Методы управления для снижения стресса у мышей

Резюме

В этой статье описывается техника обработки у мышей, техника 3D-обработки, которая облегчает рутинную обработку за счет снижения тревожного поведения, и представлены подробности о двух существующих связанных методах (туннельная и хвостовая обработка).

Аннотация

Лабораторные животные подвергаются многочисленным манипуляциям со стороны ученых или поставщиков услуг по уходу за животными. Стресс, который это вызывает, может оказать глубокое влияние на благополучие животных, а также может быть смешанным фактором для экспериментальных переменных, таких как меры тревоги. На протяжении многих лет были разработаны методы обработки, которые минимизируют стресс, связанный с обращением, с особым акцентом на крысах и небольшим вниманием к мышам. Тем не менее, было показано, что мыши могут привыкнуть к манипуляциям с использованием методов обработки. Привыкание мышей к обращению снижает стресс, облегчает рутинное обращение, улучшает самочувствие животных, уменьшает изменчивость данных и повышает надежность экспериментов. Несмотря на благотворное влияние обработки, подход хвостового подъема, который является особенно стрессовым, по-прежнему широко используется. В этой статье представлено подробное описание и демонстрация недавно разработанной техники обработки мышей, предназначенной для минимизации стресса, испытываемого животным во время взаимодействия с человеком. Эта ручная техника выполняется в течение 3 дней (техника 3D-обработки) и фокусируется на способности животного привыкать к экспериментатору. Это исследование также показывает влияние ранее установленных методов обработки туннелей (с использованием поликарбонатного туннеля) и метода подъема хвоста. В частности, изучаются их влияние на тревожное поведение с использованием поведенческих тестов (Elevated-Plus Maze и Novelty Suppressed Feeding), добровольного взаимодействия с экспериментаторами и физиологических измерений (уровни кортикостерона). Техника 3D-обработки и техника обработки туннелей уменьшали фенотипы, подобные тревоге. В первом эксперименте с использованием 6-месячных самцов мышей техника 3D-обработки значительно улучшила взаимодействие экспериментаторов. Во втором эксперименте, используя 2,5-месячную самку, он снижал уровень кортикостерона. Таким образом, 3D-обработка является полезным подходом в сценариях, где взаимодействие с экспериментатором требуется или предпочтительно, или где обработка туннеля может быть невозможна во время эксперимента.

Введение

Мыши и крысы являются важными активами доклинических исследований^1,2 для различных целей, включая эндокринные, физиологические, фармакологические или поведенческие исследования^2. Из увеличения числа исследований с участием животных выяснилось, что неконтролируемые переменные окружающей среды, включая взаимодействие с человеком, влияют на различные результаты в биомедицинских исследованиях^3,4,5. Это отвечает за значительную изменчивость, наблюдаемую в экспериментах и исследовательских лабораториях^4,5,что представляет собой серьезную оговорку в исследованиях на животных.

Были реализованы различные подходы с целью ограничения воздействия экологических стрессоров и снижения реактивности к взаимодействию с человеком. Например, для ограничения воздействия экологических стрессоров в лабораториях внедрена стандартизация жилищных условий и автоматизированные жилищные системы^6,7. Что касается взаимодействия с людьми, то широко используемые подходы к обращению с животными и их транспортировке мало внимания относятся к дискомфорту и стрессу животных. Например, взятие животных за хвост или использование щипцов⁸ увеличивает базовую тревогу^9,10,11,уменьшает исследование^9,12 и в значительной степени способствует межибытовой изменчивости в исследованиях^13,14и между них. В результате были разработаны другие подходы, такие как техника обработки чашек, которая применима к мышам и крысам. При таком подходе животных «вытаскивают» из клетки, и экспериментаторы держат руками, образуя чашку^9,10,11. Другая полезная альтернатива обработке хвоста включает в себя использование поликарбонатного туннеля для переноса мышей^9,10,15. Такой подход исключает прямое взаимодействие между мышью и экспериментатором. Как чашечная, так и туннельная подходы показали эффективность в снижении тревожного поведения и страха перед экспериментатором, которые могут быть преувеличены отвратительными методами обработки, такими как подъем хвоста / обработка хвоста^9,10.

