Técnicas de manejo para reducir el estrés en ratones

Resumen

Este artículo describe una técnica de manejo en ratones, la técnica de manejo 3D, que facilita el manejo de rutina al reducir los comportamientos similares a la ansiedad y presenta detalles sobre dos técnicas relacionadas existentes (manejo de túnel y cola).

Resumen

Los animales de laboratorio son sometidos a múltiples manipulaciones por parte de científicos o proveedores de cuidado de animales. El estrés que esto causa puede tener efectos profundos en el bienestar animal y también puede ser un factor de confusión para variables experimentales como las medidas de ansiedad. A lo largo de los años, se han desarrollado técnicas de manejo que minimizan el estrés relacionado con el manejo con un enfoque particular en las ratas y poca atención a los ratones. Sin embargo, se ha demostrado que los ratones pueden habituarse a manipulaciones utilizando técnicas de manipulación. Habituar a los ratones al manejo reduce el estrés, facilita el manejo de rutina, mejora el bienestar animal, disminuye la variabilidad de los datos y mejora la confiabilidad experimental. A pesar de los efectos beneficiosos del manejo, el enfoque de recogida de cola, que es particularmente estresante, todavía se usa ampliamente. Este documento proporciona una descripción detallada y una demostración de una técnica de manejo de ratones recientemente desarrollada destinada a minimizar el estrés experimentado por el animal durante la interacción humana. Esta técnica manual se realiza durante 3 días (técnica de manipulación 3D) y se centra en la capacidad del animal para habituar al experimentador. Este estudio también muestra el efecto de las técnicas de manipulación de túneles previamente establecidas (utilizando un túnel de policarbonato) y la técnica de recogida de cola. Específicamente se estudian sus efectos sobre comportamientos similares a la ansiedad, utilizando pruebas de comportamiento (Laberinto Elevado-Plus y Alimentación Suprimida por Novedad), interacción voluntaria con experimentadores y medición fisiológica (niveles de corticosterona). La técnica de manejo 3D y la técnica de manejo de túneles redujeron los fenotipos similares a la ansiedad. En el primer experimento, utilizando ratones machos de 6 meses de edad, la técnica de manejo 3D mejoró significativamente la interacción del experimentador. En el segundo experimento, utilizando una hembra de 2,5 meses de edad, redujo los niveles de corticosterona. Como tal, el manejo 3D es un enfoque útil en escenarios donde la interacción con el experimentador es requerida o preferida, o donde el manejo del túnel puede no ser posible durante el experimento.

Introducción

Los ratones y las ratas son activos esenciales para los estudios preclínicos^1,2 para múltiples propósitos, incluidos los estudios endocrinos, fisiológicos, farmacológicos o conductuales². A partir del creciente número de estudios con animales, surgió que las variables ambientales no controladas, incluida la interacción humana, influyen en diversos resultados en la investigación biomédica^3,4,5. Esto es responsable de la variabilidad significativa observada en los experimentos y laboratorios de investigación^4,5, lo que plantea una advertencia importante en la investigación con animales.

Se han implementado varios enfoques con el objetivo de limitar el impacto de los factores estresantes ambientales y reducir la reactividad a la interacción humana. Por ejemplo, para limitar el impacto de los factores estresantes ambientales, la estandarización de las condiciones de la vivienda y los sistemas de vivienda^{automatizados 6,7} se han implementado en todos los laboratorios. Con respecto a la interacción con los seres humanos, los enfoques comúnmente utilizados para el manejo y transporte de animales tenían poca consideración por la incomodidad y el estrés de los animales. Por ejemplo, recoger animales por la cola o usar pórceps⁸ aumenta la ansiedad basal^9,10,11,reduce la exploración^9,12 y contribuye en gran medida a la variabilidad interindividual dentro y entre los estudios^13,14. Como resultado, se desarrollaron otros enfoques, como la técnica de manejo de copas, que es aplicable a ratones y ratas. En este enfoque, los animales son "ahuecarados" fuera de su jaula, y sostenidos por los experimentadores con sus manos formando una taza^9,10,11. Otra alternativa útil al manejo de la cola implica el uso de un túnel de policarbonato para transferir ratones^9,10,15. Este enfoque elimina la interacción directa entre el ratón y el experimentador. Tanto los enfoques de copa como de túnel mostraron eficacia en la reducción de comportamientos similares a la ansiedad y el miedo al experimentador que pueden ser exagerados por técnicas de manejo aversivo, como el recogimiento de cola / manejo de cola^9,10.

