تقنيات التعامل مع الحد من الإجهاد في الفئران

Summary

تصف هذه الورقة تقنية المناولة في الفئران ، تقنية المناولة ثلاثية الأبعاد ، والتي تسهل التعامل الروتيني عن طريق تقليل السلوكيات الشبيهة بالقلق وتقدم تفاصيل عن تقنيتين متصلتين موجودتين (التعامل مع النفق والذيل).

Abstract

تتعرض المختبر لتلاعبات متعددة من قبل العلماء أو مقدمي الرعاية الحيوانية. الإجهاد الذي يسببه هذا يمكن أن يكون له آثار عميقة على رفاه الحيوان ويمكن أيضا أن يكون عاملا محيرا للمتغيرات التجريبية مثل تدابير القلق. على مر السنين، تم تطوير تقنيات المناولة التي تقلل من الإجهاد المرتبط بالمناولة مع التركيز بشكل خاص على الفئران، والقليل من الاهتمام بالفئران. ومع ذلك ، فقد ثبت أن الفئران يمكن أن تكون معتادة على التلاعب باستخدام تقنيات المناولة. التعود الفئران على التعامل مع يقلل من الإجهاد، ويسهل التعامل الروتيني، ويحسن رفاهية الحيوان، ويقلل من تقلب البيانات، ويحسن الموثوقية التجريبية. على الرغم من الآثار المفيدة للتعامل، لا يزال يستخدم على نطاق واسع نهج التقاط الذيل، وهو أمر مرهق بشكل خاص. تقدم هذه الورقة وصفا مفصلا ودليلا على تقنية معالجة الفئران المطورة حديثا بهدف تقليل الإجهاد الذي يعاني منه الحيوان أثناء التفاعل البشري. يتم تنفيذ هذه التقنية اليدوية على مدى 3 أيام (تقنية التعامل مع 3D) وتركز على قدرة الحيوان على التعود على المجرب. كما تظهر هذه الدراسة تأثير تقنيات معالجة الأنفاق التي تم إنشاؤها سابقا (باستخدام نفق البولي) وتقنية التقاط الذيل. درست على وجه التحديد هي آثارها على السلوكيات مثل القلق، وذلك باستخدام الاختبارات السلوكية (متاهة مرتفعة زائد والتغذية المكبوتة الجدة)، والتفاعل الطوعي مع المجربين والقياس الفسيولوجي (مستويات الكورتيكوستيرويد). تقنية التعامل مع 3D وتقنية التعامل مع النفق خفضت الأنماط الظاهرية مثل القلق. في التجربة الأولى ، باستخدام الفئران الذكور البالغة من العمر 6 أشهر ، حسنت تقنية المناولة ثلاثية الأبعاد تفاعل المجرب بشكل كبير. في التجربة الثانية، وذلك باستخدام أنثى عمرها 2.5 شهر، فإنه خفض مستويات الكورتيكوستيرويد. على هذا النحو ، فإن التعامل مع 3D هو نهج مفيد في السيناريوهات التي يكون فيها التفاعل مع المجرب مطلوبا أو مفضلا ، أو حيث قد لا يكون التعامل مع النفق ممكنا أثناء التجربة.

Introduction

الفئران والجرذان هي الأصول الأساسية للدراسات ما قبل السريرية^1،2 لأغراض متعددة ، بما في ذلك الغدد الصماء والفسيولوجية والصيدلة أو الدراسات السلوكية². من العدد المتزايد من الدراسات التي تنطوي على الحيوانات، نشأ أن المتغيرات البيئية غير المنضبط بما في ذلك التفاعل البشري تؤثر على نتائج مختلفة في البحوث الطبية الحيوية^3،4،5. هذا هو المسؤول عن التباين الكبير لوحظ عبر التجارب ومختبرات البحوث^4،5، مما يشكل تحذيرا كبيرا في البحوث الحيوانية.

وقد نفذت نهج مختلفة بهدف الحد من تأثير الضغوطات البيئية والحد من التفاعل مع التفاعل البشري. فعلى سبيل المثال، للحد من تأثير الضغوطات البيئية، تم تنفيذ توحيد ظروف السكن ونظم الإسكان الآلي^6و7 عبر المختبرات. وفيما يتعلق بالتفاعل مع البشر، فإن النهج الشائعة الاستخدام للتعامل مع الحيوانات ونقلها لا تولي سوى القليل من الاعتبار لعدم ارتياح الحيوانات والإجهاد. على سبيل المثال، التقاط الحيوانات من ذيلها أو باستخدام ملقط⁸ يزيد من القلق خط الأساس^9،10،11،يقلل من الاستكشاف^9،12 ويساهم بشكل كبير في التباين بين الأفراد داخل وعبر الدراسات^13،14. ونتيجة لذلك، تم تطوير نهج أخرى، مثل تقنية مناولة الكأس، والتي تنطبق على الفئران والجرذان. في هذا النهج ، يتم "قبة" الحيوانات من قفصها ، وعقد من قبل المجربين بأيديهم تشكيل كوب^9،10،11. بديل آخر مفيد للتعامل مع الذيل ينطوي على استخدام نفق البولي لنقل الفئران^9،10،15. هذا النهج يلغي التفاعل المباشر بين الماوس والمجرب. وأظهرت كل من نهج الكأس والنفق فعالية في الحد من السلوكيات مثل القلق والخوف من المجرب التي يمكن المبالغة فيها من خلال تقنيات التعامل مع العكسي، مثل الذيل التقاط / الذيل التعامل مع^9،10.