Таким образом, растущее количество доказательств демонстрирует полезность правильного обращения с мышами для снижения изменчивости между особями^9,11и улучшения благосостояния животных^10. Однако методы, упомянутые выше, по-прежнему сталкиваются с ограничениями. Техника обработки чашек была реализована с графиками от 10 дней (10 сеансов в течение 2 недель¹⁶⁾до 15 недель^17,что является значительным количеством времени для персонала объекта и экспериментаторов. Кроме того, эффективность работы с чашками варьируется в зависимости от штамма^9, а обычное обращение с чашками в открытых руках может привести к тому, что наивные мыши или особенно прыгучие штаммы прыгают с руки^9,18. Обработка туннелей приводит к более последовательным и, как правило, более быстрым результатам в¹⁹. Туннели также используются в качестве обогащения домашних клеток. Они помогают животным быстро привыкнуть к обращению и обеспечивают дополнительные преимущества обогащения. Однако обработка туннелей имеет ограничения при перевозке животных между аппаратами. Интересно, что Hurst and West⁹и Henderson et al.²⁰ продемонстрировали, что использование мягкого и краткого ручного обращения для переноса животных из туннеля в аппарат не влияет на их фенотип.

Чтобы обеспечить альтернативу существующим методам с достижимым привыканием за короткий период времени, в этой статье описывается новая техника, которая расширяет технику обработки чашек, поэтому не требует какого-либо конкретного оборудования. Этот подход использует вехи для оценки уровня комфорта мышей в процессе обработки. Он показывает эффективность в снижении реактивности и стресса мышей (на поведенческом и гормональном уровнях), облегчает рутинное обращение и способствует снижению изменчивости между животными. Подробности этого метода приведены здесь, а его эффективность в снижении тревожного поведения, улучшении взаимодействия с экспериментаторами и ограничении высвобождения периферического гормона стресса (кортикостерона) продемонстрирована в двух отдельных исследованиях (самцы и самки мышей) по сравнению с туннельной обработкой (положительный контроль) и методами обращения с хвостом (отрицательный контроль).

протокол

Процедуры с участием животных были одобрены комитетом по уходу за животными CAMH и проведены в соответствии с руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными.

ПРИМЕЧАНИЕ: Способ обработки, описанный в настоящем описании, может быть использован для различных штаммов мышей, включая неперегенные (C57/BL6, BalbC, CD1, SV129 и т.д.) и трансгенные линии. Его также можно использовать с молодыми или старыми мышами, отмечая, что молодые взрослые (4-6 недель) мыши, как правило, немного более активны, чем взрослые или старые мыши, особенно на 1-й день.

1. Экспериментальная подготовка

1. Перед началом исследования, в соответствии с руководящими принципами ARRIVE^21,случайным образом распределите мышей в каждую группу обработки (3D-Handling, Tunnel Handling или Tail Handling).
2. Определите помещение для выполнения обработки. Она может быть выполнена как в жилом помещении, так и в отдельном помещении. Если обработка осуществляется в отдельном помещении, что требует перемещения животных на движущейся тележке, позвольте животным прижиться в новом помещении за 20-30 минут до начала протокола обработки.
3. Для групповых животных используйте временную клетку для размещения мышей после обработки, прежде чем перегруппировать их всех в их первоначальную домашнюю клетку. Это уменьшает потенциальные драки между животными перед обращением (особенно у самцов).
4. Работайте на прилавке (предпочтительно очищенной столешнице) или в шкафу биобезопасности, при этом клетка для корпуса находится вдали от обрабатываемого животного. Непосредственное приближение к клетке корпуса увеличивает риск прыжков. Если животные размещаются в группе, прыжок мыши, которую обрабатывают в домашнюю клетку, может вызвать стресс у товарищей по клетке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Работа в шкафу биобезопасности ограничивает риск прыжков мышей на пол и может потребоваться в некоторых помещениях. Этот метод можно использовать в шкафу биобезопасности, следя за тем, чтобы всегда выполнять все шаги внутри шкафа биобезопасности, и избегая мышей, идущих по предплечьям дрессировщика.