Por lo tanto, la creciente evidencia demuestra la utilidad del manejo adecuado del ratón para reducir la variabilidad entre individuos^9,11y mejorar el bienestar animal¹⁰. Sin embargo, las técnicas mencionadas anteriormente todavía se enfrentan a limitaciones. La técnica de manejo de copas se ha implementado con horarios que van desde 10 días (10 sesiones durante 2 semanas¹⁶⁾hasta 15 semanas^17,que es una cantidad considerable de tiempo para el personal de las instalaciones y los experimentadores. Además, la efectividad del manejo de la copa varía según la cepa⁹ y el manejo convencional de la copa en manos abiertas puede conducir a ratones ingenuos o cepas particularmente saltarines para saltar de la mano^9,18. El manejo del túnel da como resultado resultados más consistentes y generalmente más rápidos en el gentling¹⁹. Los túneles también se utilizan como enriquecimiento de jaulas domésticas. Ayudan a los animales a habituar a la manipulación rápida y proporcionan los beneficios adicionales del enriquecimiento. El manejo de túneles, sin embargo, tiene limitaciones al transferir animales entre aparatos. Curiosamente, Hurst y West^9,y Henderson et al.²⁰ demostraron que el uso de un manejo manual suave y breve para transferir animales del túnel al aparato no afecta su fenotipo.

Para proporcionar una alternativa a los métodos existentes, con habituación alcanzable en un corto período de tiempo, este artículo describe una técnica novedosa que amplía la técnica de manipulación de la copa, por lo tanto, no requiere ningún equipo en particular. Este enfoque utiliza hitos para medir el nivel de comodidad que tienen los ratones con el proceso de manipulación. Muestra eficacia para disminuir la reactividad y el estrés del ratón (a nivel conductual y hormonal), facilita el manejo rutinario y contribuye a reducir la variabilidad entre animales. Los detalles de esta técnica se proporcionan aquí, y su eficacia para reducir los comportamientos similares a la ansiedad, mejorar la interacción con los experimentadores y limitar la liberación periférica de la hormona del estrés (corticosterona) se demuestra en dos estudios separados (ratones machos y hembras), en comparación con el manejo del túnel (control positivo) y las técnicas de manejo de la cola (control negativo).

Protocolo

Los procedimientos que involucran sujetos animales fueron aprobados por el comité de cuidado de animales de CAMH y se llevaron a cabo de conformidad con las pautas del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales.

NOTA: El método de manipulación descrito en este documento se puede utilizar en varias cepas de ratón, incluidas las líneas no transgénicas (C57 / BL6, BalbC, CD1, SV129, etc.) y transgénicas. También se puede usar con ratones jóvenes o viejos, teniendo en cuenta que los ratones adultos jóvenes (4-6 semanas de edad) tienden a ser ligeramente más activos que los ratones adultos o viejos, especialmente en el día 1.

1. Preparación experimental

1. Antes del inicio del estudio, según las pautas^{ARRIVE 21,}asigne aleatoriamente ratones a cada grupo de manejo (Manejo 3D, Manejo de Túnel o Manejo de Cola).
2. Identificar la sala para realizar el manejo. Se puede realizar en la sala de la vivienda, o en una habitación separada. Si el manejo se realiza en una habitación separada, lo que requiere que los animales se muevan en un carro en movimiento, permita que los animales se habitúen a la nueva habitación durante 20-30 minutos antes del inicio del protocolo de manejo.
3. Para los animales alojados en grupo, use una jaula temporal para alojar a los ratones después del manejo, antes de reagruparlos a todos en su jaula doméstica inicial. Esto reduce las posibles peleas entre animales antes de la manipulación (particularmente en los machos).
4. Trabaje en un mostrador (preferiblemente una encimera despejada) o en un gabinete de bioseguridad, con la jaula de la carcasa lejos del animal que se está manipulando. La proximidad a la jaula de la carcasa aumenta el riesgo de saltar. Si los animales están alojados en grupos, saltar del ratón que se maneja en la jaula doméstica puede causar estrés a los compañeros de jaula.
   NOTA: Trabajar en un gabinete de bioseguridad limita el riesgo de que los ratones salten al suelo y puede ser necesario en ciertas instalaciones. Esta técnica se puede utilizar en un gabinete de bioseguridad, asegurándose de realizar siempre todos los pasos dentro del gabinete de bioseguridad y evitando que los ratones caminen sobre los antebrazos del manipulador.

