Farelerde Stresi Azaltmak için Elleçleme Teknikleri

Özet

Bu makalede, farelerde anksiyete benzeri davranışları azaltarak rutin elleçlemeyi kolaylaştıran ve mevcut iki ilgili teknikle (tünel ve kuyruk elleçleme) ayrıntıları sunan 3D işleme tekniği açıklanmaktadır.

Özet

Laboratuvar hayvanları bilim adamları veya hayvan bakım sağlayıcıları tarafından birden fazla manipülasyona maruz kalır. Bunun neden olduğu stres hayvan refahı üzerinde derin etkilere sahip olabilir ve ayrıca anksiyete önlemleri gibi deneysel değişkenler için şaşırtıcı bir faktör olabilir. Yıllar geçtikten sonra, elleçleme ile ilgili stresi en aza indiren elleçleme teknikleri, farelere özel bir odaklanma ve farelere çok az dikkat ile geliştirilmiştir. Bununla birlikte, farelerin işleme teknikleri kullanılarak manipülasyonlara alışabileceği gösterilmiştir. Fareleri elleçlemeyi alışkanlık haline getirmek stresi azaltır, rutin kullanımı kolaylaştırır, hayvan refahını artırır, veri değişkenliğini azaltır ve deneysel güvenilirliği artırır. Kullanımın yararlı etkilerine rağmen, özellikle stresli olan kuyruk toplama yaklaşımı hala yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu makale, insan etkileşimi sırasında hayvanın yaşadığı stresi en aza indirmeyi amaçlayan yeni geliştirilen bir fare işleme tekniğinin ayrıntılı bir açıklamasını ve gösterimini sunmaktadır. Bu manuel teknik 3 gün boyunca gerçekleştirilir (3D işleme tekniği) ve hayvanın deneyciye alışkanlık yapma kapasitesine odaklanır. Bu çalışma ayrıca daha önce kurulmuş tünel işleme tekniklerinin (polikarbonat tünel kullanarak) ve kuyruk toplama tekniğinin etkisini göstermektedir. Özellikle incelenenler, davranışsal testler (Elevated-Plus Maze ve Novelty Suppressed Feeding), deneycilerle gönüllü etkileşim ve fizyolojik ölçüm (kortikosteron seviyeleri) kullanarak anksiyete benzeri davranışlar üzerindeki etkileridir. 3D işleme tekniği ve tünel işleme tekniği anksiyete benzeri fenotipleri azalttı. İlk deneyde, 6 aylık erkek fareler kullanılarak, 3D işleme tekniği deneyci etkileşimini önemli ölçüde geliştirdi. İkinci deneyde, 2,5 aylık dişi kullanarak kortikosteron seviyelerini azalttı. Bu nedenle, 3D işleme, deneyciyle etkileşimin gerekli olduğu veya tercih edildiği veya deneme sırasında tünel işlemenin mümkün olmayabileceği senaryolarda yararlı bir yaklaşımdır.

Giriş

Fareler ve sıçanlar preklinik çalışmalar için temel varlıklardır^1,2 endokrinal, fizyolojik, farmakolojik veya davranışsal çalışmalar dahil olmak üzere birden fazla amaç için². Hayvanlarla ilgili artan sayıda çalışmadan, insan etkileşimi de dahil olmak üzere kontrolsüz çevresel değişkenlerin biyomedikal araştırma³, 4^,5'teçeşitli sonuçları etkilediği ortaya çıktı. Bu, deneyler ve araştırma laboratuvarları^4,5, hayvan araştırmalarında büyük bir uyarı oluşturan önemli değişkenliklerden sorumludur.

Çevresel stresörlerin etkisini sınırlamak ve reaktiviteyi insan etkileşimine indirgemek amacıyla çeşitli yaklaşımlar uygulanmıştır. Örneğin, çevresel stresörlerin etkisini sınırlamak için laboratuvarlarda konut koşullarının standardizasyonu ve otomatik konut sistemleri^6,7 uygulanmıştır. İnsanlarla etkileşimle ilgili olarak, hayvanları işlemek ve taşımak için yaygın olarak kullanılan yaklaşımlar, hayvan rahatsızlığı ve stresine çok az saygı duyardı. Örneğin, hayvanları kuyruklarından almak veya forseps⁸ kullanmak temel kaygıyı arttırır^9,10,11, keşif 9^,12'yi azaltır ve çalışmalar içinde ve genelinde bireyler arası değişkenliğe büyük katkıda bulunur^13,14. Sonuç olarak, fareler ve sıçanlar için geçerli olan bardak elleçleme tekniği gibi başka yaklaşımlar geliştirilmiştir. Bu yaklaşımda, hayvanlar kafeslerinden "fincanlanır" ve deneyciler tarafından elleri bir fincan oluşturan⁹, 10^,11. Kuyruk işlemeye bir başka yararlı alternatif, fareleri aktarmak için bir polikarbonat tünelin kullanılmasını içerir^9,10,15. Bu yaklaşım, fare ve deneyci arasındaki doğrudan etkileşimi ortadan kaldırır. Hem fincan hem de tünel yaklaşımları, kuyruk alma / kuyruk taşıma^9,10gibi aversive elleçleme teknikleri ile abartılabilecek anksiyete benzeri davranışları ve deneycinin korkusunu azaltmada etkinlik gösterdi.

