine ile doldurun ve 48 saat boyunca 60 ° C'ye yerleştirin.
      NOT: Numunelerin kirlenmesini önlemek için tüm çözeltiler (etanol ve propilen oksit hariç) 0,22 μm filtreden süzülür. Reçinenin yeterli polimerizasyonunu sağlamak için kalıpları doldururken kabarcıklardan kaçının.

4. Ultra ince kesitleme (Şekil 1B)

NOT: İletim EM, elektronların hücrelerin iç kısmının, yapısının ve iç organellerin (granüller, endoplazmik retikulum, Golgi) organizasyonu ve hücre içi hücre zarlarının düzenlenmesinin projeksiyon görüntüsünü oluşturabileceği ince doku bölümleri gerektirir.

1. Numune bloğunu ultra mikrotom desteğine monte edin. Örnek tutucuya koy. Dönen bir elmas veya tungsten frezeleme kesicisi ile doku etrafındaki reçine fazlalığını gidermek için numuneleri 45 ° 'de kırpın.
2. Numuneleri su tankı ile donatılmış elmas bıçak bıçağı ile ultramikrotom üzerine monte edin. Histolojik ve TEM analizleri için sırasıyla 500 nm ve 100 nm kalınlığında enine kesitler kesin. Su yüzeyinde yüzen bölümleri bir döngü ile toplayın.
3. 500 nm kalınlığındaki bölümü cam bir kaydırağa ve 100 nm kalınlığındaki bölümleri altında kağıt filtre bulunan 200 örgü ince çubuk bakır ızgaralara yatırın. Bir koşul için beş ızgara hazırlayın: önce iki ızgarayı lekelenin ve gerekirse kalan üç ızgarayı yedek olarak tutun.

5. Histoloji için Toluidin mavi boyama

NOT: Histoloji için lekeleme bölümleri üç nedenden dolayı önemlidir: 1) reçinenin değil, dokunun gerçekten kesildiğinden emin olmak, 2) inklüzyonun kalitesini kontrol etmek ve 3) ilik örneğini hızlı bir şekilde değerlendirmek. Bu doğru değilse, bloğun daha derinini kesin.

1. Yarı ince bölümleri bir ısı plakasında (60 °C) kaydırın.
2. Slaytlara damıtılmış suya filtrelenmiş% 1 toluidin mavisi / % 1 sodyum borat ekleyin ve 1-2 dakika boyunca sıcak bir plakada (60 ° C) ısıtın. Slaytları damıtılmış suyla yıkayın ve ısı plakasında kurumasına izin verin.
3. Bölümleri bir damla Poli (butil methakrilat-co-metil methakrilit) montaj ortamı ile kapaklara monte edin ve hafif bir mikroskop altında inceleyin.

6. TEM gözlemi için ağır metal boyama (Şekil 1C)

NOT: Kontrast için, ızgaraların üst tarafı, ardışık her banyonun 100 μL damlasına bir döngü ile ters çevrilir. Kullanmadan önce, her çözelti 0,22 μm filtrelenmiştir. Bir filtre kağıdı üzerinde ızgara tarafına hafifçe temas derek her banyo arasındaki fazla sıvıyı çıkarın.

1. 5 dakika boyunca damıtılmış suda% 4 uranil asetat ile leke.
2. Damıtılmış suda 3 kez 5 dakika yıkayın.
3. 3 dakika boyunca kurşun sitratlı leke.
4. Damıtılmış suda 3 kez 5 dakika yıkayın.
5. Izgaraları kurumasını sağlamak için filtre kağıdıyla temas halinde alt tarafa yatırın.
   NOT: Ağır metaller karbondioksit varlığında reaksiyona sokur. Çökeltmeleri en aza indirmek için kontrast sırasında havanın yer değiştirmesini önleyin, konuşmayın, ortamı sakin tutun ve klimayı kapatın.

7. TEM (Şekil 1E)

NOT: Bölümler TEM mikroskopunda tanıtılır ve 120 kV'da incelenir.