2. DÍA 1: 5 min por ratón

1. Abra suavemente la jaula y coloque la tapa en el costado, retire los materiales de anidación y otros enriquecimientos, como ruedas o refugios.
2. Introduzca una mano abierta enguantada en la jaula de la casa, colocando lentamente la mano a lo largo de un lado de la pared de la jaula (la pared más cercana al manipulador, Figura 1A).
   1. No intente levantar inmediatamente el mouse.
3. Permanezca inmóvil y permita que el animal se habitúe a la presencia de la mano en la jaula durante unos 30 s.
4. Intente recoger el ratón en la palma de la mano (es decir, evite recoger al animal por la cola).
   1. Si el ratón no se recoge fácilmente después de 3 intentos, guíe el ratón hasta una esquina y una taza con ambas manos.
   2. Mueva suavemente las manos ahuecadas hacia el mouse para tratar de recogerlo.
   3. Si no tiene éxito después de un máximo de 3 intentos con ambas manos, levante el mouse suavemente por la base de su cola y transfiéralo a su antebrazo o mano plana.
5. Con el ratón en la mano, mantén la mano lo más plana y abierta posible.
   NOTA: Esto proporciona una plataforma plana para que el ratón pise y limita el riesgo de mordeduras.
6. Sosteniendo la mano abierta y plana con la palma hacia arriba, coloque la otra mano adyacente a la mano que sostiene el mouse y permita que el mouse se mueva libremente de una mano a otra sin ninguna restricción (Figura 1B).
7. Deje que el ratón explore y se mueva entre las manos durante 1 minuto.
   1. En este punto, los ratones pueden intentar saltar. Coloque las manos de tal manera que si el ratón salta, aterrizará en una encimera en lugar de en el suelo.
   2. Si un ratón parece que se está preparando para saltar (moviéndose hacia el borde de la mano y levantándose sobre las patas traseras), coloque lentamente la otra mano frente a él y trate de guiarlo para que camine sobre esta mano. Evite los movimientos bruscos, ya que aumenta su riesgo de saltar.
   3. Si un ratón salta, intente levantarlo evitando el manejo de la cola y reanude la sesión de manejo. Si el ratón permanece en el suelo o fuera de las manos durante más de 10 s, agregue tiempo adicional a la sesión de manejo para compensar cualquier momento en que el mouse estuviera fuera de las manos.
   4. Toma notas del salto. El número total de saltos se puede utilizar para evaluar la variabilidad potencial entre los animales.
8. Después de 1 minuto de manipulación con las manos planas, relaje la palma de la mano y coloque ligeramente el mouse en la mano, antes de rodar suavemente el mouse entre las manos(Figura 1C).
   1. Para "rodar", coloque el mouse en la palma de la mano, en una mano plana, perpendicular a los dedos.
   2. Cierre lentamente la mano, colocando los dedos en la parte posterior del mouse.
   3. Coloque la mano libre directamente debajo de la mano que sostiene el mouse.
   4. Gire / gire lentamente la mano con el mouse para transferir suavemente el mouse a la otra mano (giro de 180 °).
   5. Repite esto de un lado a otro entre las manos.
9. Alternar entre suaves manos y exploración libre en manos abiertas durante 60 s, alternando entre técnicas aproximadamente cada 20 s.
10. Realizar una "prueba de refugio"(Figura 1D).
    1. Deje que el mouse se mueva hacia el borde de la mano y luego junte las 2 manos.
    2. Muy lentamente, cúberlos para que el ratón quepa dentro de un "refugio" formado por las manos. Deje una abertura para que el ratón pueda escapar si es necesario.
    3. Trate de mantener al ratón en el refugio durante 5-10 s, sin ninguna restricción.
    4. Alterne entre la prueba de refugio, ruede entre manos y exploración libre de manos abiertas durante otros 60 s, asegurándose de realizar el paso de refugio 3 o más veces.
11. En todos los procedimientos descritos en 2.10, no apresure el proceso. Si el ratón parece estresado (es decir, tentativo para escapar, salta de las manos, evita el contacto con las manos, etc.) al estar confinado dentro de las manos, continúe rodando entre las manos y la exploración libre durante 20 s, y luego vuelva a intentarlo.
12. Hito: Realice al menos 1 prueba de refugio exitosa de 10 s para completar el Día 1.
    1. Considere una prueba de refugio exitosa cuando el ratón permanezca en las manos. Si el ratón saca la cabeza y regresa al refugio, sigue siendo una prueba exitosa. Si el animal sale por completo del refugio, es un fracaso.
13. Permita la exploración libre en las manos durante 30 s.
14. Reemplace suavemente el mouse en su jaula. Si está alojado en grupo, coloque el ratón en la jaula temporal hasta que se manipulen todos los compañeros de jaula. Devuelva a los ratones a su jaula original recogiéndolos en la palma de la mano. No use un recogen de cola.
15. Limpie la mesa de trabajo de heces y orina potenciales con etanol al 70%.
16. Enjuague bien los guantes con etanol al 70% (o una solución de limpieza adecuada) o cámbiese los guantes antes de manipular el siguiente ratón (es posible mantener los mismos guantes para los compañeros de jaula).
    NOTA: Se recomienda realizar el manejo con un número razonable de animales para evitar la fatiga del manejador. El manejo de 24 ratones toma alrededor de 2 h y se recomienda no exceder los 24 ratones por manejador. Si es necesario manipular más animales, se recomienda tener varios manipuladores o dividir los procedimientos de manipulación en subgrupos durante varios días.

