АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол анализа ультраструктуры мегакариоцитов in situ с помощью просвечивающих электронных микроскопий (ТЭМ). Мышиные косточки собирают, фиксируют, встраивают в эпоксидную смолу и разрезают на ультратонкие срезы. После контрастного окрашивания костный мозг наблюдается под микроскопом ТЭМ на 120 кВ.

Аннотация

Дифференцировка и созревание мегакариоцитов происходят в тесной связи с клеточными и внеклеточными компонентами костного мозга. Эти процессы характеризуются постепенным появлением в цитоплазме мегакариоцитов существенных структур, таких как полиплоидное и полигобулированное ядро, внутренняя мембранная сеть, называемая демаркационной мембранной системой (DMS), и плотные и альфа-гранулы, которые будут найдены в циркулирующих тромбоцитах. В этой статье мы описываем стандартизированный протокол ультраструктурного исследования in situ мышиных мегакариоцитов с использованием просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ), позволяющий идентифицировать ключевые характеристики, определяющие стадию их созревания и клеточную плотность в костном мозге. Костный мозг промывывается, фиксируется, обезвоживается в этаноле, внедряется в пластиковую смолу и монтируется для создания поперечных сечений. Полутонкие и тонкие срезы подготовлены для гистологических и ТЕА наблюдений соответственно. Этот метод может быть использован для любой клетки костного мозга, в любом электромагнитном объекте и имеет преимущество использования небольших размеров выборки, позволяющих комбинировать несколько подходов к визуализации на одной мыши.

Введение

Мегакариоциты представляют собой специализированные крупные полиплоидные клетки, локализованные в костном мозге, отвечающие за выработку тромбоцитов1. Они происходят из гемопоэтических стволовых клеток посредством сложного процесса созревания, в ходе которого предшественники мегакариоцитов постепенно увеличиваются в размерах, подвергаясь обширным сопутствующим морфологическим изменениям в цитоплазме и ядре2. Во время созревания мегакариоциты развивают ряд различимых структурных элементов, в том числе: полигобулированное ядро, инвагинации поверхностной мембраны, которые образуют демаркационную мембранную систему (DMS), периферическую зону, лишенную органелл, окруженных цитоскелетной сетью на основе актина, и многочисленные органеллы, включая α-гранулы, плотные гранулы, лизосомы и множественные комплексы Гольджи. На ультраструктурном уровне основной наблюдаемой модификацией является цитоплазматическое разделение на дискретные области, разграниченные DMS3. Этот обширный запас мембран будет способствовать расширению длительных цитоплазматических процессов на начальной фазе производства тромбоцитов, которые затем будут ремоконструированы в тромбоциты внутри циркуляции. Любой дефект во время дифференцировки и созревания мегакариоцитов может влиять на выработку тромбоцитов с точки зрения количества тромбоцитов и/или функции тромбоцитов.

Тонкослойная просвечивающая электронная микроскопия (ТЭМ) была подходом к визуализации на протяжении десятилетий, обеспечивая высококачественную ультраструктуру мегакариоцитов, которые сформировали наше понимание физиологии тромбопоизиса4,5. В данной статье основное внимание уделяется стандартизированной методике ТЭМ, позволяющей охватить процесс биогенеза тромбоцитов, происходящий in situ в микросреде нативного костного мозга, который также может служить основой для анализа любого типа клеток костного мозга. Приведены ультраструктурные примеры развития мегакариоцитов от незрелых до полностью зрелых, которые расширяют цитоплазматические процессы в микроциркуляцию синусоид6. Мы также описываем простую процедуру количественной оценки различных стадий созревания мегакариоцитов, инструктируя о регенерации и производительности тромбоцитов костного мозга.

протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с европейскими стандартами 2010/63/EU и Комитетом CREMEAS по этике экспериментов на животных Страсбургского университета (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). Протокол схематически показан на рисунке 1.

1. Сбор и фиксация костного мозга (рисунок 1А)

ВНИМАНИЕ: Эта процедура включает канцерогенные, мутагенные и/или токсичные вещества и выполняется под вытяжкой химической экстракции. Носите соответствующее защитное снаряжение, такое как перчатки и защитные очки.