لذلك، تظهر الأدلة المتزايدة فائدة التعامل السليم مع الماوس للحد من التباين بين الأفراد^9،11، وتحسين^{رفاهية الحيوان 10}. ومع ذلك، لا تزال التقنيات المذكورة أعلاه تواجه قيودا. وقد تم تنفيذ تقنية التعامل مع كأس مع جداول تتراوح بين 10 أيام (10 دورات على مدى 2 أسابيع¹⁶) تصل إلى 15 أسابيع¹⁷، وهو قدر كبير من الوقت لموظفي المرفق والمجربين. بالإضافة إلى ذلك ، تختلف فعالية التعامل مع الكأس حسب السلالة⁹ والتعامل التقليدي مع الكأس في الأيدي المفتوحة قد يؤدي إلى فئران ساذجة أو سلالات ثاب بشكل خاص للقفز من اليد^9،18. يؤدي التعامل مع النفق إلى نتائج أكثر اتساقا وأسرع بشكل عام في^19. وتستخدم الأنفاق أيضا كإثراء القفص المنزلي. فهي تساعد الحيوانات على التعود على التعامل بسرعة وتوفير فوائد إضافية للإثراء. ومع ذلك، فإن التعامل مع الأنفاق له حدود عند نقل الحيوانات بين الأجهزة. ومن المثير للاهتمام، هيرست والغرب⁹، وهندرسون وآخرون²⁰ أظهرت أن استخدام لطيف وأقصر التعامل اليدوي لنقل الحيوانات من النفق إلى الجهاز لا يؤثر على النمط الظاهري.

لتوفير بديل للأساليب القائمة ، مع التعود القابل للتحقيق في فترة قصيرة من الزمن ، تصف هذه المقالة تقنية جديدة تتوسع في تقنية التعامل مع الكأس ، وبالتالي لا تتطلب معدات معينة. يستخدم هذا النهج معالم لقياس مستوى الفئران الراحة لديها مع عملية المناولة. وهو يظهر فعالية في تقليل التفاعل الماوس والإجهاد (على المستويات السلوكية والهرمونية)، ويسهل التعامل الروتيني ويساهم في الحد من التباين بين الحيوانات. يتم توفير تفاصيل هذه التقنية هنا ، ويتم إظهار فعاليتها في الحد من السلوكيات الشبيهة بالقلق ، وتحسين التفاعل مع المجربات ، والحد من إطلاق هرمون الإجهاد المحيطي (الكورتيكوسترون) في دراستين منفصلتين (الفئران الذكور والإناث) ، بالمقارنة مع التعامل مع النفق (التحكم الإيجابي) وتقنيات التعامل مع الذيل (التحكم السلبي).

Protocol

ووافقت لجنة رعاية الحيوانات التابعة للمجلس على الإجراءات المتعلقة بالحيوانات وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية للمجلس الكندي لرعاية الحيوان.

ملاحظة: يمكن استخدام طريقة المناولة الموضحة هنا في سلالات الماوس المختلفة، بما في ذلك الخطوط غير المعدلة وراثيا (C57/BL6، BalbC، CD1، SV129، إلخ) والخطوط المعدلة وراثيا. ويمكن استخدامه أيضا مع الفئران الصغيرة أو القديمة، مشيرا إلى أن الفئران البالغة الصغيرة (4-6 أسابيع من العمر) تميل إلى أن تكون أكثر نشاطا قليلا من الفئران البالغة أو القديمة، وخاصة في اليوم الأول.

1. إعداد تجريبي

1. قبل بدء الدراسة، وفقا للمبادئ التوجيهية وصول^21،تعيين الفئران عشوائيا إلى كل مجموعة مناولة (3D-المناولة، والتعامل مع النفق أو معالجة الذيل).
2. تحديد الغرفة لإجراء المناولة. ويمكن إجراؤه في غرفة السكن أو في غرفة منفصلة. إذا تم التعامل معها في غرفة منفصلة ، الأمر الذي يتطلب نقل الحيوانات على عربة متحركة ، فسمح للحيوانات بالدخول إلى الغرفة الجديدة لمدة 20-30 دقيقة قبل بدء بروتوكول المناولة.
3. بالنسبة للحيوانات التي يسكنها مجموعة، استخدم قفصا مؤقتا لإيواء الفئران بعد المناولة، قبل إعادة تجميعها جميعا في قفصها المنزلي الأولي. وهذا يقلل من المعارك المحتملة بين الحيوانات قبل المناولة (وخاصة في الذكور).
4. العمل على عداد (ويفضل كونترتوب تطهيرها) أو في خزانة السلامة البيولوجية، مع قفص الإسكان بعيدا عن الحيوان التي يجري التعامل معها. قربها من قفص الإسكان يزيد من خطر القفز. إذا كانت الحيوانات موجودة في مجموعة ، فإن القفز من الماوس الذي يتم التعامل معه في القفص المنزلي قد يسبب الإجهاد لزملائه في القفص.
   ملاحظة: العمل في خزانة السلامة الحيوية يحد من خطر الفئران القفز على الأرض، ويمكن أن تكون هناك حاجة في بعض المرافق. يمكن استخدام هذه التقنية في خزانة السلامة البيولوجية ، مع التأكد من تنفيذ جميع الخطوات دائما داخل خزانة السلامة الحيوية ، وتجنب الفئران المشي على ساعدي المعالج.