2. ДЕНЬ 1: 5 минут на мышь

1. Осторожно откройте клетку и поместите крышку сбоку, удалите гнездовые материалы и другие обогащения, такие как ходовые колеса или укрытия.
2. Введите открытую руку в перчатке в домашнюю клетку, медленно поместив руку вдоль одной стороны стенки клетки (стена, ближайшая к дрессировщику, рисунок 1А).
   1. Не стоит сразу пытаться поднять мышь.
3. Оставайтесь неподвижными и позвольте животному привыкнуть к присутствию руки в клетке около 30 с.
4. Попытайтесь поднять мышь на ладони (т.е. избегайте подхватывать животное за хвост).
   1. Если мышь нелегко поднять после 3 попыток, направляйте мышь в угол и чашку обеими руками.
   2. Осторожно переместите руки в сторону мыши, чтобы попытаться поднять ее.
   3. Если это не удается после максимум 3 попыток обеими руками, осторожно поднимите мышь за основание ее хвоста и перенесите ее на предплечье или плоскую руку.
5. С мышью в руке держите руку как можно более плоской и открытой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечивает плоскую платформу для мыши, на которую можно наступить, и ограничивает риск укусов.
6. Держа руку открытой и плоской ладонью вверх, поместите другую руку рядом с рукой, держащей мышь, и позвольте мыши свободно перемещаться из руки в руку без каких-либо ограничений(рисунок 1B).
7. Дайте мыши исследовать и перемещаться между руками в течение 1 минуты.
   1. В этот момент мыши могут попытаться отпрыгнуть. Расположите руки так, чтобы если мышь прыгнет, она приземлился на столешницу, а не на пол.
   2. Если мышь выглядит так, как будто она готовится к прыжку (двигаясь к краю руки и вставая на задние лапы), медленно поместите другую руку перед ней и попытайтесь направить ее на ходьбу по этой руке. Избегайте резких движений, так как это увеличивает риск прыжков.
   3. Если мышь прыгает, попытайтесь поднять ее, избегая обработки хвоста, и возобновите сеанс обработки. Если мышь остается на полу или вне рук более 10 с, добавьте дополнительное время к сеансу обработки, чтобы компенсировать любое время, когда мышь была вне рук.
   4. Заметь прыжок. Общее количество прыжков может быть использовано для оценки потенциальной изменчивости между животными.
8. После 1 мин обработки плоскими руками расслабьте ладонь и слегка потягивая мышь в руке, прежде чем осторожно перекатывать мышь между руками(рисунок 1С).
   1. Чтобы «катиться», расположите мышь на ладони, на плоской руке, перпендикулярно пальцам.
   2. Медленно закройте руку, положив пальцы на заднюю часть мыши.
   3. Поместите свободную руку прямо под руку, держащую мышь.
   4. Медленно поворачивайте/поворачивайте руку мышью, чтобы осторожно перенести мышь в другую руку (флип на 180°).
   5. Повторяйте это взад и вперед между руками.
9. Чередуйте мягкое катание между руками и свободное исследование на открытых руках в течение 60 с, чередуя техники примерно каждые 20 с.
10. Выполните «тест на укрытие»(рисунок 1D).
    1. Позвольте мыши переместиться к краю руки, затем сведите 2 руки вместе.
    2. Очень медленно, чашка их так, чтобы мышь помещалась внутри «укрытия», образованного руками. Оставьте отверстие, чтобы мышь могла сбежать при необходимости.
    3. Старайтесь держать мышь в укрытии в течение 5-10 с, без каких-либо ограничений.
    4. Чередуйте тест укрытия, перекатывайтесь между руками и свободно исследуйте открытые руки еще 60 с, обязательно выполняя шаг укрытия 3 и более раз.
11. Во всех процедурах, описанных в 2.10, не торопить процесс. Если мышь кажется напряженной (т.е. осторожно убегает, прыгает с рук, избегая контакта с руками и т.д.), будучи запертой внутри рук, продолжайте кататься между руками и свободное исследование в течение 20 с, а затем повторите попытку.
12. Веха: Выполните по крайней мере 1 успешное испытание приюта в течение 10 секунд для завершения Дня 1.
    1. Считайте тест на укрытие успешным, когда мышь остается в руках. Если мышь высунет голову и вернется в укрытие, это все равно успешное испытание. Если животное полностью выходит из приюта, это провал.
13. Позвольте свободное исследование в руках в течение 30 с.
14. Осторожно замените мышь в клетке. Если группа размещена, поместите мышь во временную клетку до тех пор, пока все партнеры по клетке не будут обработаны. Верните мышей в их первоначальную клетку, подняв их на ладони. Не используйте хвостовой подхват.
15. Очистите столешница от потенциальных кала и мочи 70% этанолом.
16. Тщательно промойте перчатки 70% этанолом (или соответствующим чистящим раствором) или смените перчатки перед обращением со следующей мышью (можно сохранить те же перчатки для товарищей по клетке).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется выполнять обработку с разумным количеством животных, чтобы избежать усталости от дрессировщика. Обработка 24 мышей занимает около 2 ч, и рекомендуется не превышать 24 мышей на одного обработчика. Если необходимо обрабатывать больше животных, рекомендуется либо иметь несколько обработчиков, либо разделить процедуры обработки на подгруппы в течение нескольких дней.

