In situ Exploration de la mégacaryopoïèse murine à l’aide de la microscopie électronique à transmission

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour analyser l’ultrastructure des mégacaryocytes in situ en utilisant la microscopie électronique à transmission (TEM). Les moelles osseuses murines sont collectées, fixées, incorporées dans de la résine époxy et coupées en sections ultraminces. Après coloration par contraste, la moelle osseuse est observée au microscope TEM à 120 kV.

Résumé

La différenciation et la maturation des mégacaryocytes se produisent en étroite association avec les composants cellulaires et extracellulaires de la moelle osseuse. Ces processus sont caractérisés par l’apparition progressive de structures essentielles dans le cytoplasme mégacaryocytaire telles qu’un noyau polyploïde et polylobulé, un réseau membranaire interne appelé système membranaire de démarcation (DMS) et les granules denses et alpha que l’on trouvera dans les plaquettes circulantes. Dans cet article, nous décrivons un protocole standardisé pour l’étude ultrastructurale in situ des mégacaryocytes murins à l’aide de la microscopie électronique à transmission (TEM), permettant l’identification de caractéristiques clés définissant leur stade de maturation et leur densité cellulaire dans la moelle osseuse. Les moelles osseuses sont rincées, fixées, déshydratées dans de l’éthanol, incorporées dans de la résine plastique et montées pour générer des sections transversales. Des sections semi-minces et minces sont préparées pour les observations histologiques et TEM, respectivement. Cette méthode peut être utilisée pour n’importe quelle cellule de moelle osseuse, dans n’importe quelle installation EM et présente l’avantage d’utiliser de petites tailles d’échantillons permettant la combinaison de plusieurs approches d’imagerie sur la même souris.

Introduction

Les mégacaryocytes sont de grandes cellules polyploïdes spécialisées, localisées dans la moelle osseuse, responsables de la production de^{plaquettes 1}. Ils proviennent de cellules souches hématopoïétiques par un processus de maturation complexe, au cours duquel les précurseurs de mégacaryocytes augmentent progressivement en taille, tout en subissant d’importants changements morphologiques concomitants dans le cytoplasme et le noyau^2. Au cours de la maturation, les mégacaryocytes développent un certain nombre d’éléments structurels distincts, notamment: un noyau polylobulé, des invaginations de la membrane de surface qui forment le système membranaire de démarcation (DMS), une zone périphérique dépourvue d’organites entourés par le réseau cytosquelette à base d’actine et de nombreux organites, notamment des granules de α, des granules denses, des lysosomes et de multiples complexes de Golgi. Au niveau ultrastructural, une modification majeure observée est la compartimentation cytoplasmique en régions discrètes délimitées par le DMS^3. Cet approvisionnement important en membranes alimentera l’extension de longs processus cytoplasmiques dans la phase initiale de la production de plaquettes, qui se remodèleront ensuite en plaquettes à l’intérieur de la circulation. Tout défaut lors de la différenciation et de la maturation des mégacaryocytes peut affecter la production de plaquettes en termes de numération plaquettaire et / ou de fonction plaquettaire.

La microscopie électronique à transmission à couche mince (TEM) est l’approche d’imagerie de choix depuis des décennies, fournissant une ultrastructure de haute qualité de mégacaryocytes qui ont façonné notre compréhension de la physiologie de la thrombopoïèse^4,5. Cet article se concentre sur une méthode TEM standardisée permettant de capturer le processus de biogenèse plaquettaire se produisant in situ dans le microenvironnement natif de la moelle osseuse, qui pourrait également servir de base pour analyser tout type de cellule de moelle osseuse. Nous fournissons des exemples ultrastructuraux du développement de mégacaryocytes de immatures à complètement matures, qui étendent les processus cytoplasmiques dans la microcirculation des sinusoïdes⁶. Nous décrivons également une procédure facile pour quantifier les différentes étapes de maturation des mégacaryocytes, en donnant des instructions sur la régénération et la capacité de production plaquettaire de la moelle osseuse.

Protocole

Toutes les expérimentations animales ont été réalisées conformément aux normes européennes 2010/63/UE et au Comité CREMEAS d’Éthique de l’Expérimentation Animale de l’Université de Strasbourg (Comité Régional d’Ethique en Matière d’Expérimentation Animale Strasbourg). Le protocole est schématiquement illustré à la figure 1.

1. Collecte et fixation de la moelle osseuse ( Figure 1A)

ATTENTION: Cette procédure comprend des substances cancérigènes, mutagènes et / ou toxiques et est effectuée sous une hotte d’extraction chimique. Portez un équipement de protection approprié comme des gants et des lunettes de protection.