2. اليوم 1: 5 دقيقة لكل فأر

1. افتح القفص برفق وضع الغطاء على الجانب، وإزالة مواد التعشيش، وغيرها من الإثراء مثل تشغيل العجلات أو الملاجئ.
2. إدخال يد مفتوحة قفاز إلى قفص المنزل، ووضع اليد ببطء على طول جانب واحد من جدار القفص (الجدار الأقرب إلى معالج، الشكل 1A).
   1. لا تحاول على الفور لالتقاط الماوس.
3. تبقى غير متحركة والسماح للحيوان للتعود على وجود اليد في القفص لمدة 30 ثانية تقريبا.
4. محاولة لالتقاط الماوس في راحة اليد (أي تجنب التقاط الحيوان من ذيله).
   1. إذا لم يتم التقاط الماوس بسهولة بعد 3 محاولات، وتوجيه الماوس إلى الزاوية والكأس بكلتا يديه.
   2. تحرك بلطف أيدي مقبب نحو الماوس في محاولة لالتقاطه.
   3. إذا لم تنجح بعد 3 محاولات كحد أقصى بكلتا يديه، التقط الماوس برفق من قاعدة ذيله، ونقله إلى ساعدك أو يدك المسطحة.
5. مع الماوس في اليد، والحفاظ على اليد مسطحة ومفتوحة قدر الإمكان.
   ملاحظة: يوفر هذا منصة مسطحة للفأرة للخطوة على، ويحد من خطر لدغات.
6. عقد اليد مفتوحة ومسطحة مع النخيل حتى، ضع اليد الأخرى المجاورة لليد عقد الماوس والسماح للفأر للتحرك بحرية من يد إلى يد دون أي ضبط النفس (الشكل 1B).
7. دع الماوس يستكشف ويتنقل بين اليدين لمدة دقيقة واحدة.
   1. عند هذه النقطة الفئران قد تحاول القفز بعيدا. وضع اليدين بحيث إذا قفز الماوس، وسوف تهبط على كونترتوب بدلا من الكلمة.
   2. إذا كان الماوس يبدو وكأنه يستعد للقفز (تتحرك نحو حافة اليد وتربية على الساقين الخلفيتين)، ضع ببطء اليد الأخرى أمامه ومحاولة لتوجيهه إلى المشي على هذه اليد. تجنب الحركات المفاجئة لأنها تزيد من خطر القفز.
   3. إذا قفز الماوس، حاول التقاطه لتجنب معالجة الذيل واستئناف جلسة المعالجة. إذا كان الماوس يبقى على الأرض أو خارج اليدين لأكثر من 10 ثانية، إضافة وقت إضافي إلى جلسة التعامل للتعويض عن أي وقت كان الماوس من بين اليدين.
   4. تدوين ملاحظات من القفزة. ويمكن استخدام العدد الإجمالي للقفزات لتقييم التغير المحتمل بين الحيوانات.
8. بعد 1 دقيقة من التعامل مع الأيدي المسطحة، والاسترخاء كف اليد، وكوب قليلا الماوس في اليد، قبل المتداول بلطف الماوس بين اليدين(الشكل 1C).
   1. إلى "لفة"، وضع الماوس في راحة اليد، على يد مسطحة، عمودي على الأصابع.
   2. أغلق اليد ببطء، وضع الأصابع على الجزء الخلفي من الماوس.
   3. ضع اليد الحرة مباشرة تحت اليد التي تمسك الماوس.
   4. بدوره ببطء / تدوير اليد مع الماوس لنقل بلطف الماوس إلى جهة أخرى (180° الوجه).
   5. كرر هذا ذهابا وإيابا بين اليدين.
9. بديل من المتداول لطيف بين اليدين والاستكشاف الحر على أيدي مفتوحة لمدة 60 ق، بالتناوب بين التقنيات حول كل 20 ق.
10. إجراء "اختبار المأوى"(الشكل 1D).
    1. السماح للفأرة التحرك إلى حافة اليد ثم جلب اليدين معا.
    2. ببطء شديد ، كوب منهم حتى الماوس يناسب داخل "المأوى" التي شكلتها اليدين. ترك فتحة حتى يمكن للفأرة الهروب إذا لزم الأمر.
    3. تهدف إلى الحفاظ على الماوس في المأوى لمدة 5-10 ق، دون أي ضبط النفس.
    4. بالتناوب بين اختبار المأوى، لفة بين اليدين والاستكشاف الحر للأيدي المفتوحة لمدة 60 s أخرى، التأكد من تنفيذ خطوة المأوى 3 مرات أو أكثر.
11. في جميع الإجراءات الموصوفة في 2.10، لا تتسرع في العملية. إذا كان الماوس يبدو وشدد (أي مؤقتة للهروب، يقفز من اليدين، وتجنب الاتصال مع اليدين الخ) من خلال كونها محصورة داخل اليدين، والاستمرار في المتداول بين اليدين والاستكشاف مجانا لمدة 20 ق، ومن ثم إعادة المحاولة.
12. معلم رئيسي: إجراء اختبار واحد على الأقل من 10 ق للمأوى الناجح لإكمال اليوم الأول.
    1. النظر في اختبار المأوى ناجحة عندما يبقى الماوس في أيدي. إذا كان الماوس الملوثات العضوية الثابتة رأسه والعودة إلى المأوى، فإنه لا يزال اختبارا ناجحا. إذا خرج الحيوان تماما من الملجأ ، فهو فشل.
13. السماح بالاستكشاف المجاني في أيدي لمدة 30 s.
14. استبدال بلطف الماوس في قفصه. إذا كانت المجموعة موجودة، ضع الماوس في القفص المؤقت حتى يتم التعامل مع جميع زملاء القفص. عودة الفئران إلى قفصهم الأصلي عن طريق التقاطها في كف اليد. لا تستخدم ذيل التقاط.
15. تنظيف الجزء العلوي من مقاعد البدلاء من البراز والبول المحتملة مع الإيثانول 70٪.
16. شطف قفازات جيدا مع الإيثانول 70٪ (أو محلول التنظيف المناسب) أو تغيير القفازات قبل التعامل مع الماوس المقبل (فمن الممكن للحفاظ على نفس القفازات لزملائه قفص).
    ملاحظة: من المستحسن إجراء المعالجة مع عدد معقول من الحيوانات لتجنب التعب من المعالج. التعامل مع الفئران 24 يستغرق حوالي 2 ساعة، ويوصى أن لا تتجاوز الفئران 24 لكل معالج. إذا كان هناك حاجة إلى معالجة المزيد من الحيوانات، فمن المستحسن إما أن يكون لديك معالجات متعددة، أو لتقسيم إجراءات المعالجة إلى مجموعات فرعية، على مدى عدة أيام.

