In situ Exploración de la megacariopoyesis murina mediante microscopía electrónica de transmisión

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para analizar la ultraestructura de los megacariocitos in situ utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM). Las médulas óseas murinas se recogen, se fijan, se incrustan en resina epoxi y se cortan en secciones ultrafinas. Después de la tinción por contraste, la médula ósea se observa bajo un microscopio TEM a 120 kV.

Resumen

La diferenciación y maduración de los megacariocitos se producen en estrecha asociación con los componentes celulares y extracelulares de la médula ósea. Estos procesos se caracterizan por la aparición gradual de estructuras esenciales en el citoplasma de megacariocitos, como un núcleo poliploide y polilobulado, una red de membrana interna llamada sistema de membrana de demarcación (DMS) y los gránulos densos y alfa que se encontrarán en las plaquetas circulantes. En este artículo, describimos un protocolo estandarizado para el estudio ultraestructural in situ de megacariocitos murinos utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM), que permite la identificación de características clave que definen su etapa de maduración y densidad celular en la médula ósea. Las médulas óseas se enjuagan, se fijan, se deshidratan en etanol, se incrustan en resina plástica y se montan para generar secciones transversales. Las secciones semidelgado y delgado se preparan para observaciones histológicas y TEM, respectivamente. Este método se puede utilizar para cualquier célula de la médula ósea, en cualquier instalación de EM y tiene la ventaja de utilizar tamaños de muestra pequeños que permiten la combinación de varios enfoques de imagen en el mismo ratón.

Introducción

Los megacariocitos son células poliploides grandes especializadas, localizadas en la médula ósea, responsables de la producción^{plaquetaria 1}. Se originan a partir de células madre hematopoyéticas a través de un intrincado proceso de maduración, durante el cual los precursores de megacariocitos aumentan progresivamente de tamaño, mientras sufren extensos cambios morfológicos concomitantes en el citoplasma y el núcleo^2. Durante la maduración, los megacariocitos desarrollan una serie de elementos estructurales distinguibles que incluyen: un núcleo polilobulado, invaginaciones de la membrana superficial que forman el sistema de membrana de demarcación (DMS), una zona periférica desprovista de orgánulos rodeada por la red citoesquelética basada en actina y numerosos orgánulos que incluyen gránulos α, gránulos densos, lisosomas y múltiples complejos de Golgi. A nivel ultraestructural, una modificación importante observada es la compartimentación citoplasmática en regiones discretas delimitadas por el DMS^3. Este extenso suministro de membranas alimentará la extensión de largos procesos citoplasmáticos en la fase inicial de la producción de plaquetas, que luego se remodelarán en plaquetas dentro de la circulación. Cualquier defecto durante la diferenciación y maduración de megacariocitos puede afectar la producción de plaquetas en términos de recuento de plaquetas y / o función plaquetaria.

La microscopía electrónica de transmisión de capa delgada (TEM) ha sido el enfoque de imagen de elección durante décadas proporcionando una ultraestructura de alta calidad de megacariocitos que han dado forma a nuestra comprensión de la fisiología de la trombopoyesis^4,5. Este artículo se centra en un método TEM estandarizado que permite capturar el proceso de biogénesis plaquetaria que ocurre in situ dentro del microambiente de la médula ósea nativa, que también podría servir como base para analizar cualquier tipo de célula de la médula ósea. Proporcionamos ejemplos ultraestructurales del desarrollo de megacariocitos desde inmaduros hasta completamente maduros, que extienden los procesos citoplasmáticos en la microcirculación de sinusoides⁶. También describimos un procedimiento fácil para cuantificar las diferentes etapas de maduración de los megacariocitos, instruyendo sobre la regeneración y la capacidad de producción de plaquetas de la médula ósea.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las normas europeas 2010/63/EU y el Comité CREMEAS sobre la Ética de los Experimentos con Animales de la Universidad de Estrasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). El protocolo se muestra esquemáticamente en la Figura 1.

1. Recolección y fijación de médula ósea ( Figura 1A)

PRECAUCIÓN: Este procedimiento incluye sustancias cancerígenas, mutagénicas y / o tóxicas y se realiza bajo una campana de extracción química. Use el equipo de protección adecuado, como guantes y gafas de protección.