3. ДЕНЬ 2: от 3 до 5 минут на мышь

1. Попытайтесь поднять мышь на ладони. На этом этапе это должно быть уже осуществимо и мыши не должны выпрыгивать из рук.
2. Начните с открытой ладони, как на 1-й день, что позволит мыши свободно исследовать в течение 20 с.
3. Затем перевертите мышь между руками несколько раз (4-5 раз).
4. Выполните «тест на укрытие» в течение 5 с.
5. Повторите тест на укрытие несколько раз (~5-6) в течение 2-3 минут.
6. В течение тех же 2-3 минут периода чередуйте с броском между руками и свободным исследованием открытых рук шаг с 1-го дня, чтобы улучшить привыкание.
   1. Нажмите мышь на голову испину (рисунок 1E),5-6 раз. Признак привыкания — это когда мышь позволяет вам прикоснуться к ней, не пытаясь убежать.
   2. Выполните «Тычок в нос»: попробуйте коснуться морды мыши, от 2 до 3 раз(рисунок 1F).
      1. Если мышь пытается укусить или проявляет явные признаки стресса при прикосновении, не пытайтесь сразу же тыкать носом снова. Вместо этого чередуйте с плоской рукой исследования и броска. «Привыкание» отражается тем, что животное не убегает и не поворачивает голову в случаях контакта с человеком.
7. Во всех процедурах, описанных в 3.4-3.6, не торопить процесс. Если мышь испытывает стресс, будучи запертой внутри рук или не хочет, чтобы ее трогали, продолжайте кататься между руками в течение 20-30 с, а затем повторите попытку.
8. Основные этапы: Выполните не менее 1 успешного тычка носом в течение 2-3 с для завершения 2-го дня.
9. Прекратите этот сеанс примерно через 3 минуты обработки, если животное хорошо реагирует на «укрытие», «поглаживание головой», «тыканье носом», и если мышь, по-видимому, готова исследовать руки без признаков стресса.
10. Если мышь продолжает проявлять признаки стресса или не реагирует хорошо на тест «укрытие» или «тыканье носом», продолжайте сеанс до достижения 5 минут, как в день 1.
11. Замените мышь в клетке, почистите столешницы и перчатки, как в 1-й день.