3. اليوم 2: 3 إلى 5 دقائق لكل فأر

1. محاولة لالتقاط الماوس في راحة اليد. في هذه المرحلة ، يجب أن يكون ممكنا بالفعل ويجب ألا تقفز الفئران من اليد.
2. تبدأ مع النخيل مفتوحة كما في اليوم 1، مما يسمح للفأر لاستكشاف بحرية لمدة 20 s.
3. ثم لفة الماوس بين اليدين عدة مرات (4-5 مرات).
4. إجراء "اختبار المأوى" لمدة 5 ق.
5. كرر اختبار المأوى عدة مرات (~ 5-6) على مدى فترة 2 إلى 3 دقائق.
6. خلال نفس الفترة 2 إلى 3 دقائق، بالتناوب مع لفة بين اليدين والاستكشاف الحر للأيدي المفتوحة خطوة من اليوم 1 لتحسين التعود.
   1. لمس الماوس على رأسه وظهره (الشكل 1E)، 5-6 مرات. علامة على التعود هو عندما يتيح لك الماوس لمسها دون محاولة الهرب.
   2. أداء "الأنف كزة": محاولة لمس خطم الماوس، 2 إلى 3 مرات(الشكل 1F).
      1. إذا حاول الفأر لدغة أو يظهر علامات واضحة من الإجهاد في لمسها، لا تحاول فورا كزة الأنف مرة أخرى. بدلا من ذلك، بالتناوب مع استكشاف اليد المسطحة ولفة. وينعكس "التعود" من قبل الحيوان لا يهرب أو يدير رأسه في حالات الاتصال البشري.
7. في جميع الإجراءات الموصوفة في 3.4-3.6، لا تستعجل العملية. إذا كان الماوس يبدو وشدد من قبل يجري محصورة داخل اليدين أو لا تريد أن تكون لمست، والاستمرار في المتداول بين اليدين لمدة 20-30 ق ومن ثم إعادة المحاولة.
8. المعالم: أداء ما لا يقل عن 1 كزة الأنف ناجحة لمدة 2-3 ق لاستكمال اليوم 2.
9. وقف هذه الدورة بعد حوالي 3 دقائق من التعامل مع إذا كان الحيوان يتفاعل بشكل جيد مع "المأوى"، "رئيس المداعبة"، "كزة الأنف"، وإذا كان الماوس يبدو أن تكون على استعداد لاستكشاف اليدين دون علامات الإجهاد.
10. إذا استمر الماوس في إظهار علامات الإجهاد أو لم يكن يتفاعل بشكل جيد مع اختبار "اختبار المأوى" أو اختبار "كزة الأنف"، استمر في الجلسة حتى تصل إلى 5 دقائق كما هو الحال في اليوم الأول.
11. استبدال الماوس في قفصه، وتنظيف أعلى مقاعد البدلاء والقفازات كما هو الحال في اليوم 1.