3. DÍA 2: 3 a 5 min por ratón

1. Intente levantar el ratón en la palma de la mano. En esta etapa, ya debería ser factible y los ratones no deberían saltar de la mano.
2. Comience con la palma abierta como en el día 1, lo que permite que el mouse explore libremente durante 20 s.
3. Luego, haga rodar el mouse entre las manos varias veces (4-5 veces).
4. Realizar la "prueba de refugio" durante 5 s.
5. Repita la prueba de refugio varias veces (~ 5-6) durante un período de 2 a 3 minutos.
6. Durante el mismo período de 2 a 3 minutos, alterne con el rollo entre manos y exploración libre del paso de manos abiertas desde el día 1 para mejorar la habituación.
   1. Toque el ratón en su cabeza y espalda(Figura 1E),5-6 veces. Un signo de habituación es cuando el ratón te permite tocarlo sin intentar escapar.
   2. Realizar un "nose poke": Intenta tocar el hocico del ratón, de 2 a 3 veces(Figura 1F).
      1. Si el ratón intenta morder o muestra signos obvios de estrés al ser tocado, no intente inmediatamente que la nariz vuelva a pinchar. En su lugar, alterne con la exploración de mano plana y el balanceo. La "habituación" se refleja en que el animal no huye o gira la cabeza en casos de contacto humano.
7. En todos los procedimientos descritos en 3.4-3.6, no apresure el proceso. Si el ratón parece estresado por estar confinado dentro de las manos o no quiere ser tocado, continúe rodando entre manos durante 20-30 s y luego vuelva a intentarlo.
8. Hitos: Realice al menos 1 golpe de nariz exitoso durante 2-3 s para completar el Día 2.
9. Detenga esta sesión después de aproximadamente 3 minutos de manejo si el animal reacciona bien al "refugio", "acariciar la cabeza", "empujar la nariz", y si el ratón parece estar dispuesto a explorar las manos sin signos de estrés.
10. Si el ratón continúa mostrando signos de estrés o no está reaccionando bien a la prueba de "refugio" o "golpe de nariz", continúe la sesión hasta llegar a los 5 minutos como en el Día 1.
11. Reemplace el mouse en su jaula, limpie la mesa de trabajo y los guantes como en el Día 1.