Bu nedenle, artan kanıtlar, bireyler arasındaki değişkenliği azaltmak için uygun fare kullanımı^9,11ve hayvan refahını artırmak için yararlı olduğunu göstermektedir¹⁰. Bununla birlikte, yukarıda belirtilen teknikler hala sınırlamalarla karşı karşıyadır. Fincan elleçleme tekniği, tesis personeli ve deneyciler için önemli bir zaman dilimi olan 10 gün (2 hafta^16'da10 seans)^{ile 15 hafta 17}arasında değişen programlarla uygulanmıştır. Ek olarak, fincan elleçlemenin etkinliği, açık ellerde zorlanma⁹ ve geleneksel fincan kullanımına göre değişir, naif farelere veya özellikle gergin suşların elden atlasına neden olabilir^9,18. Tünel işleme, daha tutarlı ve genellikle daha hızlı sonuçlarla sonuçlanır ve^19'uhafife alıp verdirür. Tüneller ev kafesi zenginleştirme olarak da kullanılır. Hayvanların hızlı bir şekilde idare etmelerine yardımcı olmak ve zenginleştirmenin ek faydalarını sağlamak. Bununla birlikte, tünel işleme, hayvanları aparatlar arasında aktarırken sınırlamalara sahiptir. İlginçtir ki, Hurst ve West⁹ve Henderson ve ark.^20, hayvanları tünelden aparatlara aktarmak için nazik ve kısa manuel elle elleçleme kullanmanın fenotiplerini etkilemediğini gösterdi.

Mevcut yöntemlere bir alternatif sağlamak için, kısa bir süre içinde ulaşılabilir alışkanlıkla, bu makalede fincan işleme tekniğini genişleten ve bu nedenle belirli bir ekipman gerektirmeyen yeni bir teknik açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, farelerin elleçleme işlemiyle sahip olduğu konfor seviyesini ölçmek için kilometre taşlarını kullanır. Fare reaktivitesini ve stresini azaltmada (davranışsal ve hormonal seviyelerde) etkinliği gösterir, rutin kullanımı kolaylaştırır ve hayvanlar arasındaki değişkenliği azaltmaya katkıda bulunur. Bu tekniğin ayrıntıları burada verilmiştir ve anksiyete benzeri davranışları azaltma, deneycilerle etkileşimi geliştirme ve periferik stres hormonu (kortikosteron) salınımını sınırlamadaki etkinliği, tünel işleme (pozitif kontrol) ve kuyruk elleçleme teknikleri (negatif kontrol) ile karşılaştırıldığında iki ayrı çalışmada gösterilmiştir.

Protokol

Hayvan denekleri ile ilgili prosedürler CAMH hayvan bakım komitesi tarafından onaylandı ve Kanada Hayvan Bakımı Konseyi yönergelerine uygun olarak yürütüldü.

NOT: Burada açıklanan işleme yöntemi, transgenik olmayan (C57/BL6, BalbC, CD1, SV129, vb.) ve transgenik çizgiler dahil olmak üzere çeşitli fare suşlarında kullanılabilir. Genç veya yaşlı farelerle de kullanılabilir, genç yetişkin (4-6 haftalık) farelerin özellikle 1. günde yetişkin veya yaşlı farelerden biraz daha aktif olma eğiliminde olduğunu belirterek.

1. Deneysel hazırlık

1. Çalışma başlatmadan önce, ARRIVE yönergeleri²¹uyarınca, her işleme grubuna (3D-Handling, Tunnel Handling veya Tail Handling) rastgele fare atayın.
2. İşlemeyi gerçekleştirmek için odayı tanımlayın. Konut odasında veya ayrı bir odada gerçekleştirilebilir. Elleçleme, hayvanların hareketli bir sepette taşınmasını gerektiren ayrı bir odada yapılırsa, hayvanların elleçleme protokolünün başlatılmasından önce 20-30 dakika boyunca yeni odaya alışmasına izin verin.
3. Grup ev hayvanları için, fareleri ilk ev kafeslerinde yeniden toplanmadan önce, taşımadan sonra barındırmak için geçici bir kafes kullanın. Bu, elleçlemeden önce hayvanlar arasındaki potansiyel kavgaları azaltır (özellikle erkeklerde).
4. Bir tezgahta (tercihen temizlenmiş bir tezgah) veya bir biyogüvenlik kabininde, konut kafesi hayvandan uzakta ele alınarak çalışın. Konut kafesine yakınlık atlama riskini artırır. Hayvanlar grup tarafından barındırılırsa, farenin ev kafesine atlaması kafes eşlerine strese neden olabilir.
   NOT: Biyogüvenlik kabininde çalışmak farelerin yere atlama riskini sınırlar ve belirli tesislerde gerekli olabilir. Bu teknik, biyogüvenlik kabininin içindeki tüm adımları her zaman gerçekleştirdiğinden emin olarak ve işleyici ön ellerde yürüyen farelerden kaçınarak bir biyogüvenlik kabininde kullanılabilir.