4. يوم 3: حوالي 3 دقيقة لكل فأر

1. في اليوم الثالث، انتقل من خلال نفس الخطوات كما هو الحال في اليوم 2، لمدة 2 إلى 3 دقائق.
   1. التقط الماوس في راحة اليد.
   2. نقل الماوس بين اليدين ولفه
   3. إجراء اختبار المأوى.
   4. في محاولة للحيوانات الأليفة الماوس على ظهره ورأسه.
2. يتناوب بين هذه الخطوات على ما يقرب من 1 إلى 2 دقيقة.
3. استمر في الإجراء حتى يتم استرخاء الماوس بما يكفي للجلوس في كف اليد دون محاولة الهرب.
4. قبل نهاية اليوم الثالث، كرر اختبار المأوى واختبار كزة الأنف كاختبار للتعود.
   1. إذا كان يمكن إكمال كلا الاختبارين في محاولتهما الأولى ، فإن عملية التعود قد اكتملت. استمر في التعامل مع الماوس برفق لمدة 30 s إلى دقيقة.
   2. إذا كان الماوس مقاوما في البداية لأي من الاختبارين، كرر الخطوات 4.1-4.3 لمدة 20-30 s قبل إعادة امتصاص كزة الأنف واختبار المأوى.
   3. إذا كان الماوس لا يزال مقاوما لهذه الاختبارات بعد 3 دقائق، قد يتكرر اليوم الثالث.
5. المعالم: إجراء اختبارين ناجحين على الأقل للمأوى بمعدل 10 ق لكل منهما، واختبارين ناجحين لكزة الأنف لإكمال اليوم الثالث، والانتهاء من إجراء المناولة ثلاثية الأبعاد بأكمله.
6. عودة الماوس إلى قفصه، وتنظيف أعلى مقاعد البدلاء والقفازات.

5. النهج الاختياري للحيوانات التي تخضع لضبط النفس للحقن أو الغافاج

ملاحظة: في اليوم الثالث، إذا تم تقييد الحيوان لأغراض تجريبية (الغافاج الفموي، الحقن داخل الصفاق، إلخ)، يمكن أن تخضع الفئران لاختبار قرصة الرقبة.

1. فهم مؤخر الرقبة بين الإبهام والسبابة(الشكل 1G).
2. رفع الماوس 3-5 سم فوق اليد لمدة 2-3 ق.
   ملاحظة: هذا هو عادة موقف غير طبيعي للفئران الكبار، وإذا كانت الفئران لا تزال قريبة من الحركة، فهي معتادة بشكل جيد على التعامل مع وسيكون من السهل كبح جماح لأغراض تجريبية.
3. ضع الماوس مرة أخرى في اليد المسطحة ، أو إذا كان الماوس رد فعل على قرصة الرقبة ، والنظر في وضعه على كم المجرب ، غطاء القفص أو كونترتوب
   ملاحظة: إذا كنت تعمل في خزانة السلامة الحيوية، لا تضع الماوس على الأكمام أو يمكن أن يسير ويخرج من خزانة السلامة البيولوجية. تفضل وضع الماوس على كونترتوب داخل خزانة السلامة البيولوجية.
4. اترك الماوس لاستكشاف يد المجرب بحرية لمدة دقيقة واحدة.

6. نهج اختياري لأيام إضافية من التعامل

1. في احتمال وجود خط الماوس وشدد للغاية ، إضافة أيام إضافية لتقليل التفاعل ومستوى التوتر من الحيوانات ، وذلك باستخدام الأساليب الموصوفة في اليوم 2 / 3.
   ملاحظة: يمكن أن تؤثر العديد من العوامل على الإجهاد الأساسي للحيوانات بما في ذلك السلالة ، ووجود تعديل معدل وراثيا ، والعمر والجنس وظروف السكن. إذا كانت هذه العوامل غير متسقة بين مجموعات مثل الحيوانات المسنة التي يتم اختبارها ضد الضوابط الشباب أو الحيوانات المعدلة وراثيا التي يجري اختبارها ضد ضوابط النوع البري، فمن المستحسن أن يتم استخدام نفس العدد من أيام التعود لكل مجموعة.

7. نفق التعامل

ملاحظة: هذه التقنية قابل للتطبيق فقط على أجهزة الماوس النفق المعالجة. الأنفاق هي أنابيب البولي حوالي 13 سم في الطول و 5 سم في القطر.

1. ضع النفق في قفص الفأر.
2. اترك النفق في القفص لمدة 7 أيام قبل التعامل معه.
3. افتح القفص وضع الغطاء على الجانب.
4. توجيه الماوس برفق في نفق البولي (بالفعل في القفص).
5. ارفع النفق من القفص أفقيا إذا لزم الأمر تغطية فضفاضة نهايات النفق لمنع الحيوان من القفز / السقوط من النفق، يحتمل أن تسقط مرة أخرى في قفصه أو على الأرض.
6. نقل الحيوان في النفق بعيدا عن قفص المنزل والاحتفاظ بها بعيدا عن أي أسطح لمدة 30 s.
7. ضع النفق مرة أخرى في القفص المنزلي، مما يسمح للفأر بالخروج من الأنبوب.
8. انتظر لمدة 60 ثانية ثم كرر الخطوات 7.4-7.7 مرة واحدة.
9. شطف قفازات جيدا مع الإيثانول 70٪ أو تغيير القفازات قبل التعود على الماوس المقبل.
10. كرر هذا الإجراء لمدة 10 أيام متتالية.