4. ДЕНЬ 3: Около 3 минут на мышь

1. На третий день выполните те же действия, что и во 2-й день, в течение 2-3 минут.
   1. Подберите мышь на ладони.
   2. Перемещейте и перекатывайте мышь между руками
   3. Выполните тест на укрытие.
   4. Попробуйте погладить мышь по спине и голове.
2. Чередуйте эти шаги примерно в течение 1-2 минут.
3. Продолжайте процедуру до тех пор, пока мышь не расслабится настолько, чтобы сидеть на ладони, не пытаясь убежать.
4. До конца 3-го дня повторите тест на укрытие и тест на тыканье носом в качестве теста на привыкание.
   1. Если оба теста могут быть завершены с первой попытки, процесс привыкания завершен. Продолжайте осторожно обращаться с мышью в течение 30 с в минуту.
   2. Если мышь изначально устойчива к любому из тестов, повторите шаги 4.1-4.3 в течение 20-30 с, прежде чем повторно присмачивать тест на тычок носом и укрытие.
   3. Если мышь остается устойчивой к этим тестам через 3 мин, третий день может быть повторен.
5. Основные этапы: Выполните не менее 2 успешных тестов укрытия по 10 секунд каждый и 2 успешных теста на тычко носом для завершения дня 3 и завершения всей процедуры 3D-обработки.
6. Верните мышь в клетку, почистите столешницы и перчатки.

5. Факультативный подход к животным, подвергаемым ограничению для инъекций или оважа

ПРИМЕЧАНИЕ: На 3-й день, если животное будет удерживаться в экспериментальных целях (пероральная оваж, внутриперитонеальная инъекция и т. Д.), Мыши могут быть подвергнуты тесту на защемление шеи.

1. Захватите затылок между большим и указательным пальцами(рисунок 1G).
2. Поднимите мышь на 3-5 см выше руки на 2-3 с.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно это неестественное положение для взрослых мышей, и если мыши остаются почти неподвижными, они хорошо привыкли к обращению и их будет легко сдерживать в экспериментальных целях.
3. Поместите мышь обратно в плоскую руку или, если мышь реагирует на защемление шеи, подумайте о том, чтобы поместить ее на рукав экспериментатора, крышку клетки или столешницу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы работаете в шкафу биобезопасности, не кладите мышь на рукав, иначе она может подойти и выйти из шкафа биобезопасности. Предпочитайте размещать мышь на столешнице внутри шкафа биобезопасности.
4. Оставьте мышь свободно исследовать руку экспериментатора в течение 1 минуты.

6. Необязательный подход для дополнительных дней обработки

1. В случае сильной стрессовой линии мыши добавьте дополнительные дни, чтобы снизить реактивность и уровень стресса животных, используя методы, описанные в Дне 2/3.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Многие факторы могут влиять на базовый стресс животных, включая штамм, наличие трансгенной модификации, возраст, пол и жилищные условия. Если эти факторы не согласуются между группами, такими как пожилые животные, тестируемые против молодых контрольных групп, или трансгенные животные, тестируемые против контроля дикого типа, рекомендуется использовать одинаковое количество дней привыкания для каждой группы.

7. Обработка туннелей

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод применим только к мышим с туннельной обработкой. Туннели представляют собой поликарбонатные трубы длиной около 13 см и диаметром 5 см.

1. Поместите туннель в клетку мыши.
2. Оставьте туннель в клетке за 7 дней до обработки.
3. Откройте клетку и поместите крышку сбоку.
4. Осторожно направьте мышь в поликарбонатный туннель (уже в клетку).
5. Поднимите туннель из клетки, горизонтально. При необходимости свободно накройте концы туннеля, чтобы животное не прыгало/не выпадало из туннеля, потенциально падая обратно в клетку или на пол.
6. Отодвините животное в туннеле подальше от домашней клетки и держите его подальше от любых поверхностей в течение 30 с.
7. Поместите туннель обратно в домашнюю клетку, позволив мыши выйти из трубы.
8. Подождите 60 с, а затем повторите шаги 7.4-7.7 один раз.
9. Тщательно промойте перчатки 70% этанолом или смените перчатки перед привыканием следующей мыши.
10. Повторяйте эту процедуру в течение 10 дней подряд.

8. Обработка хвоста

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод применим только к мышам с хвостовой ручкой. Он используется для переноса мышей из их клетки в аппарат, и наоборот.