4. DÍA 3: Alrededor de 3 min por ratón

1. En el tercer día, proceda a través de los mismos pasos que en el Día 2, durante 2 a 3 minutos.
   1. Levante el ratón en la palma de la mano.
   2. Transfiera y ruede el ratón entre las manos
   3. Realice una prueba de refugio.
   4. Trate de acariciar al ratón en la espalda y la cabeza.
2. Alterne entre estos pasos durante aproximadamente 1 a 2 min.
3. Continúe el procedimiento hasta que el ratón esté lo suficientemente relajado como para sentarse en la palma de la mano sin intentar escapar.
4. Antes del final del día 3, repita la prueba de refugio y la prueba de empuje nasal como una prueba de habituación.
   1. Si ambas pruebas se pueden completar en su primer intento, el proceso de habituación está completo. Continúe manipulando suavemente el mouse durante 30 s a un minuto.
   2. Si el ratón es inicialmente resistente a cualquiera de las pruebas, repita los pasos 4.1-4.3 durante 20-30 s antes de volver a perforar la prueba de nariz y refugio.
   3. Si el ratón permanece resistente a estas pruebas después de 3 min, se puede repetir el tercer día.
5. Hitos: Realice al menos 2 pruebas de refugio exitosas de 10 s cada una, y 2 pruebas de perforación de nariz exitosas para completar el Día 3 y completar todo el procedimiento de manejo 3D.
6. Devuelva el ratón a su jaula, limpie la mesa de trabajo y los guantes.

5. Enfoque opcional para que los animales sean sometidos a sujeción para inyección o sonda

NOTA: El día 3, si el animal será restringido con fines experimentales (sonda oral, inyección intraperitoneal, etc.), los ratones pueden ser sometidos a la prueba de pellizco de cuello.

1. Agarre la nuca entre el pulgar y el índice (Figura 1G).
2. Levante el ratón 3-5 cm por encima de la mano durante 2-3 s.
   NOTA: Esta es normalmente una posición no natural para ratones adultos, y si los ratones permanecen casi inmóviles, están bien habituados a la manipulación y serán fáciles de restringir con fines experimentales.
3. Vuelva a colocar el mouse en la mano plana, o si el mouse es reactivo al pellizco del cuello, considere colocarlo en la manga del experimentador, la tapa de la jaula o la encimera.
   NOTA: Si trabaja en un gabinete de bioseguridad, no coloque el mouse en la manga o podría subir y salir del gabinete de bioseguridad. Prefiere colocar el ratón en la encimera dentro del gabinete de bioseguridad.
4. Deje que el ratón explore libremente la mano del experimentador durante 1 minuto.

6. Enfoque opcional para días adicionales de manipulación

1. En la eventualidad de una línea de ratón altamente estresada, agregue días adicionales para disminuir la reactividad y el nivel de estrés de los animales, utilizando los métodos descritos en el Día 2/3.
   NOTA: Muchos factores pueden afectar el estrés basal de los animales, incluida la tensión, la presencia de modificación transgénica, la edad, el sexo y las condiciones de alojamiento. Si estos factores no son consistentes entre grupos como los animales envejecidos que se someten a pruebas contra controles jóvenes o los animales transgénicos que se prueban contra controles de tipo salvaje, se recomienda que se utilice el mismo número de días de habituación para cada grupo.

7. Manejo de túneles

NOTA: Esta técnica es aplicable solo a los ratones manejados por túneles. Los túneles son tubos de policarbonato de aproximadamente 13 cm de longitud y 5 cm de diámetro.

1. Coloque el túnel en la jaula del ratón.
2. Deje el túnel en la jaula durante 7 días antes de la manipulación.
3. Abra la jaula y coloque la tapa en el costado.
4. Guíe suavemente al ratón hacia el túnel de policarbonato (ya en la jaula).
5. Levante el túnel de la jaula, horizontalmente. Si es necesario, cubra libremente los extremos del túnel para evitar que el animal salte / se caiga del túnel, potencialmente cayendo en su jaula o en el suelo.
6. Mueva al animal en el túnel lejos de la jaula de la casa y manténgalo alejado de cualquier superficie durante 30 s.
7. Coloque el túnel de nuevo en la jaula de la casa, permitiendo que el ratón salga del tubo.
8. Espere 60 s y luego repita los pasos 7.4-7.7 una vez.
9. Enjuague bien los guantes con etanol al 70% o cámbiese los guantes antes de habituar al siguiente ratón.
10. Repita este procedimiento durante 10 días consecutivos.

8. Manejo de la cola

NOTA: Esta técnica es aplicable solo a los ratones con mango de cola. Se utiliza para transferir ratones de su jaula a un aparato, y viceversa.