1. Preparar la solución fijadora que consiste en glutaraldehído al 2,5% en tampón de cacodilato (ver Archivo Complementario).
2. Recolección de médula ósea
   1. Use ratones adultos C57BL / 6 de cualquier sexo de 12 a 18 semanas de edad. Sacrificar a los ratones por asfixia de CO₂ y luxación cervical.
   2. Con un par de tijeras delgadas, corte la piel alrededor del muslo y use pinzas para pelar la piel. Retire la extremidad de la pata y luego corte entre la cadera y el muslo. Separe la tibia del fémur cortando la articulación de la rodilla y elimine el tejido adherente en las tibias y los fémures mediante el uso de un bisturí.
   3. Retire las epífisis con una cuchilla de afeitar afilada. Mientras sostiene el fémur con pinzas, use una jeringa de 5 ml llena de tampón de cacodilato con una aguja de 21 G para enjuagar la médula ósea en un tubo de 15 ml lleno de tampón de cacodilato de 2 ml. Para hacerlo, inserte el bisel de la aguja en la abertura de la médula ósea y presione lentamente el émbolo hasta que se expulse la médula.
3. Fijación de la médula ósea por inmersión rápida en fijador.
   1. Inmediatamente después del lavado, use una pipeta de plástico para transferir el cilindro de médula ósea a 1 ml de solución fijadora de glutaraldehído fresco (previamente preparada en 1.1) durante 60 min a temperatura ambiente.
      NOTA: Para preservar el tejido, asegúrese de que todo el proceso, desde la disección ósea hasta la etapa de fijación, se complete en menos de 10 minutos. Para la fijación, asegúrese de que la solución fijadora esté a temperatura ambiente para evitar el choque térmico.

2. Incrustación de médula ósea en agarosa

NOTA: El tejido de la médula no está lo suficientemente cohesionado para mantener su integridad durante los diferentes pasos de lavado y el material se puede perder fácilmente. Para superar este problema, la médula se cubre con un gel de agar antes de la deshidratación.

1. Prepare la solución de agarosa como se describe en el Archivo Complementario.
2. Lave la médula fija de la sección 1.3 en tampón de cacodilato y transfiérala cuidadosamente a un portaobjetos de vidrio con una pipeta de plástico. Usando una pipeta tibia, aplique rápidamente una gota de agar líquido al 2% en el cilindro de médula ósea.
   NOTA: El agar se solidifica rápidamente mientras se enfría. Para asegurar una cubierta homogénea de la médula ósea, la solución de agar debe mantenerse caliente hasta que se deposite en el portaobjetos.
3. Coloque rápidamente el tobogán rápidamente sobre hielo hasta que el agar se solidifique (1-2 min).
4. Bajo un microscopio, use una cuchilla de afeitar afilada para cortar y desechar las extremidades del cilindro de la médula ósea debido a la posible compresión del tejido en estas áreas. Transfiera los bloques de médula en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml que contengan 1 ml de tampón de cacodilato.

3. Incrustación de médula ósea en resina

PRECAUCIÓN: Los componentes de resina son tóxicos; algunos son cancerígenos y deben manipularse con cuidado bajo una campana de extracción química. Use el equipo de protección adecuado, como guantes y gafas de protección. El tetróxido de osmio es altamente volátil a temperatura ambiente y sus vapores son muy dañinos para los ojos, la nariz y la garganta. Antes de ser desechado, el tetróxido de osmio al 2% debe neutralizarse agregando el doble de su volumen de aceite vegetal.