1. Откройте клетку и поместите крышку сбоку.
2. Обхватите мышей за основание хвоста между большим и указательным пальцами.
3. Поднимите мышь из клетки.
4. Через 2-3 с перенесите мышь на противоположное предплечье экспериментатора, сохраняя при этом хватку за хвост, чтобы избежать свисания мыши.
5. Когда при осуществлении этого эксперимента требуется обработка хвоста (например, перед забором крови для тестирования кортизола), животных переносят на предплечье экспериментатора путем обработки хвоста и удерживают в течение 15 с, прежде чем вернуть в клетку.

9. Надземный плюс Лабиринт

1. Обстановка в номере
   1. Поместите лабиринт посреди комнаты, под цифровую камеру, оснащенную картой памяти.
   2. Установите свет комнаты на ~60 люкс с помощью 2 стоячих ламп, размещенных за лабиринтом.
   3. Выключите любое верхнее освещение, чтобы избежать прямого света на лабиринте, который создает отражение и нарушает обнаружение животных в лабиринте.
   4. Как только все оборудование будет настроено, перенесите животных в комнату и дайте им акклиматизироваться к световым настройкам и новой среде в течение 30 минут.
2. Тестирование
   1. Очистите лабиринт 70% этанолом, чтобы предотвратить запахи пыли или животного, которое было протестировано ранее.
   2. Запустите камеру.
   3. Используйте лист бумаги с удостоверением личности животного, чтобы записать удостоверение личности на видео, прежде чем поместить животное в лабиринт (это облегчит правильную идентификацию того, какая мышь снимается на каждом видео).
   4. Используйте соответствующую технику обращения с каждым животным, чтобы перенести его в лабиринт.
   5. Поместите мышь на центральную платформу, покрывая открытой рукой.
   6. Позвольте мыши исследовать аппарат в течение 10 минут, не беспокоя.
   7. Через 10 минут остановите камеру.
   8. Достанем мышь из лабиринта и положи ее обратно в клетку.
   9. Очистите кал и мочу из лабиринта 70% этанолом.
   10. После завершения тестирования со всеми мышами перенесите видео с карты памяти на компьютер для отслеживания видео.
   11. Используя автоматизированное программное обеспечение для отслеживания животных, отслеживайте количество входов в открытые и закрытые руки, а также время, проведенное в открытых или закрытых объятиях (здесь Ethovision XT 14).

10. Взаимодействие экспериментаторов (производное от Херста и Уэста⁹⁾

1. Обстановка в номере
   1. Поместите стол посреди испытательной комнаты под цифровую камеру, оснащенную картой памяти.
   2. Установите свет на 50-70 люкс с 4 лампочками, размещенными в углу комнаты, обращенном к потолку. Выключите верхнее освещение, чтобы избежать прямого света на лабиринте, который создает отражение и нарушает обнаружение животных на арене.
   3. Принесите животных в комнату.
   4. Дайте им акклиматизироваться в комнате в течение 30 минут.
2. Эксперимент
   1. Поместите домашнюю клетку под цифровую камеру.
   2. Снимите крышку.
   3. Удалите гнездовой материал и другие обогащения, которые могут помешать отслеживанию животных.
   4. Запустите камеру.
   5. Используйте карточку клетки с идентификатором животного, чтобы идентифицировать животное на видео.
   6. Поместите руку в домашнюю клетку вдоль стенки клетки спереди с правой стороны.
      1. Убедитесь, что голова обработчика не блокирует камеру для съемки мыши.
   7. Запустите таймер.
   8. Держите руку неподвижной в течение 2 минут, и пусть мышь исследует руку.
   9. Выньми руку из клетки на 15 с.
   10. Попытайтесь поднять мышь с помощью рук с кубиками и запишите, убегает ли мышь.
   11. Повторяйте последний шаг до пяти раз, каждые 5 секунд или до тех пор, пока мышь не позволит себя поднять.
   12. Запишите количество попыток, необходимых для поднятия мыши.
   13. Возврат гнездового материала и обогащения в клетку.
   14. Очистите перчатки с 70% этанолом или смените перчатки, прежде чем перейти к следующему животному.
   15. После тестирования перенесите видео с карты памяти на компьютер.
   16. Используя автоматизированное программное обеспечение для отслеживания видео, разделите клетку на четыре равных квадранта и запишите время, проведенное мышью в каждом квадранте (здесь Ethovision XT 14).