1. Préparer la solution fixative composée de 2,5 % de glutaraldéhyde dans un tampon cacodylate (voir Dossier supplémentaire).
2. Collecte de moelle osseuse
   1. Utilisez des souris adultes C57BL/6 de l’un ou l’autre sexe âgées de 12 à 18 semaines. Euthanasier les souris par asphyxie au CO₂ et luxation cervicale.
   2. Avec une paire de ciseaux fins, coupez la peau autour de la cuisse et utilisez une pince à épiler pour décoller la peau. Retirez l’extrémité de la patte, puis coupez entre la hanche et la cuisse. Détacher le tibia du fémur en coupant l’articulation du genou et enlever le tissu adhérent sur le tibia et le fémur à l’aide d’un scalpel.
   3. Retirez les épiphyses avec une lame de rasoir tranchante. Tout en tenant le fémur avec une pince à épiler, utilisez une seringue de 5 mL remplie de tampon cacodylate avec une aiguille de 21 G pour rincer la moelle osseuse dans un tube de 15 mL rempli de tampon cacodylate de 2 mL. Pour ce faire, insérez le biseau de l’aiguille dans l’ouverture de la moelle osseuse et appuyez lentement sur le piston jusqu’à ce que la moelle soit expulsée.
3. Fixation de la moelle osseuse par immersion rapide dans le fixateur.
   1. Immédiatement après le rinçage, utilisez une pipette en plastique pour transférer le cylindre de moelle osseuse dans 1 mL de solution fixatrice de glutaraldéhyde frais (préalablement préparé au point 1.1) pendant 60 min à température ambiante.
      REMARQUE: Pour préserver le tissu, assurez-vous que l’ensemble du processus, de la dissection osseuse à l’étape de fixation, est terminé en moins de 10 minutes. Pour la fixation, assurez-vous que la solution fixatrice est à température ambiante pour éviter les chocs thermiques.

2. Incorporer la moelle osseuse dans l’agarose

REMARQUE: Le tissu de la moelle osseuse n’est pas suffisamment cohésif pour maintenir son intégrité pendant les différentes étapes de lavage et le matériau peut être facilement perdu. Pour surmonter ce problème, la moelle est recouverte d’un gel de gélose avant la déshydratation.

1. Préparez la solution d’agarose comme décrit dans le dossier supplémentaire.
2. Laver la moelle fixe de la section 1.3 dans un tampon cacodylate et la transférer soigneusement sur une lame de verre à l’aide d’une pipette en plastique. À l’aide d’une pipette chaude, appliquez rapidement une goutte de gélose liquide à 2 % sur le cylindre de moelle osseuse.
   REMARQUE: La gélose se solidifie rapidement pendant le refroidissement. Pour assurer un revêtement homogène de la moelle osseuse, la solution d’agar doit être maintenue au chaud jusqu’à ce qu’elle soit déposée sur la lame.
3. Placez rapidement la lame sur la glace jusqu’à ce que la gélose se solidifie (1-2 min).
4. Au microscope, utilisez une lame de rasoir tranchante pour couper et jeter les extrémités du cylindre de moelle osseuse en raison de la compression tissulaire possible dans ces zones. Transférer les blocs de moelle dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL contenant 1 mL de tampon cacodylate.

3. Incorporer la moelle osseuse dans la résine

ATTENTION : Les composants de résine sont toxiques; certains sont cancérigènes et doivent être manipulés avec soin sous une hotte d’extraction chimique. Utilisez un équipement de protection approprié comme des gants et des lunettes de protection. Le tétroxyde d’osmium est très volatil à température ambiante et ses vapeurs sont très nocives pour les yeux, le nez et la gorge. Avant d’être jeté, 2% de tétroxyde d’osmium doit être neutralisé en ajoutant deux fois son volume d’huile végétale.