1. Preparar la resina epoxi como se describe en el Archivo Complementario.
2. Incrustación de resina
   NOTA: Mantenga las muestras en los mismos tubos de microcentrífuga durante las incubaciones en baños sucesivos de osmio, acetato de uranilo y etanol. Aspirar los sobrenadantes con una pipeta Pasteur. El volumen de solución utilizado para cada baño debe ser igual al menos 10 veces el volumen de la muestra.
   1. Después de fijar los bloques con 1% de osmio en tampón de cacodilato durante 1 h a 4 °C, lavar una vez en tampón de cacodilato y luego una vez en agua destilada.
   2. Manche con acetato de uranilo al 4% en agua destilada durante 1 h, lave dos veces en agua destilada.
   3. Deshidratar a través de una serie graduada de etanol en agua destilada: 4 veces en etanol al 75% durante 5 min, seguido de 3 veces en etanol al 95% durante 20 min y luego 3 veces en etanol al 100% durante 20 min. En este paso, saque una jeringa de resina epoxi del congelador.
      NOTA: El protocolo se puede pausar en etanol al 100% durante 1 h.
   4. Para obtener una infiltración y polimerización uniformes de resina epoxi dentro de la médula, incube primero los bloques en 2 baños sucesivos de óxido de propileno durante 15 min.
   5. Añadir una mezcla 1:1 de óxido de propileno 100% y resina epoxi e incubar durante 1 h. Coloque las muestras en un agitador rotativo lento a temperatura ambiente.
   6. Añadir resina epoxi 100% dejar la muestra para incubación durante la noche bajo agitación.
   7. Añadir resina epoxi 100% durante 2 h de incubación, aún bajo agitación.
   8. Bajo un microscopio, coloque los bloques de médula en moldes planos de silicona. Orientar las muestras para permitir la posterior seccionamiento transversal de toda la médula ósea. Llenar los moldes con resina epoxi y colocarlos a 60 °C durante 48 h.
      NOTA: Todas las soluciones (excepto el etanol y el óxido de propileno) se filtran a través de un filtro de 0,22 μm para evitar la contaminación de las muestras. Para garantizar una polimerización adecuada de la resina, evite las burbujas mientras llena los moldes.

4. Seccionamiento ultrafino (Figura 1B)

NOTA: La EM de transmisión requiere secciones de tejido delgadas a través de las cuales los electrones pueden pasar generando una imagen de proyección del interior de las células, la estructura y la organización de los orgánulos internos (gránulos, retículo endoplásmico, Golgi) y la disposición de las membranas celulares intracelulares.

1. Monte el bloque de muestra en un soporte de ultra-microtomo. Póngalo en el soporte de la muestra. Recorte las muestras a 45° para eliminar el exceso de resina alrededor del tejido con un cortador de fresado giratorio de diamante o tungsteno.
2. Monte las muestras en el ultramicrotomo con una hoja de cuchillo de diamante equipada con un tanque de agua. Corte de secciones transversales de espesor de 500 nm y 100 nm para análisis histológicos y TEM, respectivamente. Recoge secciones flotantes en la superficie del agua con un bucle.
3. Deposite la sección de 500 nm de espesor en un portaobjetos de vidrio y las secciones de 100 nm de espesor en rejillas de cobre de barra delgada de malla 200 con un filtro de papel debajo. Prepare cinco cuadrículas para una condición: manche dos rejillas primero y mantenga las tres cuadrículas restantes como respaldo si es necesario.

5. Tinción azul de toluidina para histología

NOTA: Las secciones de tinción para histología son importantes por tres razones: 1) para asegurarse de que el tejido esté realmente cortado y no la resina, 2) para verificar la calidad de la inclusión, y 3) para evaluar rápidamente la muestra de médula. Si esto no es correcto, corte más profundamente en el bloque.

1. Seque las secciones semifinas sobre una placa de calor (60 °C).
2. Añadir 1% de azul de toluidina filtrado/borato de sodio al 1% en agua destilada en los portaobjetos y calentar en una placa caliente (60 °C) durante 1-2 min. Lave los portaobjetos con agua destilada y déjelo secar en la placa de calor.
3. Monte secciones en la cubiertas con una gota de medio de montaje de poli(metacrilato de butilo-cometilo metacrilato) y examine bajo un microscopio de luz.

6. Tinción de metales pesados para la observación tem (Figura 1C)

NOTA: Para el contraste, la parte superior de las rejillas se invierte en gotas de 100 μL de cada baño sucesivo con un bucle. Antes de su uso, cada solución se filtra a 0,22 μm. Retire el exceso de líquido entre cada baño contactando suavemente el lado de la rejilla en un papel de filtro.

1. Tinción con acetato de uranilo al 4% en agua destilada durante 5 min.
2. Lavar 3 veces en agua destilada durante 5 min.
3. Manchar con citrato de plomo durante 3 min.
4. Lavar 3 veces en agua destilada durante 5 min.
5. Deposite las rejillas por el lado inferior en contacto con el papel de filtro para dejarlas secar.
   NOTA: Los metales pesados reaccionan en presencia de dióxido de carbono. Para minimizar los precipitados, evite el desplazamiento del aire durante el contraste, no hable, mantenga el ambiente tranquilo y apague el aire acondicionado.

7. TEM (Figura 1E)

NOTA: Las secciones se introducen en un microscopio TEM y se examinan a 120 kV.