2. GÜN 1: Fare başına 5 dk

1. Kafesi yavaşça açın ve kapağı yana yerleştirin, yuva malzemelerini çıkarın ve tekerlekler veya barınaklar gibi diğer zenginleştirmeleri çıkarın.
2. Eldivenli bir açık eli ev kafesine tanıtın, eli yavaşça kafes duvarının bir tarafına yerleştirin (işleyiciye en yakın duvar, Şekil 1A).
   1. Hemen fareyi almaya çalışmayın.
3. Hareketsiz kalın ve hayvanın kafesteki elin varlığına yaklaşık 30 sn alışmasına izin verin.
4. Fareyi avucunun içinde almaya çalış (yani, hayvanı kuyruğundan almaktan kaçının).
   1. Fare 3 denemeden sonra kolayca alınmazsa, fareyi iki elinizle bir köşeye ve fincana yönlendirin.
   2. Bardaklı elleri yavaşça fareye doğru hareket ettirin ve almaya çalışın.
   3. Her iki elinizle en fazla 3 denemeden sonra başarısız olursa, fareyi kuyruğunun tabanından hafifçe alın ve kolunuza veya düz elinize aktarın.
5. Fare elinizdeyken, eli mümkün olduğunca düz ve açık tutun.
   NOT: Bu, farenin üzerine basması için düz bir platform sağlar ve ısırık riskini sınırlar.
6. Eli avuç içi yukarı bakacak şekilde açık ve düz tutarak, diğer elinizin fareyi tutan elin yanına yerleştirin ve farenin herhangi bir kısıtlama olmadan elden ele serbestçe hareket etmesine izin verin (Şekil 1B).
7. Farenin keşfetmesine ve 1 dakika boyunca eller arasında hareket etmesine izin verin.
   1. Bu noktada fareler atlamaya çalışabilir. Elleri, fare atlarsa, zeminden ziyade bir tezgaha inecek şekilde konumlandırın.
   2. Bir fare zıplamaya hazırlanıyor gibi görünüyorsa (elin kenarına doğru hareket ediyor ve arka ayaklarda yetiştiriyor), diğer elini yavaşça önüne yerleştirin ve bu ele yürümeye yönlendirmeye çalışın. Atlama risklerini artırdığı için ani hareketlerden kaçının.
   3. Bir fare atlarsa, kuyruk işlemeden kaçınarak onu almaya ve işleme oturumuna devam etmeye çalış. Fare 10 s'den fazla yerde veya ellerden uzak kalırsa, farenin ellerden çıktığı herhangi bir zamanı telafi etmek için taşıma oturumuna ek süre ekleyin.
   4. Atlayışın notlarını al. Toplam atlama sayısı, hayvanlar arasındaki potansiyel değişkenliği değerlendirmek için kullanılabilir.
8. Düz ellerle 1 dakika el ele tutuştuktan sonra, fareyi eller arasında hafifçe yuvarlamadan önce, elin avuç içini gevşetin ve fareyi hafifçe elin içine koyun (Şekil 1C).
   1. "Yuvarlamak" için, fareyi elin avucunun içine, düz bir ele, parmaklara dik olarak yerleştirin.
   2. Parmakları farenin arkasına yerleştirerek eli yavaşça kapatın.
   3. Serbest eli doğrudan fareyi tutan elin altına yerleştirin.
   4. Fareyi yavaşça diğer ele aktarmak için fareyle birlikte eli yavaşça çevirin /döndürün (180° çevirin).
   5. Bunu ellerin arasında ileri geri tekrarlayın.
9. Eller arasında hafifçe yuvarlanmaktan ve 60 s boyunca açık ellerde serbest keşiften, her 20 s'de bir teknikler arasında geçiş yaparak değiştirin.
10. Bir "barınak testi" gerçekleştirin (Şekil 1D).
    1. Farenin elin kenarına hareket etmesine izin verin ve ardından 2 eli bir araya getirin.
    2. Çok yavaşça, farenin eller tarafından oluşturulan bir "sığınağın" içine sığması için onları fincanlayın. Gerekirse farenin kaçabilmesi için bir açıklık bırakın.
    3. Fareyi herhangi bir kısıtlama olmadan 5-10 sn boyunca barınakta tutmayı hedefleyin.
    4. Barınak testi arasında geçiş yaparak, barınak adımını 3 veya daha fazla kez gerçekleştirdönde emin olarak, eller arasında yuvarlanın ve açık ellerin 60 s daha serbest keşfi.
11. 2.10'da açıklanan tüm prosedürlerde, işlemi acele etmeyin. Fare stresli görünüyorsa (yani, kaçmak için belirsiz, ellerden atlar, ellerle temastan kaçınır vb.) ellerin içine hapsedilerek, eller arasında yuvarlanmaya ve 20 s boyunca serbest keşif yapmaya devam edin ve sonra yeniden deneyin.
12. Kilometre Taşı: 1. Günün tamamlanması için 10 sn'lik en az 1 başarılı barınak testi gerçekleştirin.
    1. Fare ellerde kaldığında bir barınak testinin başarılı olduğunu düşünün. Fare başını dışarı çıkarır ve sığınağa dönerse, yine de başarılı bir testtir. Hayvan barınaktan tamamen çıkarsa, bu bir başarısızlıktır.
13. 30 sn boyunca ellerde ücretsiz keşiflere izin verin.
14. Fareyi kafesinde yavaşça değiştirin. Grup barındırılırsa, fareyi tüm kafes montaj ilişkileri ele alınana kadar geçici kafese yerleştirin. Fareleri avuç içinde toplayarak orijinal kafeslerine geri koyun. Kuyruk açma kullanmayın.
15. Tezgah üst potansiyel dışkı ve idrar% 70 etanol ile temizleyin.
16. Eldivenleri% 70 etanol (veya uygun temizleme çözeltisi) ile iyice durulayın veya bir sonraki fareyi kullanmadan önce eldivenleri değiştirin (kafes arkadaşları için aynı eldivenleri tutmak mümkündür).
    NOT: İşleyiciden yorgun düşmemek için taşımanın makul sayıda hayvanla yapılması önerilir. 24 farenin elleçlemesi yaklaşık 2 saat sürer ve işleyici başına 24 fareyi geçmemeniz önerilir. Daha fazla hayvanın işlenmesi gerekiyorsa, birden çok işleyiciye sahip olmanız veya işleme yordamlarını birden çok gün içinde alt gruplara bölmeniz önerilir.