1. Préparez la résine époxy comme décrit dans le dossier supplémentaire.
2. Intégration de résine
   REMARQUE: Conserver les échantillons dans les mêmes tubes de microcentrifugation pendant les incubations dans des bains successifs d’osmium, d’acétate d’uranyle et d’éthanol. Aspirer les surnageants avec une pipette Pasteur. Le volume de solution utilisé pour chaque bain doit être égal à au moins 10 fois le volume de l’échantillon.
   1. Post-fixer les blocs avec 1% d’osmium dans un tampon cacodylate pendant 1 h à 4 °C, laver une fois dans un tampon cacodylate puis une fois dans de l’eau distillée.
   2. Tacher avec 4% d’acétate d’uranyle dans de l’eau distillée pendant 1 h, laver deux fois dans de l’eau distillée.
   3. Déshydrater à travers une série graduée d’éthanol dans de l’eau distillée : 4 fois dans de l’éthanol à 75 % pendant 5 min, suivi de 3 fois dans de l’éthanol à 95 % pendant 20 min, puis 3 fois dans de l’éthanol à 100 % pendant 20 min. À cette étape, sortez une seringue de résine époxy du congélateur.
      REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause dans de l’éthanol à 100% pendant 1 h.
   4. Pour obtenir une infiltration et une polymérisation uniformes de la résine époxy à l’intérieur de la moelle, incuber d’abord les blocs dans 2 bains successifs d’oxyde de propylène pendant 15 min.
   5. Ajouter un mélange 1:1 d’oxyde de propylène à 100% et de résine époxy et incuber pendant 1 h. Placez les échantillons sur un agitateur rotatif lent à température ambiante.
   6. Ajouter 100% de résine époxy laisser l’échantillon pour une incubation de nuit sous agitation.
   7. Ajouter 100% résine époxy pendant 2 h d’incubation, toujours sous agitation.
   8. Sous un microscope, placez les blocs de moelle dans des moules plats en silicone. Orienter les échantillons pour permettre une coupe transversale ultérieure de l’ensemble de la moelle osseuse. Remplissez les moules avec de la résine époxy et placez-les à 60 °C pendant 48 h.
      REMARQUE: Toutes les solutions (à l’exception de l’éthanol et de l’oxyde de propylène) sont filtrées à travers un filtre de 0,22 μm pour éviter la contamination des échantillons. Pour assurer une polymérisation adéquate de la résine, évitez les bulles lors du remplissage des moules.

4. Sectionnement ultramince (Figure 1B)

REMARQUE: La transmission EM nécessite de fines sections tissulaires à travers lesquelles les électrons peuvent passer générant une image de projection de l’intérieur des cellules, de la structure et de l’organisation des organites internes (granules, réticulum endoplasmique, Golgi) et de la disposition des membranes cellulaires intracellulaires.

1. Montez le bloc d’échantillon dans un support ultra-microtome. Mettez-le sur le porte-échantillon. Coupez les échantillons à 45° afin d’éliminer l’excès de résine autour du tissu avec une fraise rotative en diamant ou en tungstène.
2. Montez les échantillons sur l’ultramicrotome avec une lame de couteau en diamant équipée d’un réservoir d’eau. Couper des sections transversales de 500 nm et 100 nm d’épaisseur pour les analyses histologiques et TEM, respectivement. Collectez les sections flottantes à la surface de l’eau avec une boucle.
3. Déposez la section de 500 nm d’épaisseur sur une lame de verre et les sections de 100 nm d’épaisseur sur des grilles de cuivre à barres minces de 200 mailles avec un filtre en papier en dessous. Préparez cinq grilles pour une condition : colorez d’abord deux grilles et conservez les trois grilles restantes comme sauvegarde si nécessaire.

5. Coloration au bleu de toluidine pour l’histologie

REMARQUE: Les sections de coloration pour l’histologie sont importantes pour trois raisons: 1) pour s’assurer que le tissu est réellement coupé et non la résine, 2) pour vérifier la qualité de l’inclusion et 3) pour évaluer rapidement l’échantillon de moelle. Si ce n’est pas correct, coupez plus profondément dans le bloc.

1. Sécher les sections semi-minces sur une plaque chauffante (60 °C).
2. Ajouter 1 % de bleu de toluidine filtré/1 % de borate de sodium dans l’eau distillée sur les lames et chauffer sur une plaque chauffante (60 °C) pendant 1-2 min. Lavez les lames avec de l’eau distillée et laissez-les sécher sur la plaque chauffante.
3. Montez des sections sur des couvercles avec une goutte de milieu de montage en poly(méthacrylate de butyle-co-méthacrylate de méthyle) et examinez au microscope optique.

6. Coloration des métaux lourds pour l’observation tem (Figure 1C)

REMARQUE: Pour le contraste, la face supérieure des grilles est inversée sur des gouttes de 100 μL de chaque bain successif avec une boucle. Avant utilisation, chaque solution est filtrée à 0,22 μm. Retirez l’excès de liquide entre chaque bain en contactant doucement le côté de la grille sur un papier filtre.

1. Tacher avec 4% d’acétate d’uranyle dans de l’eau distillée pendant 5 min.
2. Laver 3 fois à l’eau distillée pendant 5 min.
3. Tacher avec du citrate de plomb pendant 3 min.
4. Laver 3 fois à l’eau distillée pendant 5 min.
5. Déposez les grilles par le côté inférieur au contact du papier filtre pour les laisser sécher.
   REMARQUE: Les métaux lourds réagissent en présence de dioxyde de carbone. Pour minimiser les précipités, évitez le déplacement de l’air pendant le contraste, ne parlez pas, gardez l’environnement calme et éteignez la climatisation.