1. Primero examine las secciones a bajo aumento (< 500x) para apreciar el aspecto general de la preparación (ausencia de agujero en la resina, pliegues / compresión en las secciones, precipitados debido a la tinción).
2. Luego examine las secciones con un aumento más alto (~ 2000x que permite distinguir la etapa de maduración). Contar manualmente los megacariocitos de cada etapa de maduración en secciones transversales enteras (ver Resultados representativos sobre cómo identificar visualmente cada etapa).
   NOTA: Cada cuadrado de las rejillas se define como un área para el examen (que equivale a 16000 μm2 para 200 rejillas de cobre de malla).
3. Para evaluar el número de megacariocitos, cuantifique solo los cuadrados que están completamente cubiertos con una sección. Para ello, utilice un modelo basado en el cribado de rangos. Observe un primer rango de cuadrados de una extremidad de la sección a otra, luego otro rango de la misma manera, etc. Utilizando este procedimiento, evalúe completa y sistemáticamente toda la sección transversal de la médula cuadrado por cuadrado.
4. Para cada cuadrado, puntúe el número de megacariocitos en estadio I, II o III.
   NOTA: Se requieren aumentos más altos para analizar los gránulos, la organización del DMS, el tamaño de los territorios citoplasmáticos y el núcleo polilobulado.

Resultados

Histología de la médula ósea
La observación de la histología azul de toluidina de la médula ósea bajo un microscopio de luz es clave para analizar rápidamente la arquitectura general del tejido en términos de, por ejemplo, la compacidad del tejido, la continuidad del microvaso y el tamaño y la forma de los megacariocitos (Figura 1D). Se realiza antes de secciones ultrafinas para determinar la necesidad de cortar más profundamente en el bloqueo ...

Discusión

El examen directo de los megacariocitos en su entorno nativo es esencial para comprender la megacaripoyesis y la formación de plaquetas. En este manuscrito, proporcionamos un método de microscopía electrónica de transmisión que combina el lavado de la médula ósea y la fijación por inmersión, lo que permite diseccionar in situ las características morfológicas de todo el proceso de morfogénesis de megacariocitos que tiene lugar en la médula ósea.

El lavado de la médula ó...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30)	Ladd Research Industries, USA	21310
Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar	Electron Microscopy Sciences, USA	1670-B
CaCl2 Calcium chloride hexahydrate	Merck, Germany	2083
Copper grids 200 mesh thin-bar	Oxford Instrument, Agar Scientifics, England	T200-CU
Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate	Merck, Germany	8.20670.0250
Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA)	Ladd Research Industries, USA	21340
Double Edge Stainless Razor blade	Electron Microscopy Sciences-EMS, USA	EM-72000
Ethanol absolut	VWR International, France	20821296
Filter paper, 90 mm diameter	Whatman, England	512-0326
Flat embedding silicone mould	Oxford Instrument, Agar Scientific, England	G3533
Glutaraldehyde 25%	Electron Microscopy Sciences-EMS, USA	16210
Heat plate Leica EMMP	Leica Microsystems GmbH, Austria	705402
Histo Diamond Knife 45°	Diatome, Switzerland	1044797
JEOL 2100 Plus TEM microscope	JEOL, Japan	EM-21001BU
Lead citrate - Ultrostain 2	Leica Microsystems GmbH, Austria	70 55 30 22
LX-112 resin	Ladd Research Industries, USA	21310
MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate	Sigma, France	M2393-100g
Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate)	Electron Microscopy Sciences-EMS, USA	15320
Nadic Methyl Anhydride (NMA)	Ladd Research Industries, USA	21350
Osmium tetroxide 2%	Merck, Germany	19172
Propylene oxide (1.2-epoxypropane)	Sigma, France	82320-250ML
Saline injectable solution 0.9% NaCl	C.D.M Lavoisier, France	MA 575 420 6
Scalpel Surgical steel blade	Swann-Morton, England	.0508
Sodium tetraborate - Borax	Sigma, France	B-9876
Sucrose	Merck, Germany	84100-1KG
Syringe filter 0.2µm	Pall Corporation, USA	514-4126
Toluidine blue	Ladd Research Industries, USA	N10-70975
Trimmer EM TRIM2	Leica Microsystems GmbH, Austria	702801
Ultramicrotome Ultracut UCT	Leica Microsystems GmbH, Austria	656201
Uranyl acetate	Ladd Research Industries, USA	23620