3. GÜN 2: Fare başına 3 ila 5 dakika

1. Fareyi avucunun içinde almaya çalış. Bu aşamada, zaten mümkün olmalı ve fareler elden atlamamalıdır.
2. 1. Günde olduğu gibi avuç içi açık olarak başlayın, farenin 20 s boyunca serbestçe keşfetmesini sağlar.
3. Ardından, fareyi birkaç kez (4-5 kez) eller arasında yuvarlayın.
4. 5 s için "barınak testi" gerçekleştirin.
5. Barınak testini 2 ila 3 dakikalık bir süre boyunca birkaç kez (~5-6) tekrarlayın.
6. Aynı 2 ila 3 dakikalık süre boyunca, eller arasındaki rulo ve açık ellerin serbest keşfi ile değiştirin, alışkanlığı geliştirmek için 1.
   1. Fareye kafasına ve sırtına dokunun (Şekil 1E), 5-6 kez. Alışkanlık belirtisi, farenin kaçmaya çalışmadan dokunmanıza izin vermesidir.
   2. Bir "Burun dürtme" gerçekleştirin: Farenin burnuna dokunmaya çalışın, 2 ila 3 kez (Şekil 1F).
      1. Fare ısırmaya çalışırsa veya dokunulma anında belirgin stres belirtileri gösterirse, hemen burun dürtmeye çalışmayın. Bunun yerine, düz el keşif ve rulo ile değiştirin. "Alışkanlık", hayvanın insan teması durumlarında kaçmaması veya başını çevirmemesi ile yansır.
7. 3.4-3.6'da açıklanan tüm prosedürlerde, süreci acele etmeyin. Fare ellerin içinde hapsedilerek stresli görünüyorsa veya dokunulmak istemiyorsa, 20-30 s boyunca eller arasında yuvarlanmaya devam edin ve sonra yeniden deneyin.
8. Kilometre Taşları: 2. Günün tamamlanması için 2-3 sn boyunca en az 1 başarılı burun dürtme gerçekleştirin.
9. Hayvan "barınak", "baş okşama", "burun dürtme" ve fare stres belirtisi göstermeden elleri keşfetmeye istekli görünüyorsa, yaklaşık 3 dakikalık kullanımdan sonra bu oturumu durdurun.
10. Fare stres belirtileri göstermeye devam ederse veya "barınak testi" veya "burun dürtme" testine iyi tepki vermiyorsa, 1.
11. Fareyi kafesinde değiştirin, tezgah üstünü ve eldivenleri 1.