1. İlk olarak, preparatın genel yönünü takdir etmek için düşük büyütmedeki bölümleri (< 500x) inceleyin (reçinede delik olmaması, bölümlerde kıvrımlar / sıkıştırma, lekelenme nedeniyle çökeltiler).
2. Daha sonra bölümleri daha yüksek büyütmede inceleyin (~ olgunlaşma aşamasını ayırt etmeye izin vererek~ 2000x). Olgunlaşmanın her aşamasındaki megakaryositleri tüm transversal bölümler üzerinde manuel olarak sayın (bkz. Her aşamanın görsel olarak nasıl tanımılacağına ilişkin Temsili Sonuçlar).
   NOT: Izgaraların her karesi inceleme alanı olarak tanımlanır (200 örgü bakır ızgara için 16000 μm2'ye eşittir).
3. Megakaryosit sayısını değerlendirmek için, yalnızca bir bölümle tamamen kaplı kareleri ölçün. Bunu yapmak için aralıkların taranmasını temel alan bir model kullanın. Bölümün bir ekstremitesinden diğerine, daha sonra aynı şekilde başka bir aralık vb. Bu prosedürü kullanarak, tüm ilik transversal bölümünü kare kare tarayın.
4. Her kare için Aşama I, II veya III megakaryosit sayısını puanla.
   NOT: Granülleri, DMS organizasyonunu, sitoplazmik bölgelerin boyutunu ve polilobulatlanmış çekirdeği analiz etmek için daha yüksek büyütmeler gereklidir.

Sonuçlar

Kemik iliği histolojisi
Kemik iliği toluidin mavi histolojisinin hafif bir mikroskop altında gözlemlenmesi, doku kompaktlığı, mikrovessel sürekliliği ve megakaryositlerin büyüklüğü ve şekli açısından genel doku mimarisini hızlı bir şekilde analiz etmek için anahtardır (Şekil 1D). Kemik iliği bloğunda daha derin kesme ihtiyacını belirlemek için ultra ince bölümlerden önce gerçekleştirilir. Dev boyutları ve nükleer lobül...

Tartışmalar

Megakaryositlerin kendi ortamlarında doğrudan incelenmesi, megakaryopoez ve trombosit oluşumunu anlamak için gereklidir. Bu yazıda, kemik iliğinde gerçekleşen megakaryosit morfogenezinin tüm sürecinin morfoloji özelliklerini yerinde inceleyerek kemik iliği yıkama ve fiksasyonunu daldırma ile birleştiren bir iletim elektron mikroskopi yöntemi sunuyoruz.

Kemik iliğinin yıkanması bu yöntemin kritik bir adımıdır, çünkü yüksek kaliteli bir yıkamanın başarısı...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30)	Ladd Research Industries, USA	21310
Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar	Electron Microscopy Sciences, USA	1670-B
CaCl2 Calcium chloride hexahydrate	Merck, Germany	2083
Copper grids 200 mesh thin-bar	Oxford Instrument, Agar Scientifics, England	T200-CU
Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate	Merck, Germany	8.20670.0250
Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA)	Ladd Research Industries, USA	21340
Double Edge Stainless Razor blade	Electron Microscopy Sciences-EMS, USA	EM-72000
Ethanol absolut	VWR International, France	20821296
Filter paper, 90 mm diameter	Whatman, England	512-0326
Flat embedding silicone mould	Oxford Instrument, Agar Scientific, England	G3533
Glutaraldehyde 25%	Electron Microscopy Sciences-EMS, USA	16210
Heat plate Leica EMMP	Leica Microsystems GmbH, Austria	705402
Histo Diamond Knife 45°	Diatome, Switzerland	1044797
JEOL 2100 Plus TEM microscope	JEOL, Japan	EM-21001BU
Lead citrate - Ultrostain 2	Leica Microsystems GmbH, Austria	70 55 30 22
LX-112 resin	Ladd Research Industries, USA	21310
MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate	Sigma, France	M2393-100g
Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate)	Electron Microscopy Sciences-EMS, USA	15320
Nadic Methyl Anhydride (NMA)	Ladd Research Industries, USA	21350
Osmium tetroxide 2%	Merck, Germany	19172
Propylene oxide (1.2-epoxypropane)	Sigma, France	82320-250ML
Saline injectable solution 0.9% NaCl	C.D.M Lavoisier, France	MA 575 420 6
Scalpel Surgical steel blade	Swann-Morton, England	.0508
Sodium tetraborate - Borax	Sigma, France	B-9876
Sucrose	Merck, Germany	84100-1KG
Syringe filter 0.2µm	Pall Corporation, USA	514-4126
Toluidine blue	Ladd Research Industries, USA	N10-70975
Trimmer EM TRIM2	Leica Microsystems GmbH, Austria	702801
Ultramicrotome Ultracut UCT	Leica Microsystems GmbH, Austria	656201
Uranyl acetate	Ladd Research Industries, USA	23620