1. Abra la jaula y coloque la tapa en el costado.
2. Agarre a los ratones por la base de la cola entre el pulgar y el índice.
3. Levante el ratón de la jaula.
4. En 2-3 s, transfiera el ratón al antebrazo opuesto del experimentador mientras mantiene un agarre en la cola para evitar que el ratón cuelgue.
5. Cuando se requiere el manejo de la cola en la implementación de este experimento (por ejemplo, antes de las extracciones de sangre para la prueba de cortisol), los animales se transfieren al antebrazo del experimentador mediante el manejo de la cola y se mantienen durante 15 s antes de ser devueltos a su jaula.

9. Laberinto Elevado Plus

1. Configuración de la habitación
   1. Coloque el laberinto en el centro de la habitación, debajo de una cámara digital equipada con una tarjeta de memoria.
   2. Configure la luz de la habitación a ~ 60 Lux usando 2 lámparas de pie colocadas detrás del laberinto.
   3. Apague cualquier iluminación cenital para evitar la luz directa en el laberinto que crea reflejo e interrumpe la detección de los animales en el laberinto.
   4. Una vez que todo el equipo esté configurado, transfiera a los animales a la habitación y déjelos aclimatarse a la configuración de luz y al nuevo entorno durante 30 minutos.
2. Ensayo
   1. Limpie el laberinto con etanol al 70% para evitar olores de polvo o del animal que fue probado previamente.
   2. Inicie la cámara.
   3. Use un pedazo de papel con la identificación del animal para grabar la identificación en el video, antes de colocar al animal en el laberinto (esto facilitará la identificación adecuada de qué ratón se está filmando en cada video).
   4. Utiliza la técnica de manipulación adecuada a cada animal para trasladarlo al laberinto.
   5. Coloque el ratón en la plataforma central, mirando hacia un brazo abierto.
   6. Permita que el ratón explore el aparato durante 10 minutos, sin ser molestado.
   7. Después de 10 minutos, detenga la cámara.
   8. Recupera el ratón del laberinto y vuelve a ponerlo en su jaula.
   9. Limpie las heces y la orina del laberinto con etanol al 70%.
   10. Una vez que se complete la prueba con todos los ratones, transfiera videos desde la tarjeta de memoria a una computadora para el seguimiento de video.
   11. Utilizando un software automatizado de seguimiento de animales, rastree el número de entradas a los brazos abiertos y cerrados, y el tiempo pasado en brazos abiertos o cerrados (aquí Ethovision XT 14).

10. Experimenter Interaction (derivado de Hurst y West⁹⁾

1. Configuración de la habitación
   1. Coloque una mesa en el centro de la sala de pruebas debajo de una cámara digital equipada con una tarjeta de memoria.
   2. Configure la luz a 50-70 Lux con 4 bombillas colocadas en la esquina de la habitación mirando hacia el techo. Apague la iluminación cenital para evitar la luz directa en el laberinto que crea reflejos e interrumpe la detección de los animales en la arena.
   3. Lleve a los animales a la habitación.
   4. Déjelos aclimatarse a la habitación durante 30 minutos.
2. Experimento
   1. Coloque la jaula doméstica debajo de la cámara digital.
   2. Retire la tapa.
   3. Retire el material de anidación y otro enriquecimiento que pueda interferir con el seguimiento de los animales.
   4. Inicie la cámara.
   5. Use la tarjeta de la jaula con la identificación del animal para identificar al animal en el video.
   6. Coloque una mano en la jaula de la casa a lo largo de la pared de la jaula en la parte delantera derecha.
      1. Asegúrese de que la cabeza del manipulador no esté bloqueando la cámara para filmar el ratón.
   7. Inicie un temporizador.
   8. Mantenga la mano inmóvil durante 2 minutos y deje que el mouse explore la mano.
   9. Retire la mano de la jaula durante 15 s.
   10. Intente levantar el mouse con las manos ahuecadas y registre si el mouse huye.
   11. Repita el último paso hasta cinco veces, cada 5 segundos, o hasta que el ratón se permita recoger.
   12. Registre el número de intentos necesarios para levantar el ratón.
   13. Devolver el material de anidación y enriquecimiento a la jaula.
   14. Limpie los guantes con etanol al 70% o cámbiese los guantes antes de pasar al siguiente animal.
   15. Después de la prueba, transfiera videos de la tarjeta de memoria a una computadora.
   16. Utilizando un software de seguimiento de video automatizado, divida la jaula en cuatro cuadrantes iguales y registre el tiempo que pasa el mouse en cada cuadrante (aquí, Ethovision XT 14).