4. GÜN 3: Fare başına yaklaşık 3 dakika

1. Üçüncü gün, 2 ila 3 dakika boyunca 2.
   1. Fareyi avucunun içinden al.
   2. Fareyi eller arasında aktarma ve yuvarlama
   3. Barınak testi yap.
   4. Fareyi arkada ve kafada sevmeye çalışın.
2. Bu adımlar arasında yaklaşık 1 ila 2 dakika arasında geçiş yapma.
3. Fare kaçmaya çalışmadan avucunun içine oturacak kadar rahatlayana kadar prosedüre devam edin.
4. 3. günün bitiminden önce, barınak testini ve burun dürtme testini alışkanlık testi olarak tekrarlayın.
   1. Her iki test de ilk denemelerinde tamamlanabilirse, alışkanlık işlemi tamamlanır. Fareyi 30 sn ile bir dakika arasında nazikçe işlemeye devam edin.
   2. Fare başlangıçta her iki teste de dayanıklıysa, burun dürtme ve barınak testini yeniden başlatmadan önce 20-30 s için 4.1-4.3 adımlarını tekrarlayın.
   3. Fare 3 dakika sonra bu testlere karşı dirençli kalırsa, üçüncü gün tekrarlanabilir.
5. Kilometre Taşları: Her biri 10 sn'lik en az 2 başarılı barınak testi ve 3.
6. Fareyi kafesine geri koyun, tezgah üstünü ve eldivenleri temizleyin.

5. Enjeksiyon veya gavage için kısıtlamaya tabi tutulacak hayvanlar için isteğe bağlı yaklaşım

NOT: 3. günde, hayvan deneysel amaçlarla (oral gavage, periton içi enjeksiyon vb.) kısıtlanacaksa, fareler boyun sıkışma testine tabi tutulabilir.

1. Başparmağı ve işaret parmağı arasındaki boynun ensesini kavrayın (Şekil 1G).
2. Fareyi 2-3 sn boyunca elin 3-5 cm yukarısına kaldırın.
   NOT: Bu normalde yetişkin fareler için doğal olmayan bir pozisyondur ve fareler hareketsiz kalırsa, elleçlemeye iyi alışırlar ve deneysel amaçlar için dizginlenmesi kolay olacaktır.
3. Fareyi düz ele geri yerleştirin veya fare boyun kıskacına tepkiliyse, deneycinin koluna, kafes kapağına veya tezgahına yerleştirmeyi düşünün
   NOT: Biyogüvenlik kabininde çalışıyorsanız, fareyi manşonun üzerine yerleştirmeyin, aksi takdirde yukarı çıkıp biyogüvenlik kabinine çıkabilir. Fareyi biyogüvenlik kabininin içindeki tezgahın üzerine yerleştirmeyi tercih edin.
4. Deneycinin elini 1 dakika boyunca serbestçe keşfetmek için fareyi bırakın.

6. Ek kullanım günleri için isteğe bağlı yaklaşım

1. Son derece stresli bir fare hattının durumunda, 2/3 Gün'de açıklanan yöntemleri kullanarak hayvanların reaktivitesini ve stres seviyesini azaltmak için ek günler ekleyin.
   NOT: Gerinim, transgenik modifikasyon varlığı, yaş, cinsiyet ve barınma koşulları dahil olmak üzere hayvanların temel stresini birçok faktör etkileyebilir. Bu faktörler, yaşlı hayvanların genç kontrollere karşı test edilmesi veya transgenik hayvanların vahşi tip kontrollere karşı test edilmesi gibi gruplar arasında tutarlı değilse, her grup için aynı sayıda alışkanlık gün kullanılması önerilir.

7. Tünel taşıma

NOT: Bu teknik yalnızca Tünel saplı fareler için geçerlidir. Tüneller yaklaşık 13 cm uzunluğunda ve 5 cm çapında polikarbonat borulardır.

1. Tüneli farenin kafesine yerleştirin.
2. Tünelden ayrılmadan önce 7 gün boyunca kafeste bırakın.
3. Kafesi açın ve kapağı yan tarafa yerleştirin.
4. Fareyi polikarbonat tünele (zaten kafeste) hafifçe yönlendirin.
5. Tüneli kafesten yatay olarak kaldırın. Gerekirse, hayvanın tünelden atlamasını / düşmesini, potansiyel olarak kafesine veya zemine geri düşmesini önlemek için tünelin uçlarını gevşek bir şekilde örtün.
6. Tüneldeki hayvanı ev kafesinden uzaklaştırın ve 30 s boyunca herhangi bir yüzeyden uzak tutun.
7. Tüneli ev kafesine geri yerleştirin ve farenin tüpe çıkmasına izin verin.
8. 60 s bekleyin ve 7.4-7.7 adımlarını bir kez yineleyin.
9. Eldivenleri% 70 etanol ile iyice durulayın veya bir sonraki fareyi alışkanlık haline getirmek için eldivenleri değiştirin.
10. Bu işlemi art arda 10 gün boyunca tekrarlayın.