8. معالجة الذيل

ملاحظة: هذه التقنية قابلة للتطبيق فقط على الماوس التي تتم معالجتها بواسطة Tail. يتم استخدامه لنقل الفئران من قفصهم إلى جهاز ، والعكس بالعكس.

1. افتح القفص وضع الغطاء على الجانب.
2. فهم الفئران من قاعدة الذيل بين الإبهام والسبابة.
3. ارفع الماوس من القفص.
4. في 2-3 ق، نقل الماوس إلى الساعد المقابل للمجرب مع الحفاظ على قبضة على الذيل لتجنب الماوس تتدلى.
5. عندما يكون التعامل مع الذيل مطلوبا في تنفيذ هذه التجربة (على سبيل المثال ، قبل سحب الدم لاختبار الكورتيزول) يتم نقل الحيوانات إلى ساعد المجرب عن طريق التعامل مع الذيل والاحتفاظ بها لمدة 15 s قبل إعادتها إلى قفصها.

9. مرتفعة بالإضافة إلى المتاهة

1. إعداد الغرفة
   1. ضع المتاهة في وسط الغرفة، تحت كاميرا رقمية مجهزة ببطاقة ذاكرة.
   2. إعداد ضوء الغرفة في ~ 60 لوكس باستخدام 2 المصابيح الدائمة وضعت وراء المتاهة.
   3. إيقاف أي إضاءة علوية لتجنب الضوء المباشر على المتاهة التي تخلق انعكاس ويعطل الكشف عن الحيوانات في المتاهة.
   4. بمجرد إعداد جميع المعدات ، قم بنقل الحيوانات إلى الغرفة والسماح لها بالتأقلم مع إعدادات الضوء والبيئة الجديدة لمدة 30 دقيقة.
2. اختبار
   1. تنظيف المتاهة مع الإيثانول 70٪ لمنع الروائح من الغبار أو من الحيوان الذي تم اختباره سابقا.
   2. بدء تشغيل الكاميرا.
   3. استخدم ورقة مع هوية الحيوان لتسجيل الهوية على الفيديو ، قبل وضع الحيوان في المتاهة (وهذا سيسهل التحديد الصحيح للفأر الذي يتم تصويره على كل فيديو).
   4. استخدام تقنية التعامل المناسبة لكل لنقله إلى المتاهة.
   5. ضع الماوس على المنصة المركزية، مواجها ذراعا مفتوحة.
   6. السماح للفأر لاستكشاف الجهاز لمدة 10 دقيقة، دون عائق.
   7. بعد 10 دقائق، أوقف الكاميرا.
   8. استرداد الماوس من المتاهة ووضعها مرة أخرى في قفصه.
   9. تنظيف البراز والبول من المتاهة مع الإيثانول 70٪.
   10. بمجرد الانتهاء من الاختبار مع جميع الفئران ، قم بنقل مقاطع الفيديو من بطاقة الذاكرة إلى جهاز كمبيوتر لتتبع الفيديو.
   11. باستخدام برنامج تتبع الحيوانات الآلي ، تتبع عدد الإدخالات إلى الأسلحة المفتوحة والمغلقة ، والوقت الذي يقضيه في الأسلحة المفتوحة أو المغلقة (هنا Ethovision XT 14).

10. تفاعل المجرب (مشتق من هيرست والغرب⁹)

1. إعداد الغرفة
   1. ضع طاولة في منتصف غرفة الاختبار تحت كاميرا رقمية مزودة ببطاقة ذاكرة.
   2. إعداد الضوء في لوكس 50-70 مع 4 المصابيح الكهربائية وضعت في زاوية الغرفة التي تواجه ما يصل الى السقف. إيقاف الإضاءة العلوية لتجنب الضوء المباشر على المتاهة التي تخلق انعكاس وتعطيل الكشف عن الحيوانات في الساحة.
   3. أحضر الحيوانات إلى الغرفة
   4. دعهم يتكيفون مع الغرفة لمدة 30 دقيقة.
2. التجربه
   1. ضع القفص المنزلي تحت الكاميرا الرقمية.
   2. أزل الغطاء.
   3. إزالة مواد التعشيش وغيرها من الإثراء التي قد تتداخل مع تتبع الحيوانات.
   4. بدء تشغيل الكاميرا.
   5. استخدم بطاقة القفص مع معرف الحيوان للتعرف على الحيوان على الفيديو.
   6. ضع يد في القفص المنزلي على طول جدار القفص في الجانب الأيمن الأمامي.
      1. تأكد من أن رأس المعالج لا يمنع الكاميرا لتصوير الماوس.
   7. بدء تشغيل مؤقت.
   8. حافظ على عدم حركة اليد لمدة دقيقتين، ودع الماوس يستكشف اليد.
   9. إزالة اليد من القفص لمدة 15 ثانية.
   10. محاولة لالتقاط الماوس باستخدام أيدي مقبب وتسجيل ما إذا كان الماوس يهرب.
   11. كرر الخطوة الأخيرة حتى خمس مرات، كل 5 ثوان، أو حتى يسمح الماوس لنفسه أن يلتقط.
   12. تسجيل عدد المحاولات المطلوبة لالتقاط الماوس.
   13. إعادة مواد التعشيش والإثراء إلى القفص.
   14. تنظيف القفازات مع الإيثانول 70٪ أو تغيير القفازات قبل الشروع في الحيوان التالي.
   15. بعد الاختبار، قم بنقل مقاطع الفيديو من بطاقة الذاكرة إلى جهاز كمبيوتر.
   16. باستخدام برنامج تتبع الفيديو الآلي ، وتقسيم القفص إلى أربعة أرباع متساوية وتسجيل الوقت الذي يقضيه الماوس في كل ربع (هنا ، Ethovision XT 14).