  1. Готовят фиксаторный раствор, состоящий из 2,5% глутаральдегида в какодилатном буфере (см. Дополнительный файл).
  2. Сбор костного мозга
    1. Используйте взрослых мышей C57BL/6 любого пола в возрасте 12-18 недель. Усыпить мышей путем удушьяCO2 и вывиха шейки матки.
    2. С помощью тонких ножниц отрежьте кожу вокруг бедра и используйте пинцет, чтобы очистить кожу. Удалите конечность лапы, а затем разрезайте между бедром и бедром. Отсоединять большеберцовую кость от бедренной кости путем разрезания коленного сустава и удалить адгезивную ткань на большеберцовой и бедренной голенях с помощью скальпеля.
    3. Удалите эпифизы острым лезвием бритвы. Удерживая бедренную кость пинцетом, используйте шприц 5 мл, заполненный какодилатным буфером с иглой 21 г, чтобы промыть костный мозг в трубку 15 мл, заполненную буфером какодилата 2 мл. Для этого вставьте скос иглы в отверстие костного мозга и медленно нажимайте на поршень до тех пор, пока костный мозг не будет изгнан.
  3. Фиксация костного мозга путем быстрого погружения в фиксатор.
    1. Сразу после промывки используйте пластиковую пипетку для переноса цилиндра костного мозга в 1 мл свежего фиксаторного раствора глутаральдегида (предварительно приготовленного в 1,1) в течение 60 мин при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сохранить ткань, убедитесь, что весь процесс, от рассечения кости до этапа фиксации, завершен менее чем за 10 минут. Для фиксации убедитесь, что фиксатор находится при комнатной температуре, чтобы избежать теплового удара.

2. Встраивание костного мозга в агарозу

ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань костного мозга недостаточно сплочена, чтобы сохранить ее целостность во время различных этапов промывки, и материал может быть легко потерян. Чтобы преодолеть эту проблему, костный мозг перед обезвоживанием покрывают гелем агара.

  1. Подготовьте раствор агарозы, как описано в дополнительном файле.
  2. Вымойте неподвижный костный мозг из секции 1.3 в какодилатном буфере и аккуратно переложите его на стеклянную горку с помощью пластиковой пипетки. Используя теплую пипетку, быстро нанесите каплю 2% жидкого агара на цилиндр костного мозга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Агар быстро затвердеет при охлаждении. Чтобы обеспечить однородное покрытие костного мозга, раствор агара необходимо держать в тепле до тех пор, пока он не будет нанесен на горку.
  3. Быстро поместите горку на лед до затверденья (1-2 мин).
  4. Под микроскопом используйте острое лезвие бритвы, чтобы разрезать и отбросить конечности цилиндра костного мозга из-за возможного сжатия ткани в этих областях. Переложить блоки костного мозга в микроцентрифужные трубки по 1,5 мл, содержащие 1 мл какодилатного буфера.

3. Встраивание костного мозга в смолу

ВНИМАНИЕ: Компоненты смолы токсичны; некоторые из них являются канцерогенными и должны обрабатываться с осторожностью под вытяжкой химической экстракции. Используйте соответствующие защитные средства, такие как перчатки и защитные очки. Тетроксид осмия очень летучий при комнатной температуре, и его пары очень вредны для глаз, носа и горла. Перед выбросом 2% тетроксида осмия необходимо нейтрализовать, добавив в два раза объем растительного масла.

  1. Подготовьте эпоксидную смолу, как описано в дополнительном файле.
  2. Встраивание смолы
    ПРИМЕЧАНИЕ: Храните образцы в одних и тех же микроцентрифужных трубках во время инкубации в последовательных ваннах с осмием, уранилацетатом и этанолом. Аспирировать супернатанты пипеткой Пастера. Объем раствора, используемого для каждой ванны, должен быть не менее чем в 10 раз больше объема образца.
    1. Постфиксируют блоки с 1% осмия в какодилатном буфере в течение 1 ч при 4 °C, промыть один раз в какодилатном буфере, а затем один раз в дистиллированной воде.
    2. Окрашивание 4% уранилацетатом в дистиллированной воде в течение 1 ч, дважды промыть в дистиллированной воде.
    3. Обезвоживание через градуированный ряд этанола в дистиллированной воде: 4 раза в 75% этаноле в течение 5 мин, затем 3 раза в 95% этаноле в течение 20 мин и затем 3 раза в 100% этаноле в течение 20 мин. На этом этапе выньте из морозильной камеры один шприц эпоксидной смолы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен в 100% этаноле в течение 1 ч.
    4. Для получения равномерной инфильтрации и полимеризации эпоксидной смолы внутри костного мозга инкубируют сначала блоки в 2 последовательных ваннах оксида пропилена в течение 15 мин.
    5. Добавьте смесь 1:1 из 100% оксида пропилена и эпоксидной смолы и инкубируют в течение 1 ч. Поместите образцы на медленный вращающийся шейкер при комнатной температуре.
    6. Добавьте 100% эпоксидную смолу, оставьте образец для ночной инкубации под перемешиванием.
    7. Добавьте 100% эпоксидную смолу в течение 2 ч инкубации, еще при перемешивании.
    8. Под микроскопом поместите блоки костного мозга в плоские силиконовые формы. Ориентируйте образцы, чтобы обеспечить последующее поперечным сечением всего костного мозга. Заполните формы эпоксидной смолой и поместите их при 60 °C в течение 48 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все растворы (за исключением этанола и оксида пропилена) фильтруются через фильтр 0,22 мкм во избежание загрязнения образцов. Чтобы обеспечить адекватную полимеризацию смолы, избегайте пузырьков при заполнении форм.