8. Kuyruk taşıma

NOT: Bu teknik yalnızca Kuyruk saplı fareler için geçerlidir. Fareleri kafeslerinden bir aparatlara aktarmak için kullanılır ve bunun tersi de vardır.

1. Kafesi açın ve kapağı yan tarafa yerleştirin.
2. Fareleri başparmak ve işaret parmağı arasındaki kuyruğun tabanından kavrayın.
3. Fareyi kafesten kaldırın.
4. 2-3 s'de, farenin sarkmasını önlemek için kuyrukta bir kavrama korurken fareyi deneycinin karşı ön bıçağa aktarın.
5. Bu deneyin uygulanmasında kuyruk elleçleme gerektiğinde (örneğin, kortizol testi için kan çekilmeden önce) hayvanlar kuyruk elleçleme ile deneycinin önü kısmına aktarılır ve kafeslerine geri gönderilmeden önce 15 sn tutulur.

9. Yükseltilmiş Artı Labirent

1. Oda kurulumu
   1. Labirenti odanın ortasına, hafıza kartıyla donatılmış bir dijital kameranın altına yerleştirin.
   2. Labirentin arkasına yerleştirilmiş 2 duran lamba kullanarak odanın ışığını ~60 Lux'ta ayarlayın.
   3. Yansıma yaratan ve labirentteki hayvanların algılanmasını bozan labirentte doğrudan ışığı önlemek için herhangi bir tepe lambasını kapatın.
   4. Tüm ekipman kurulduktan sonra, hayvanları odaya aktarın ve 30 dakika boyunca ışık ayarlarına ve yeni ortama alışmalarını bekleyin.
2. Test etme
   1. Tozdan veya daha önce test edilen hayvandan gelen kokuları önlemek için labirenti% 70 etanol ile temizleyin.
   2. Kamerayı çalıştırın.
   3. Hayvanı labirente yerleştirmeden önce kimliği videoya kaydetmek için hayvan kimliğiyle birlikte bir kağıt parçası kullanın (bu, her videoda hangi farenin çekildiğinin doğru tanımlanmasını kolaylaştıracaktır).
   4. Labirente aktarmak için her hayvana uygun elleçleme tekniğini kullanın.
   5. Fareyi açık bir kola bakacak şekilde merkezi platforma yerleştirin.
   6. Farenin cihazı rahatsız edilmeden 10 dakika boyunca keşfetmesine izin verin.
   7. 10 dakika sonra kamerayı durdurun.
   8. Fareyi labirentten alın ve kafesine geri koyun.
   9. Labirentten% 70 etanol ile dışkı ve idrar temizleyin.
   10. Test tüm farelerle tamamlandıktan sonra, videoları video izleme için bellek kartından bir bilgisayara aktarın.
   11. Otomatik hayvan izleme yazılımı kullanarak, açık ve kapalı kollara giriş sayısını ve açık veya kapalı kollarda harcanan zamanı izleyin (burada Ethovision XT 14).

10. Deneyci Etkileşimi (Hurst ve Batı^9'dantüretilmiştir)

1. Oda kurulumu
   1. Test odasının ortasına hafıza kartıyla donatılmış bir dijital kameranın altına bir tablo yerleştirin.
   2. 50-70 Lux'taki ışığı, odanın tavana bakan köşesine yerleştirilmiş 4 ampulle ayarlayın. Yansıma yaratan labirentte doğrudan ışığı önlemek ve arenadaki hayvanların algılanmasını bozmak için tepe lambasını kapatın.
   3. Hayvanları odaya getirin.
   4. 30 dakika boyunca odaya alışmalarına izin verin.
2. Deney
   1. Ev kafesini dijital kameranın altına yerleştirin.
   2. Kapağı çıkarın.
   3. Hayvanların izlenmesini engelleyebilecek yuvalama malzemesini ve diğer zenginleştirmeyi kaldırın.
   4. Kamerayı çalıştırın.
   5. Videodaki hayvanı tanımlamak için hayvan kimliği ile kafes kartını kullanın.
   6. Ön sağ taraftaki kafesin duvarı boyunca ev kafesine bir el koyun.
      1. İşleyicinin kafasının fareyi çekmek için kamerayı engellemediğine emin olun.
   7. Bir zamanlayıcı başlatın.
   8. Eli 2 dakika hareketsiz tutun ve farenin eli keşfetmesine izin verin.
   9. Eli 15 s boyunca kafesten çıkarın.
   10. Bardaklı elleri kullanarak fareyi almaya ve farenin kaçıp kaçmadığını kaydetmeye çalış.
   11. Son adımı her 5 saniyede bir veya farenin alınmasına izin verene kadar beş kez tekrarlayın.
   12. Fareyi almak için gereken deneme sayısını kaydedin.
   13. Yuvalama malzemesini ve zenginleştirmeyi kafese geri verin.
   14. Eldivenleri% 70 etanol ile temizleyin veya bir sonraki hayvana geçmeden önce eldivenleri değiştirin.
   15. Test ettikten sonra, videoları bellek kartından bilgisayara aktarın.
   16. Otomatik video izleme yazılımı kullanarak kafesi dört eşit çeyreğe bölün ve farenin her çeyrekte harcadığı zamanı kaydedin (burada, Ethovision XT 14).