11. Novedad Alimentación suprimida

1. Privación de alimentos
   1. 3 días antes de la prueba, realice un cambio de jaula completo y aloste a los animales (es preferible una sola vivienda para realizar la prueba de jaula en el hogar).
      NOTA: Proporcionar ropa de cama fresca elimina el polvo potencial o los pequeños trozos de comida que se acumulan en la ropa de cama desde el último cambio de jaula.
   2. El día antes de la prueba, pese a todos los animales alrededor de las 6 pm.
   3. Retire toda la comida de la tolva de alimentos y asegúrese de que no haya trozos de comida en la jaula o en la ropa de cama.
2. Configuración de la habitación
   1. Coloque la cámara NSF sobre una mesa.
   2. Llene la cámara con una capa delgada de ropa de maíz (u otra ropa de cama que sea diferente de la ropa de cama utilizada en la jaula doméstica de los animales).
   3. Coloque la luz a 70 Lux con 4 bombillas colocadas en la esquina de la mesa donde se encuentra la cámara, mirando hacia el techo. Apague las luces de techo para mantener la iluminación baja de la habitación.
   4. Coloque un pellet de chow estándar utilizado en la instalación, en el lado de la cámara frente al experimentador (a ≈10 cm de la pared).
3. Ensayo
   1. Por la mañana después de la privación de alimentos, lleve a los animales a la habitación 30 minutos antes de la prueba para que se aclimaten a la configuración de luz y al nuevo entorno.
   2. Pesar a todos los animales para medir su pérdida de peso en función del peso medido el día anterior. Los animales deben perder un 8-12% durante la noche para poder realizar la tarea correctamente.
   3. Ordene los animales por pérdida de peso y cribalos a partir del ratón que más perdió hasta el ratón que perdió menos peso.
   4. Asegúrese de que la cámara esté llena de ropa de cama y con un solo pellet.
   5. Coloque al animal en el lado opuesto de la cámara, lejos del pellet de comida.
   6. Inicie el temporizador inmediatamente.
   7. Deje que el ratón explore la cámara durante un tiempo de hasta 12 minutos.
   8. Mida la latencia para acercarse y alimentarse (el animal debe morder y comer) en el pellet de alimento.
      1. Considéralo como un acercamiento cuando el animal se acerca al pellet, lo huele y no muerde.
      2. Defina una mordedura como cuando el animal comienza a consumir el pellet.
   9. Registre la latencia para acercarse y alimentarse del pellet en segundos.
   10. Una vez que el ratón se haya alimentado de la bolita de comida, retire el ratón de la cámara.
   11. Deseche la ropa de cama, pero guarde el pellet que se utilizará para probar la unidad de apetito en la jaula casera del ratón.
   12. Reinicie la cámara para el siguiente animal y continúe con el siguiente animal.
   13. 15 minutos después de completar la prueba en la cámara, deje caer el pellet utilizado durante la prueba, dentro de la jaula doméstica del ratón, contra la pared en la parte delantera de la jaula.
   14. Mida la latencia para alimentarse del pellet cuando el pellet está en la jaula doméstica. Esta es una medida para el impulso del apetito.
       1. Es preferible quitar el material de anidación para asegurarse de que el ratón vea el pellet que se deja caer en su jaula.