11. الجدة قمعت التغذية

1. الحرمان من الطعام
   1. 3 أيام قبل الاختبار، وإجراء تغيير قفص كامل، ومنزل واحد الحيوانات (السكن واحد هو الأفضل لإجراء اختبار قفص المنزل).
      ملاحظة: توفير الفراش الطازج يزيل الغبار المحتملة أو قطع صغيرة من المواد الغذائية المتراكمة في الفراش منذ تغيير القفص الماضي.
   2. في اليوم السابق للاختبار، تزن جميع الحيوانات حوالي الساعة 6 مساء.
   3. إزالة جميع المواد الغذائية من النطاط الغذاء، وضمان عدم وجود قطعة من الطعام في القفص أو في الفراش.
2. إعداد الغرفة
   1. ضع غرفة NSF على طاولة.
   2. ملء الغرفة مع طبقة رقيقة من الفراش الذرة (أو الفراش الأخرى التي تختلف عن الفراش المستخدمة في قفص الحيوانات المنزلية).
   3. إعداد الضوء في 70 لوكس مع 4 المصابيح الكهربائية وضعت في زاوية الجدول حيث تقف الغرفة، التي تواجه ما يصل إلى السقف. أطفئ الأضواء العلوية للحفاظ على إضاءة الغرف المنخفضة.
   4. ضع بيليه واحدة من الطعام القياسي المستخدم في المنشأة ، على جانب الغرفة التي تواجه المجرب (≈10 سم من الجدار).
3. اختبار
   1. في الصباح بعد الحرمان من الطعام، أحضر الحيوانات إلى الغرفة قبل 30 دقيقة من الاختبار للسماح لها بالتأقلم مع إعدادات الضوء والبيئة الجديدة.
   2. وزن جميع الحيوانات من أجل قياس فقدان الوزن على أساس الوزن قياس في اليوم السابق. يجب أن تفقد الحيوانات 8-12٪ بين عشية وضحاها لتكون قادرة على أداء المهمة بشكل صحيح.
   3. فرز الحيوانات في فقدان الوزن، وفحصها بدءا من الماوس الذي خسر أكثر إلى الماوس الذي فقد أقل وزن.
   4. تأكد من أن الغرفة مليئة بالفراش وببيليه واحد.
   5. ضع الحيوان على الجانب الآخر من الغرفة ، بعيدا عن بيليه الطعام.
   6. بدء تشغيل المؤقت فورا.
   7. دع الفأرة تستكشف الغرفة لمدة تصل إلى 12 دقيقة.
   8. قياس الكمون للاقتراب والأعلاف (يجب على الحيوان لدغة وأكل) على بيليه الغذاء.
      1. اعتبرها مقاربة عندما يقترب الحيوان من الكريات ، ورائحتها ولا يعضها.
      2. تعريف لدغة كما هو الحال عندما يبدأ الحيوان تستهلك بيليه.
   9. تسجيل الكمون للاقتراب وتتغذى على بيليه في ثوان.
   10. بمجرد أن يتغذى الفأر على بيليه الطعام ، قم بإزالة الماوس من الغرفة.
   11. تجاهل الفراش ولكن حفظ بيليه التي سيتم استخدامها لاختبار محرك الشهية في قفص الماوس المنزل.
   12. إعادة تعيين الغرفة للحيوان القادم والمضي قدما مع الحيوان المقبل.
   13. 15 دقيقة بعد الانتهاء من الاختبار في الغرفة، وإسقاط بيليه المستخدمة أثناء الاختبار، داخل القفص المنزلي للفأر، ضد الجدار في الجزء الأمامي من القفص.
   14. قياس الكمون لتتغذى على بيليه عندما بيليه هو في القفص المنزلي. هذا هو مقياس لمحرك الشهية.
       1. من الأفضل إزالة مادة التعشيش لضمان أن يرى الفأر بيليه يتم إسقاطه في قفصه.