11. Подавленное кормление новизной

1. Лишение пищи
   1. За 3 дня до теста выполните полную смену клетки и один раз разместите животных (одиночное жилье предпочтительнее для проведения тестирования домашней клетки).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предоставление свежего постельного белья удаляет потенциальную пыль или маленькие кусочки пищи, накапливающиеся в подстилке с момента последней смены клетки.
   2. За день до тестирования взвесьте всех животных около 6 часов вечера.
   3. Извлеките всю пищу из бункера для еды и убедитесь, что в клетке или в подстилке нет кусочков пищи.
2. Обстановка в номере
   1. Поместите камеру NSF на стол.
   2. Заполните камеру тонким слоем кукурузной подстилки (или другой подстилки, которая отличается от подстилки, используемой в домашней клетке животных).
   3. Установите свет на 70 люкс с 4 лампочками, размещенными в углу стола, где стоит камера, лицом к потолку. Выключите верхнее освещение, чтобы поддерживать низкое освещение комнаты.
   4. Поместите одну гранулу стандартного чау, используемого в объекте, на сторону камеры, обращенную к экспериментатору (≈10 см от стены).
3. Тестирование
   1. Утром после лишения пищи принесите животных в комнату за 30 минут до тестирования, чтобы они акклиматизировались к условиям освещения и новой среде.
   2. Взвесьте всех животных, чтобы измерить их потерю веса на основе веса, измеренного в предыдущий день. Животные должны потерять 8-12% в одночасье, чтобы иметь возможность выполнить задачу должным образом.
   3. Сортируйте животных по потере веса и экранируйте их, начиная с мыши, которая потеряла больше всего, до мыши, которая потеряла меньше всего веса.
   4. Убедитесь, что камера заполнена постельным бельем и одной гранулой.
   5. Поместите животное на противоположную сторону камеры, подальше от пищевой гранулы.
   6. Немедленно запустите таймер.
   7. Дайте мыши исследовать камеру в течение 12 минут.
   8. Измерьте латентность, чтобы приблизиться и покормить (животное должно укусить и съесть) на грануле пищи.
      1. Рассмотрим это как подход, когда животное подходит близко к пеллете, нюхает ее и не кусается.
      2. Определите укус, когда животное начинает потреблять гранулу.
   9. Запишите задержку, чтобы приблизиться и питать гранулу за считанные секунды.
   10. После того, как мышь напиталась пищевой гранулой, выньте мышь из камеры.
   11. Выбросьте постельное белье, но сохраните гранулы, которые будут использоваться для тестирования аппетита в домашней клетке мыши.
   12. Сбросьте камеру для следующего животного и приступайте к следующему животному.
   13. Через 15 мин после завершения испытания в камере бросьте гранулу, используемую во время теста, внутрь домашней клетки мыши, к стенке в передней части клетки.
   14. Измерьте задержку для питания гранулы, когда гранула находится в домашней клетке. Это мера для аппетита.
       1. Предпочтительно удалить гнездовой материал, чтобы мышь увидела, что гранула сбрасываются в ее клетку.

12. Сбор сыворотки и измерение кортикостерона

1. Обрабатывайте животных в течение 1 мин с использованием назначенной методики, за 15 мин до забора крови (это можно сделать с групповыми или одиночными животными, имея в виду риск драк при перегруппировке мышей).
   1. Для мышей с туннельной обработкой направьте их в туннель, поднимите туннель из клетки на 1 мин и замените мышь в своей клетке.
   2. Для мышей с хвостовым хватом возьмите хвостовое основание мыши и извлеките мышь из своей клетки. Перенесите мышь в рукав экспериментаторов на 1 мин, а мышь вернуть в клетку с помощью хвостовой обработки.
   3. Для мышей с 3D-ручкой используйте руки с кубиком, чтобы удалить мышь из клетки. Подержите мышь в руках в течение 1 минуты и верните ее в клетку.
2. Через 15 мин после обработки приступайте к забору крови из подчелюстной^{веной 22.}
3. Крепко похитим мышь так, чтобы голова мыши была надежно обездвижена.
4. Найдите место прокола.
   1. Вдоль мандиблы лица есть небольшая голая ямочка, которую можно использовать в качестве ориентира для определения места прокола. Проводя линию между основанием челюсти и этой ямочкой, место прокола лежит за этой ямочкой к уху примерно на 5 мм, сразу за шарниром челюсти.
5. Держите чистую иглу 23 G перпендикулярно месту прокола и используйте быстрое твердое движение. Кончик иглы должен проникать на глубину от 1-2 мм, кровь будет течь сразу, как только вена будет проколота.
6. Соберите ~ 150 мкл крови в покрытых ЭДТА сборных пробирках и храните на льду.
7. Нанесите небольшое давление стерильной марлевой прокладкой на место прокола в течение 5 с или более, чтобы кровь сгустится.
8. Как только кровь свернется, верните мышь в ее домашнюю клетку.
9. Центрифуга крови при 4 °C 3,500 х г в течение 10 мин.
10. Декант супернатанта.
11. Храните супернатант при -20 °C для последующего анализа.
12. Измерьте уровень кортикостерона с помощью набора кортикостерона ELISA в соответствии с протоколом производителя.
13. Используйте спектрофотометр для считывания результатов ИФА.

Результаты

Два отдельных исследования были проведены на мышах C57BL/6. Исследование #1 включало 6-месячных мужчин, а #2 исследования включали 2,5-месячных женщин (N = 36 / исследование) из Лабораторий Джексона (Cat #000664). Мыши прибыли в учреждение в возрасте 2 месяцев. В то время как исследование #2 женщины были о...

Обсуждение

Это исследование и разработка метода основаны на наблюдении, что методы обработки на мышах все еще упускаются из виду научным сообществом, и что некоторые лаборатории по-прежнему неохотно внедряют методы привыкания или обработки для снижения стресса и реактивности своих животных до э...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
23 G x 1 in. BD PrecisionGlide general use sterile hypodermic needle. Regular wall type and regular bevel.	BD	2546-CABD305145	Needles for Blood collection
BD Vacutainer® Venous Blood Collection EDTA Tubes with Lavender BD Hemogard™ closure, 2.0ml (13x75mm), 100/pk	BD	367841	EDTA Coated tubes for blood collection
Bed’o cobs ¼” Corn cob laboratory animal bedding	Bed-O-Cobs	BEDO1/4	Novel bedding for novelty suppressed feeding
Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5424 R	For centrifugation of blood.
Corticosterone ELISA Kit	Arbor Assays	K003-H1W
Digital Camera	Panasonic	HC-V770	Camera to record EPM/Experimenter interactions
Elevated Plus Maze	Home Made	n/a	Custom Maze made of four black Plexiglas arms (two open arms (29cm long by 7 cm wide) and two enclosed arms (29 cm long x7 cm wide with 16 cm tall walls)) that form a cross shape with the two open arms opposite to each other held 55 cm above the floor
Ethanol	Medstore House Brand	39753-P016-EA95	Dilute to 70% with Distilled water, for cleaning
Ethovision XT 15	Noldus	n/a	Automated animal tracking software
Laboratory Rodent Diet	LabDiet	Rodent Diet 5001	Standard Rodent diet
Memory Card	Kingstone Technology	SDA3/64GB	For video recording and file transfer
Novelty Suppressed Feeding Chamber	Home Made	n/a	Custom test plexiglass test chamber with clear floors and walls 62cm long, by 31cm wide by 40cm tall .
Parlycarbonate tubes	Home Made	n/a	13 cm in length and 5cm in diameter
Purina Yesterday’s news recycled newspaper bedding	Purina	n/a	Standard Bedding
Spectrophotometer	Biotek	Epoch Microplate Reader