11. Yenilik Bastırılmış Beslenme

1. Gıda yoksunluğu
   1. Testden 3 gün önce, tam bir kafes değişimi ve hayvanları tek bir ev gerçekleştirin (ev kafesi testini yapmak için tek muhafaza tercih edilir).
      NOT: Taze yatak takımı sağlamak, son kafes değişiminden bu yana yataklarda biriken potansiyel tozu veya az miktarda yiyeceği temizler.
   2. Testlerden bir gün önce, tüm hayvanları saat 18:00 civarında tartın.
   3. Tüm yiyecekleri yemek haznesinden çıkarın ve kafeste veya yataklarda yiyecek parçası olmadığından emin olun.
2. Oda kurulumu
   1. NSF haznesini bir masaya yerleştirin.
   2. Odayı ince bir mısır yatağı tabakası (veya hayvanların ev kafesinde kullanılan yataklardan farklı olan diğer yataklar) ile doldurun.
   3. 70 Lux'taki ışığı, odanın durduğu masanın tavana bakan köşesine yerleştirilmiş 4 ampulle ayarlayın. Düşük oda aydınlatmasını korumak için tepe lambalarını kapatın.
   4. Tesiste kullanılan standart bir çorba peletini, odanın deneyciye bakan tarafına (duvardan ≈10 cm) yerleştirin.
3. Test etme
   1. Yiyecek yoksunluğundan sonraki sabah, hayvanları hafif ayarlara ve yeni ortama alışmalarını sağlamak için testten 30 dakika önce odaya getirin.
   2. Önceki gün ölçülen kiloya göre kilo vermelerini ölçmek için tüm hayvanları tartın. Hayvanlar görevi düzgün bir şekilde yerine getirebilmek için bir gecede% 8-12 kaybetmelidir.
   3. Hayvanları kilo kaybı başına sıralayın ve en az kilo veren fareye en çok kaybeden fareden başlayarak onları tarayın.
   4. Odanın yatak takımı ve tek bir peletle doldurulmasını sağlayın.
   5. Hayvanı mama peletinden uzak, odanın karşı tarafına yerleştirin.
   6. Zamanlayıcıyı hemen başlatın.
   7. Farenin odayı 12 dakikaya kadar keşfetmesine izin verin.
   8. Yiyecek peletinde yaklaşma ve beslenme gecikmesini ölçün (hayvan ısırmalı ve yemelidir).
      1. Hayvan peletin yakın geldiğinde, kokladığında ve ısırmadığında bir yaklaşım olduğunu düşünün.
      2. Bir ısırığı, hayvanın peletiği tüketmeye başladığı zaman olarak tanımlayın.
   9. Pelle'ye yaklaşma ve besleme gecikmesini saniyeler içinde kaydedin.
   10. Fare yiyecek peletinden beslendikten sonra, fareyi odadan çıkarın.
   11. Yatakları atın, ancak iştah sürücüsünü test etmek için kullanılacak peleti fare ev kafesinde sakla.
   12. Bir sonraki hayvan için odayı sıfırlayın ve bir sonraki hayvanla devam edin.
   13. Odadaki testin tamamlanmasından 15 dakika sonra, test sırasında kullanılan peleti farenin ev kafesinin içine, kafesin önündeki duvara bırakın.
   14. Pelet ev kafesindeyken peletle beslenmek için gecikmeyi ölçün. Bu iştah tahriki için bir ölçüdür.
       1. Farenin peletin kafesine bırakıldığını görmesini sağlamak için yuva malzemesinin çıkarılması tercih edilir.