4. Ультратонкое сечение(рисунок 1B)

ПРИМЕЧАНИЕ: Передача ЭМ требует тонких тканевых участков, через которые электроны могут проходить, генерируя проекционное изображение внутренней части клеток, структуры и организации внутренних органелл (гранул, эндоплазматический ретикулум, Гольджи) и расположения внутриклеточных клеточных мембран.

  1. Установите блок образцов в ультрамикротомную опору. Положите его на держатель образца. Обрежьте образцы под 45°, чтобы удалить избыток смолы вокруг ткани с помощью вращающегося алмазного или вольфрамового фреза.
  2. Установите образцы на ультрамикротом с помощью лезвия алмазного ножа, оснащенного резервуаром для воды. Разрезайте поперечные срезы толщиной 500 нм и 100 нм для гистологического и ТЕА-анализа соответственно. Соберите плавающие секции на поверхности воды с помощью петли.
  3. Нанесите участок толщиной 500 нм на стеклянную горку и секции толщиной 100 нм на 200-сетчатые тонкополосные медные сетки с бумажным фильтром под ним. Подготовьте пять сеток для одного условия: сначала окрасьте две сетки и сохраните три оставшиеся сетки в качестве резервной копии, если это необходимо.

5. Окрашивание толуидином синего цвета для гистологии

ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание срезов для гистологии важно по трем причинам: 1) чтобы убедиться, что ткань действительно разрезана, а не смола, 2) чтобы проверить качество включения и 3) быстро оценить образец костного мозга. Если это не так, срежьте глубже в блоке.

  1. Высушите полутонкие секции скользить на тепловой пластине (60 °C).
  2. Добавить фильтрованный 1% толуидин синего/1% бората натрия в дистиллированную воду на горках и нагревать на конфорке (60 °C) в течение 1-2 мин. Вымойте горки дистиллированной водой и дайте высохнуть на нагревательной пластине.
  3. Монтировать секции на крышки с каплей поли(бутилметакрилата-со-метилметакрилата) монтажной среды и исследовать под световым микроскопом.

6. Окрашивание тяжелых металлов для наблюдения ТЕА(рисунок 1С)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для контраста верхняя сторона сеток перевернута на 100 мкл капель каждой последующей ванны с петлей. Перед использованием каждый раствор фильтруется на 0,22 мкм. Удалите избыток жидкости между каждой ванной, осторожно контактив со стороны сетки на фильтровальной бумаге.

  1. Окрашивание 4% уранилацетатом в дистиллированной воде в течение 5 мин.
  2. Промыть 3 раза в дистиллированной воде в течение 5 мин.
  3. Окрашивание свинцом цитрата в течение 3 мин.
  4. Промыть 3 раза в дистиллированной воде в течение 5 мин.
  5. Нанесите сетки на нижнюю сторону в контакт с фильтровальной бумагой, чтобы они высохли.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция реакции тяжелых металлов в присутствии углекислого газа. Чтобы свести к минимуму осадки, избегайте смещения воздуха во время контраста, не говорите, сохраняйте спокойствие окружающей среды и выключите кондиционер.

7. ТЕА(рисунок 1Е)

ПРИМЕЧАНИЕ: Срезы вводятся в микроскоп ТЕА и исследуются при 120 кВ.