12. Recolección de suero y medición de corticosterona

1. Manipule animales durante 1 minuto utilizando la técnica asignada, 15 minutos antes de la recolección de sangre (esto se puede hacer con animales alojados en grupo o en una sola casa, teniendo en cuenta el riesgo de peleas al reagrupar ratones).
   1. Para los ratones manejados por el túnel, guíelos al túnel, levante el túnel de la jaula durante 1 minuto y reemplace al ratón en su jaula.
   2. Para los ratones con mango de cola, agarre la base de la cola del ratón y retire el ratón de su jaula. Transfiera el ratón a la funda de los experimentadores durante 1 minuto y devuelva el ratón a su jaula mediante el manejo de la cola.
   3. Para ratones con mango 3D, use manos ahuecadas para sacar el mouse de su jaula. Sostenga el ratón en manos ahuecadas durante 1 minuto y devuélvalo a su jaula.
2. 15 min después de la manipulación, proceda a la extracción de sangre de la vena submandibular²².
3. Desaliña firmemente el ratón de tal manera que la cabeza del ratón quepa inmovilizada de forma segura.
4. Localice el sitio de la punción.
   1. Hay un pequeño hoyuelo sin pelo a lo largo de la mandíbula de la cara que se puede usar como punto de referencia para localizar el sitio de la punción. Dibujando una línea entre la base de la mandíbula y este hoyuelo, el sitio de punción se encuentra detrás de este hoyuelo hacia la oreja en aproximadamente 5 mm, justo detrás de la bisagra de la mandíbula.
5. Sostenga una aguja limpia de 23 G perpendicular al sitio de la punción y use un movimiento de punción firme rápido. La punta de la aguja debe penetrar a una profundidad entre 1-2 mm, la sangre fluirá inmediatamente tan pronto como se perfore la vena.
6. Recolectar ~ 150 μL de sangre en tubos de recolección recubiertos de EDTA y almacenarlos en hielo.
7. Aplique una ligera presión con una gasa estéril en el sitio de punción durante 5 s o más para permitir que la sangre se coagule.
8. Una vez que la sangre se haya coagulado, devuelva al ratón a su jaula de origen.
9. Centrífuga de sangre a 4 °C 3.500 x g durante 10 min.
10. Decantar el sobrenadante.
11. Guarde el sobrenadante a -20 °C para análisis posteriores.
12. Mida los niveles de corticosterona utilizando un kit ELISA de corticosterona siguiendo el protocolo del fabricante.
13. Utilice un espectrofotómetro para leer los resultados de ELISA.

Resultados

Se realizaron dos estudios separados con ratones C57BL/6. Los #1 del estudio incluyeron hombres de 6 meses de edad y #2 de estudio incluyeron mujeres de 2,5 meses de edad (N = 36 / estudio) de Jackson Laboratories (Cat #000664). Los ratones llegaron a las instalaciones a la edad de 2 meses. Mientras que las mujeres #2 del Estudio fueron manipuladas y evaluadas dos semanas después de su llegada, el Estudio #1 los hombres solo fueron manipulados y probados a la edad de 6 meses (retraso debido al cierre de la pandemia mund...

Discusión

Este estudio y desarrollo de métodos se basan en la observación de que las técnicas de manejo en ratones todavía son pasadas por alto por la comunidad científica, y que algunos laboratorios aún son reacios a implementar técnicas de habituación o manejo para reducir el estrés y la reactividad de sus animales antes de los experimentos. Si bien representa un compromiso de tiempo, el manejo de animales proporciona efectos beneficiosos para los animales que pueden contribuir al éxito de los experimentos a realizar y...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
23 G x 1 in. BD PrecisionGlide general use sterile hypodermic needle. Regular wall type and regular bevel.	BD	2546-CABD305145	Needles for Blood collection
BD Vacutainer® Venous Blood Collection EDTA Tubes with Lavender BD Hemogard™ closure, 2.0ml (13x75mm), 100/pk	BD	367841	EDTA Coated tubes for blood collection
Bed’o cobs ¼” Corn cob laboratory animal bedding	Bed-O-Cobs	BEDO1/4	Novel bedding for novelty suppressed feeding
Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5424 R	For centrifugation of blood.
Corticosterone ELISA Kit	Arbor Assays	K003-H1W
Digital Camera	Panasonic	HC-V770	Camera to record EPM/Experimenter interactions
Elevated Plus Maze	Home Made	n/a	Custom Maze made of four black Plexiglas arms (two open arms (29cm long by 7 cm wide) and two enclosed arms (29 cm long x7 cm wide with 16 cm tall walls)) that form a cross shape with the two open arms opposite to each other held 55 cm above the floor
Ethanol	Medstore House Brand	39753-P016-EA95	Dilute to 70% with Distilled water, for cleaning
Ethovision XT 15	Noldus	n/a	Automated animal tracking software
Laboratory Rodent Diet	LabDiet	Rodent Diet 5001	Standard Rodent diet
Memory Card	Kingstone Technology	SDA3/64GB	For video recording and file transfer
Novelty Suppressed Feeding Chamber	Home Made	n/a	Custom test plexiglass test chamber with clear floors and walls 62cm long, by 31cm wide by 40cm tall .
Parlycarbonate tubes	Home Made	n/a	13 cm in length and 5cm in diameter
Purina Yesterday’s news recycled newspaper bedding	Purina	n/a	Standard Bedding
Spectrophotometer	Biotek	Epoch Microplate Reader