12. Serum Toplama ve Kortikosteron Ölçümü

1. Hayvanları atanan tekniği kullanarak 1 dakika, kan toplamadan 15 dakika önce ele alın (bu, fareleri yeniden toplarken kavga riskini göz önünde bulundurarak grup evli veya tek kişilik hayvanlarla yapılabilir).
   1. Tünelle ilgilenen fareler için, onları tünele yönlendirin, tüneli kafesten 1 dakika kaldırın ve fareyi kafesinde değiştirin.
   2. Kuyruk saplı fareler için, farenin kuyruk tabanını tutun ve fareyi kafesinden çıkarın. Fareyi 1 dakika boyunca deneycilerin koluna aktarın ve kuyruk elleçleme ile fareyi kafesine geri döndürün.
   3. 3D saplı fareler için, fareyi kafesinden çıkarmak için bardaklı eller kullanın. Fareyi 1 dakika boyunca fincanlı ellerde tutun ve kafesine geri verin.
2. İşlemeden 15 dakika sonra, submandibuler damardan kan toplanmasına devam edin²².
3. Fareyi, farenin başı güvenli bir şekilde hareketsiz olacak şekilde sıkıca sür.
4. Delinme yerini bulun.
   1. Yüzün mandibulası boyunca, delinme bölgesini bulmak için bir dönüm noktası olarak kullanılabilecek küçük tüysüz bir gamze vardır. Çene tabanı ile bu gamze arasında bir çizgi çizen delinme bölgesi, bu gamzenin arkasında, çenenin menteşesinin hemen arkasında, yaklaşık 5 mm kulağa doğru uzanır.
5. Delinme bölgesine dik temiz bir 23 G iğne tutun ve hızlı bir sert gecikme hareketi kullanın. İğnenin ucu 1-2 mm arasında bir derinliğe nüfuz etmelidir, damar delinmez kan hemen akacaktır.
6. EDTA kaplı toplama tüplerinde ~150 μL kan toplayın ve buz üzerinde saklayın.
7. Kanın pıhtılaşmasını sağlamak için delinme bölgesine steril bir gazlı bezle hafif basınç uygulayın.
8. Kan pıhtılaştığında, fareyi ev kafesine geri koyun.
9. 10 dakika boyunca 4 °C 3.500 x g'da santrifüj kanı.
10. Üsttanan decant.
11. Aşağı akış analizleri için süpernatant 'ı -20 °C'de saklayın.
12. Üreticinin protokolünü takiben kortikosteron ELISA kiti kullanarak kortikosteron seviyelerini ölçün.
13. ELISA sonuçlarını okumak için bir spektrofotometre kullanın.

Sonuçlar

C57BL/6 fareler ile iki ayrı çalışma yapıldı. Çalışma #1 6 aylık erkekleri ve Çalışma #2 Jackson Laboratuvarları'ndan (Cat #000664) 2,5 aylık dişileri (N=36 /study) içeriyordu. Fareler tesise 2 aylıkken geldi. Study #2 dişiler varıştan iki hafta sonra ele alınıp test edilirken, Study #1 erkekler sadece 6 aylıkken (küresel pandemi kapanması nedeniyle gecikme) ele alındı ve test edildi. Bu süre zarfında, Study #2'dan bir fare, deneyleri işlemeye başlamadan önce öldü. Çalışma, erkek far...

Tartışmalar

Bu çalışma ve yöntem geliştirme, farelerde elleçleme tekniklerinin bilim topluluğu tarafından hala göz ardı edildiği ve bazı laboratuvarların deneylerden önce hayvanlarının stresini ve reaktivitesini azaltmak için alışkanlık veya kullanım tekniklerini uygulamakta hala isteksiz olduğu gözlemine dayanmaktadır. Bir zaman taahhüdünü temsil ederken, hayvan kullanımı hayvanlara yapılacak deneylerin başarısına katkıda bulunabilecek faydalı etkiler sağlar ve veri değişkenliği veya hayvan a?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
23 G x 1 in. BD PrecisionGlide general use sterile hypodermic needle. Regular wall type and regular bevel.	BD	2546-CABD305145	Needles for Blood collection
BD Vacutainer® Venous Blood Collection EDTA Tubes with Lavender BD Hemogard™ closure, 2.0ml (13x75mm), 100/pk	BD	367841	EDTA Coated tubes for blood collection
Bed’o cobs ¼” Corn cob laboratory animal bedding	Bed-O-Cobs	BEDO1/4	Novel bedding for novelty suppressed feeding
Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5424 R	For centrifugation of blood.
Corticosterone ELISA Kit	Arbor Assays	K003-H1W
Digital Camera	Panasonic	HC-V770	Camera to record EPM/Experimenter interactions
Elevated Plus Maze	Home Made	n/a	Custom Maze made of four black Plexiglas arms (two open arms (29cm long by 7 cm wide) and two enclosed arms (29 cm long x7 cm wide with 16 cm tall walls)) that form a cross shape with the two open arms opposite to each other held 55 cm above the floor
Ethanol	Medstore House Brand	39753-P016-EA95	Dilute to 70% with Distilled water, for cleaning
Ethovision XT 15	Noldus	n/a	Automated animal tracking software
Laboratory Rodent Diet	LabDiet	Rodent Diet 5001	Standard Rodent diet
Memory Card	Kingstone Technology	SDA3/64GB	For video recording and file transfer
Novelty Suppressed Feeding Chamber	Home Made	n/a	Custom test plexiglass test chamber with clear floors and walls 62cm long, by 31cm wide by 40cm tall .
Parlycarbonate tubes	Home Made	n/a	13 cm in length and 5cm in diameter
Purina Yesterday’s news recycled newspaper bedding	Purina	n/a	Standard Bedding
Spectrophotometer	Biotek	Epoch Microplate Reader