12. جمع المصل وقياس كورتيكوستيرون

1. التعامل مع الحيوانات لمدة دقيقة واحدة باستخدام التقنية المخصصة، 15 دقيقة قبل جمع الدم (وهذا يمكن القيام به مع مجموعة يسكن أو الحيوانات التي يسكنها واحد، مع الأخذ في الاعتبار خطر للقتال عند تجميع الفئران).
   1. بالنسبة للنفق الذي يعالج الفئران ، قم بتوجيهها إلى النفق ، ورفع النفق من القفص لمدة دقيقة واحدة ، واستبدال الماوس في قفصه.
   2. للفئران معالجة الذيل، والاستيلاء على قاعدة الذيل من الماوس وإزالة الماوس من قفصه. نقل الماوس إلى كم المجرب لمدة 1 دقيقة، والعودة الماوس إلى قفصه عن طريق التعامل مع الذيل.
   3. بالنسبة للفئران ثلاثية الأبعاد، استخدم اليدين المقننتين لإزالة الماوس من قفصه. عقد الماوس في أيدي مقبب لمدة 1 دقيقة، وإعادته إلى قفصه.
2. 15 دقيقة بعد التعامل معها، والمضي قدما في جمع الدم من الوريد تحت الفك^{السفلي 22}.
3. scruff بقوة الماوس بحيث يتم شل رأس الماوس بشكل آمن.
4. تحديد موقع ثقب.
   1. هناك غمازة صغيرة بلا شعر على طول الفك السفلي للوجه التي يمكن استخدامها كمعلم لتحديد موقع ثقب. رسم خط بين قاعدة الفك وهذا الدمل موقع ثقب يكمن وراء هذا الدمل نحو الأذن من قبل ما يقرب من 5 ملم، فقط وراء مفصل الفك.
5. عقد نظيفة 23 G إبرة عمودي على موقع ثقب واستخدام حركة lancing شركة سريعة. يجب أن تخترق طرف الإبرة إلى عمق يتراوح بين 1-2 مم ، وسيتدفق الدم على الفور بمجرد ثقب الوريد.
6. جمع ~ 150 ميكرولتر من الدم في أنابيب جمع EDTA المغلفة وتخزينها على الجليد.
7. تطبيق ضغط طفيف مع وسادة الشاش العقيمة إلى موقع ثقب لمدة 5 ق أو أكثر للسماح للدم لتجلط.
8. بمجرد أن يتخثر الدم، أعد الفأر إلى قفصه المنزلي.
9. دم الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية 3500 × غرام لمدة 10 دقائق.
10. (ديكانت) العملاق.
11. تخزين supernatant في -20 درجة مئوية لتحليلات المصب.
12. قياس مستويات الكورتيكوستيرون باستخدام مجموعة ELISA كورتيكوسترون بعد بروتوكول الشركة المصنعة.
13. استخدم مطياف لقراءة نتائج ELISA.

النتائج

أجريت دراستان منفصلتان باستخدام فئران C57BL/6. وشملت الدراسة #1 الذكور الذين تتراوح أعمارهم بين 6 أشهر وشملت #2 الدراسة 2.5 أشهر من الإناث (N = 36/study) من مختبرات جاكسون (القط #000664). وصلت الفئران إلى المنشأة في سن شهرين. في حين تم التعامل مع دراسة #2 الإناث واختبارها بعد أسبوعين من الوصول، دراسة #1 الذكور...

Discussion

وتستند هذه الدراسة وتطوير الأسلوب على ملاحظة أن تقنيات المناولة في الفئران لا تزال مهملة من قبل المجتمع العلمي، وأن بعض المختبرات لا تزال مترددة في تنفيذ تقنيات التعود أو المناولة للحد من الإجهاد والتفاعل مع حيواناتهم قبل التجارب. بينما يمثل الالتزام الزمني، والمناولة الحيوانية يوفر تأ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
23 G x 1 in. BD PrecisionGlide general use sterile hypodermic needle. Regular wall type and regular bevel.	BD	2546-CABD305145	Needles for Blood collection
BD Vacutainer® Venous Blood Collection EDTA Tubes with Lavender BD Hemogard™ closure, 2.0ml (13x75mm), 100/pk	BD	367841	EDTA Coated tubes for blood collection
Bed’o cobs ¼” Corn cob laboratory animal bedding	Bed-O-Cobs	BEDO1/4	Novel bedding for novelty suppressed feeding
Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5424 R	For centrifugation of blood.
Corticosterone ELISA Kit	Arbor Assays	K003-H1W
Digital Camera	Panasonic	HC-V770	Camera to record EPM/Experimenter interactions
Elevated Plus Maze	Home Made	n/a	Custom Maze made of four black Plexiglas arms (two open arms (29cm long by 7 cm wide) and two enclosed arms (29 cm long x7 cm wide with 16 cm tall walls)) that form a cross shape with the two open arms opposite to each other held 55 cm above the floor
Ethanol	Medstore House Brand	39753-P016-EA95	Dilute to 70% with Distilled water, for cleaning
Ethovision XT 15	Noldus	n/a	Automated animal tracking software
Laboratory Rodent Diet	LabDiet	Rodent Diet 5001	Standard Rodent diet
Memory Card	Kingstone Technology	SDA3/64GB	For video recording and file transfer
Novelty Suppressed Feeding Chamber	Home Made	n/a	Custom test plexiglass test chamber with clear floors and walls 62cm long, by 31cm wide by 40cm tall .
Parlycarbonate tubes	Home Made	n/a	13 cm in length and 5cm in diameter
Purina Yesterday’s news recycled newspaper bedding	Purina	n/a	Standard Bedding
Spectrophotometer	Biotek	Epoch Microplate Reader