7. TEM (Figure 1E)

REMARQUE: Les sections sont introduites dans un microscope TEM et examinées à 120 kV.

1. Examinez d’abord les sections à faible grossissement (< 500x) pour apprécier l’aspect général de la préparation (absence de trou dans la résine, plis / compression dans les sections, précipités dus à la coloration).
2. Examinez ensuite les sections à grossissement plus élevé (~ 2000x permettant de distinguer le stade de maturation). Comptez manuellement les mégacaryocytes de chaque étape de maturation sur des sections transversales entières (voir Résultats représentatifs sur la façon d’identifier visuellement chaque étape).
   REMARQUE: Chaque carré des grilles est défini comme une zone à examiner (ce qui équivaut à 16000 μm2 pour les grilles de cuivre à 200 mailles).
3. Pour évaluer le nombre de mégacaryocytes, quantifiez uniquement les carrés qui sont entièrement recouverts d’une section. Pour ce faire, utilisez un modèle basé sur le criblage des gammes. Observez une première gamme de carrés d’une extrémité de la section à une autre, puis une autre plage de la même manière, etc. En utilisant cette procédure, cribillez complètement et systématiquement toute la section transversale de la moelle carré par carré.
4. Pour chaque carré, notez le nombre de mégacaryocytes de stade I, II ou III.
   REMARQUE: Des grossissements plus élevés sont nécessaires pour analyser les granules, l’organisation du DMS, la taille des territoires cytoplasmiques et le noyau polylobulé.

Résultats

Histologie de la moelle osseuse
L’observation de l’histologie bleue de la toluidine de la moelle osseuse au microscope optique est essentielle pour analyser rapidement l’architecture tissulaire globale en termes de compacité tissulaire, de continuité des microveux, ainsi que de taille et de forme des mégacaryocytes (Figure 1D). Il est effectué avant les sections ultraminces pour déterminer la nécessité de couper plus profondément dans le blo...

Discussion

L’examen direct des mégacaryocytes dans leur environnement natif est essentiel pour comprendre la mégacaryopoïèse et la formation de plaquettes. Dans ce manuscrit, nous fournissons une méthode de microscopie électronique à transmission combinant le rinçage de la moelle osseuse et la fixation par immersion, permettant de disséquer in situ les caractéristiques morphologiques de l’ensemble du processus de morphogenèse des mégacaryocytes se déroulant dans la moelle osseuse.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30)	Ladd Research Industries, USA	21310
Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar	Electron Microscopy Sciences, USA	1670-B
CaCl2 Calcium chloride hexahydrate	Merck, Germany	2083
Copper grids 200 mesh thin-bar	Oxford Instrument, Agar Scientifics, England	T200-CU
Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate	Merck, Germany	8.20670.0250
Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA)	Ladd Research Industries, USA	21340
Double Edge Stainless Razor blade	Electron Microscopy Sciences-EMS, USA	EM-72000
Ethanol absolut	VWR International, France	20821296
Filter paper, 90 mm diameter	Whatman, England	512-0326
Flat embedding silicone mould	Oxford Instrument, Agar Scientific, England	G3533
Glutaraldehyde 25%	Electron Microscopy Sciences-EMS, USA	16210
Heat plate Leica EMMP	Leica Microsystems GmbH, Austria	705402
Histo Diamond Knife 45°	Diatome, Switzerland	1044797
JEOL 2100 Plus TEM microscope	JEOL, Japan	EM-21001BU
Lead citrate - Ultrostain 2	Leica Microsystems GmbH, Austria	70 55 30 22
LX-112 resin	Ladd Research Industries, USA	21310
MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate	Sigma, France	M2393-100g
Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate)	Electron Microscopy Sciences-EMS, USA	15320
Nadic Methyl Anhydride (NMA)	Ladd Research Industries, USA	21350
Osmium tetroxide 2%	Merck, Germany	19172
Propylene oxide (1.2-epoxypropane)	Sigma, France	82320-250ML
Saline injectable solution 0.9% NaCl	C.D.M Lavoisier, France	MA 575 420 6
Scalpel Surgical steel blade	Swann-Morton, England	.0508
Sodium tetraborate - Borax	Sigma, France	B-9876
Sucrose	Merck, Germany	84100-1KG
Syringe filter 0.2µm	Pall Corporation, USA	514-4126
Toluidine blue	Ladd Research Industries, USA	N10-70975
Trimmer EM TRIM2	Leica Microsystems GmbH, Austria	702801
Ultramicrotome Ultracut UCT	Leica Microsystems GmbH, Austria	656201
Uranyl acetate	Ladd Research Industries, USA	23620