  1. Сначала осмотрите срезы при малом увеличении (< 500х), чтобы оценить общий аспект подготовки (отсутствие отверстия в смоле, складки/сжатие в срезах, осадки из-за окрашивания).
  2. Затем осмотрите участки при большем увеличении (~ 2000х, что позволяет различить стадию созревания). Подсчитывайте вручную мегакариоциты с каждой стадии созревания по целым поперечным слочкам (см. Репрезентативные результаты о том, как визуально идентифицировать каждую стадию).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый квадрат сетки определяется как площадь для исследования (которая равна 16000 мкм2 для 200-сетчатых медных сеток).
  3. Чтобы оценить количество мегакариоцитов, количественно оценивайте только квадраты, которые полностью покрыты сечением. Для этого используйте модель, основанную на скрининге диапазонов. Наблюдайте первый диапазон квадратов от оконечности сечения к другому, затем другой диапазон таким же образом и т.д. Используя эту процедуру, полностью и систематически просеивайте весь поперечный участок костного мозга квадрат за квадратом.
  4. Для каждого квадрата начисляйте количество мегакариоцитов I, II или III стадии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокие увеличения необходимы для анализа гранул, организации DMS, размера цитоплазматических территорий и полилобулированного ядра.

Результаты

Гистология костного мозга
Наблюдение за гистологией толуидинового синего цвета костного мозга под световым микроскопом является ключом к быстрому анализу общей архитектуры ткани с точки зрения, например, компактности тканей, непрерывности микрососудов, а также размера и ф...

Обсуждение

Непосредственное исследование мегакариоцитов в их родной среде имеет важное значение для понимания мегакариопоэтиса и образования тромбоцитов. В данной рукописи представлен метод просвечивающей электронной микроскопии, сочетающий промывку костного мозга и фиксацию погружением, по...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Фабьен Проамер, Жан-Ива Ринкеля, Давида Хоффмана, Моник Фройнд за техническую помощь. Эта работа была поддержана ARMESA (Ассоциация исследований и развития в области медицины и санте), Европейским союзом через Европейский фонд регионального развития (ERDF) и грантом ANR-17-CE14-0001-01 H.d.S.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30)Ladd Research Industries, USA21310
Agarose type LM-3 Low Melting Point AgarElectron Microscopy Sciences, USA1670-B
CaCl2 Calcium chloride hexahydrateMerck, Germany2083
Copper grids 200 mesh thin-barOxford Instrument, Agar Scientifics, EnglandT200-CU
Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrateMerck, Germany8.20670.0250
Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA)Ladd Research Industries, USA21340
Double Edge Stainless Razor bladeElectron Microscopy Sciences-EMS, USAEM-72000
Ethanol absolutVWR International, France20821296
Filter paper, 90 mm diameterWhatman, England512-0326
Flat embedding silicone mouldOxford Instrument, Agar Scientific, EnglandG3533
Glutaraldehyde 25%Electron Microscopy Sciences-EMS, USA16210
Heat plate Leica EMMPLeica Microsystems GmbH, Austria705402
Histo Diamond Knife 45°Diatome, Switzerland1044797
JEOL 2100 Plus TEM microscopeJEOL, JapanEM-21001BU
Lead citrate - Ultrostain 2Leica Microsystems GmbH, Austria70 55 30 22
LX-112 resinLadd Research Industries, USA21310
MgCl2 Magnesium chloride hexahydrateSigma, FranceM2393-100g
Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate)Electron Microscopy Sciences-EMS, USA15320
Nadic Methyl Anhydride (NMA)Ladd Research Industries, USA21350
Osmium tetroxide 2%Merck, Germany19172
Propylene oxide (1.2-epoxypropane)Sigma, France82320-250ML
Saline injectable solution 0.9% NaClC.D.M Lavoisier, FranceMA 575 420 6
Scalpel Surgical steel bladeSwann-Morton, England.0508
Sodium tetraborate - BoraxSigma, FranceB-9876
SucroseMerck, Germany84100-1KG
Syringe filter 0.2µmPall Corporation, USA514-4126
Toluidine blueLadd Research Industries, USAN10-70975
Trimmer EM TRIM2Leica Microsystems GmbH, Austria702801
Ultramicrotome Ultracut UCTLeica Microsystems GmbH, Austria656201
Uranyl acetateLadd Research Industries, USA23620

Ссылки

  1. Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
  2. Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1). American Journal of Pathology. 134 (6), 9 (1989).
  3. Eckly, A., et al. Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes. Blood. 123 (6), 921-930 (2014).
  4. Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. , 1-10 (2020).
  5. Behnke, O., Forer, A. From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream. European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).
  6. Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).
  7. Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels. Life Science Alliance. 1 (2), 201800061 (2018).
  8. Eckly, A., et al. Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids. Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024 (2020).
  9. Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
  10. Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet α-Granules. Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).
  11. Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92 (2017).
  12. Centurione, L., et al. Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice. Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).
  13. Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
  14. Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

175in situ

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены