Techniques de manipulation pour réduire le stress chez la souris

Résumé

Cet article décrit une technique de manipulation chez la souris, la technique de manipulation 3D, qui facilite la manipulation de routine en réduisant les comportements anxieux et présente des détails sur deux techniques connexes existantes (manipulation en tunnel et en queue).

Résumé

Les animaux de laboratoire sont soumis à de multiples manipulations par des scientifiques ou des fournisseurs de soins aux animaux. Le stress que cela provoque peut avoir des effets profonds sur le bien-être des animaux et peut également être un facteur de confusion pour des variables expérimentales telles que les mesures de l’anxiété. Au fil des ans, des techniques de manipulation qui minimisent le stress lié à la manipulation ont été développées en mettant l’accent sur les rats et en prêtant peu d’attention aux souris. Cependant, il a été démontré que les souris peuvent être habituées à des manipulations à l’aide de techniques de manipulation. Habituer les souris à la manipulation réduit le stress, facilite la manipulation de routine, améliore le bien-être des animaux, diminue la variabilité des données et améliore la fiabilité expérimentale. Malgré les effets bénéfiques de la manipulation, l’approche tail-pick-up, particulièrement stressante, est encore largement utilisée. Cet article fournit une description détaillée et une démonstration d’une nouvelle technique de manipulation de la souris destinée à minimiser le stress subi par l’animal lors de l’interaction humaine. Cette technique manuelle est réalisée sur 3 jours (technique de manipulation 3D) et se concentre sur la capacité de l’animal à s’habituer à l’expérimentateur. Cette étude montre également l’effet des techniques de manutention des tunnels précédemment établies (à l’aide d’un tunnel en polycarbonate) et de la technique de ramassage de la queue. Leurs effets sur les comportements anxieux sont spécifiquement étudiés, en utilisant des tests comportementaux (Elevated-Plus Maze et Novelty Suppressed Feeding), l’interaction volontaire avec les expérimentateurs et la mesure physiologique (niveaux de corticostérone). La technique de manipulation 3D et la technique de manipulation en tunnel ont réduit les phénotypes anxieux. Dans la première expérience, utilisant des souris mâles âgées de 6 mois, la technique de manipulation 3D a considérablement amélioré l’interaction avec l’expérimentateur. Dans la deuxième expérience, en utilisant une femme de 2,5 mois, il a réduit les niveaux de corticostérone. En tant que tel, la manipulation 3D est une approche utile dans les scénarios où l’interaction avec l’expérimentateur est requise ou préférée, ou où la manipulation de tunnel peut ne pas être possible pendant l’expérience.

Introduction

Les souris et les rats sont des atouts essentiels aux études précliniques^1,2 à des fins multiples, y compris les études endocriminales, physiologiques, pharmacologiques ou comportementales^2. Du nombre croissant d’études impliquant des animaux, il est apparu que des variables environnementales incontrôlées, y compris l’interaction humaine, influencent divers résultats dans la recherche biomédicale^3,4,5. Ceci est responsable de la variabilité significative observée entre les expériences et les laboratoires de recherche^4,5, ce qui pose une mise en garde majeure dans la recherche animale.

Diverses approches ont été mises en œuvre dans le but de limiter l’impact des facteurs de stress environnementaux et de réduire la réactivité à l’interaction humaine. Par exemple, pour limiter l’impact des facteurs de stress environnementaux, la normalisation des conditions de logement et les systèmes de logement automatisés^6,7 ont été mis en œuvre dans tous les laboratoires. En ce qui concerne l’interaction avec les êtres humains, les approches couramment utilisées pour la manipulation et le transport des animaux ne tiennent guère compte de l’inconfort et du stress des animaux. Par exemple, ramasser les animaux par la queue ou utiliser des forceps⁸ augmente l’anxiété de base^9,10,11, réduit l’exploration^9,12 et contribue grandement à la variabilité interindi individuelle au sein et entre les études^13,14. En conséquence, d’autres approches ont été développées, telles que la technique de manipulation des tasses, qui est applicable aux souris et aux rats. Dans cette approche, les animaux sont « sortis » de leur cage et tenus par les expérimentateurs avec leurs mains formant une tasse^9,10,11. Une autre alternative utile à la manipulation de la queue implique l’utilisation d’un tunnel en polycarbonate pour transférer les souris^9,10,15. Cette approche élimine l’interaction directe entre la souris et l’expérimentateur. Les approches en coupe et en tunnel ont montré une efficacité dans la réduction des comportements anxieux et de la peur de l’expérimentateur qui peuvent être exagérées par des techniques de manipulation aversives, telles que la manipulation de la queue^9,10.

Par conséquent, de plus en plus de preuves démontrent l’utilité d’une manipulation appropriée des souris pour réduire la variabilité entre les individus^9,11et améliorer le bien-être des animaux¹⁰. Cependant, les techniques mentionnées ci-dessus sont encore confrontées à des limites. La technique de manipulation des gobelets a été mise en œuvre avec des horaires allant de 10 jours (10 séances sur 2 semaines¹⁶⁾à 15 semaines^17,ce qui représente une quantité considérable de temps pour le personnel de l’installation et les expérimentateurs. De plus, l’efficacité de la manipulation de la tasse varie selon la souche⁹ et la manipulation conventionnelle de la tasse dans les mains ouvertes peut conduire à des souris naïves ou à des souches particulièrement sautillantes de la main^9,18. La manutention des tunnels se traduit par des résultats plus cohérents et généralement plus rapides dans l’effleage¹⁹. Les tunnels sont également utilisés comme enrichissement de la cage domestique. Ils aident les animaux à s’habituer à la manipulation rapide et offrent les avantages supplémentaires de l’enrichissement. La manipulation en tunnel, cependant, a des limites lors du transfert d’animaux entre appareils. Fait intéressant, Hurst et West⁹, et Henderson et al.²⁰ ont démontré que l’utilisation d’une manipulation manuelle douce et brève pour transférer les animaux du tunnel à l’appareil n’affecte pas leur phénotype.

Pour fournir une alternative aux méthodes existantes, avec une accoutumance réalisable dans un court laps de temps, cet article décrit une nouvelle technique qui développe la technique de manipulation de la tasse, ne nécessitant donc aucun équipement particulier. Cette approche utilise des jalons pour évaluer le niveau de confort des souris avec le processus de manipulation. Il montre son efficacité pour diminuer la réactivité et le stress des souris (aux niveaux comportemental et hormonal), facilite la manipulation de routine et contribue à réduire la variabilité entre les animaux. Les détails de cette technique sont fournis ici, et son efficacité pour réduire les comportements anxieux, améliorer l’interaction avec les expérimentateurs et limiter la libération d’hormones de stress périphériques (corticostérone) est démontrée dans deux études distinctes (souris mâles et femelles), en comparaison avec la manipulation en tunnel (contrôle positif) et les techniques de manipulation de la queue (contrôle négatif).

Protocole

Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le comité des soins aux animaux de CAMH et menées conformément aux lignes directrices du Conseil canadien sur les soins aux animaux.

REMARQUE: La méthode de manipulation décrite ici peut être utilisée dans diverses souches de souris, y compris les lignées non transgéniques (C57/BL6, BalbC, CD1, SV129, etc.) et transgéniques. Il peut également être utilisé avec des souris jeunes ou âgées, notant que les jeunes adultes (4-6 semaines) ont tendance à être légèrement plus actives que les souris adultes ou âgées, en particulier le jour 1.

1. Préparation expérimentale

1. Avant le lancement de l’étude, conformément aux lignes directrices²¹de l’ARRIVE, assignez au hasard des souris à chaque groupe de manutention (manutention 3D, manipulation en tunnel ou manipulation de la queue).
2. Identifiez la pièce pour effectuer la manipulation. Il peut être effectué dans la salle de logement ou dans une pièce séparée. Si la manipulation est effectuée dans une pièce séparée, ce qui nécessite que les animaux soient déplacés sur un chariot en mouvement, laissez les animaux s’habituer à la nouvelle pièce pendant 20 à 30 minutes avant le début du protocole de manipulation.
3. Pour les animaux logés en groupe, utilisez une cage temporaire pour loger les souris après la manipulation, avant de les regrouper toutes dans leur cage d’origine. Cela réduit les combats potentiels entre les animaux avant la manipulation (en particulier chez les mâles).
4. Travaillez sur un comptoir (de préférence un comptoir dégagé) ou dans une armoire de biosécurité, avec la cage de logement loin de l’animal manipulé. La proximité de la cage de logement augmente le risque de sauter. Si les animaux sont logés en groupe, sauter de la souris manipulée dans la cage de la maison peut causer du stress aux compagnons de cage.
   REMARQUE: Travailler dans une armoire de biosécurité limite le risque que des souris sautent sur le sol et peut être nécessaire dans certaines installations. Cette technique peut être utilisée dans une armoire de biosécurité, en s’assurant de toujours effectuer toutes les étapes à l’intérieur de l’armoire de biosécurité et en évitant que les souris marchent sur les avant-bras du manipulateur.

2. JOUR 1 : 5 min par souris

1. Ouvrez doucement la cage et placez le couvercle sur le côté, retirez les matériaux de nidification et d’autres enrichissements tels que les roues de roulement ou les abris.
2. Introduisez une main ouverte gantée dans la cage de la maison, en plaçant lentement la main le long d’un côté du mur de la cage (le mur le plus proche du manipulateur, Figure 1A).
   1. N’essayez pas immédiatement de prendre la souris.
3. Restez immobile et laissez l’animal s’habituer à la présence de la main dans la cage pendant environ 30 s.
4. Essayez de ramasser la souris dans la paume de la main (c.-à-d. évitez de ramasser l’animal par sa queue).
   1. Si la souris n’est pas facilement ramassée après 3 tentatives, guidez la souris vers un coin et une tasse avec les deux mains.
   2. Déplacez doucement les mains en coupe vers la souris pour essayer de la ramasser.
   3. En cas d’échec après un maximum de 3 tentatives avec les deux mains, prenez doucement la souris par la base de sa queue et transférez-la à votre avant-bras ou à votre main plate.
5. Avec la souris dans la main, gardez la main aussi plate et ouverte que possible.
   REMARQUE: Cela fournit une plate-forme plate sur laquelle la souris peut marcher et limite le risque de piqûres.
6. En tenant la main ouverte et plate avec la paume vers le haut, placez l’autre main à côté de la main qui tient la souris et laissez la souris se déplacer librement d’une main à l’autre sans aucune retenue (Figure 1B).
7. Laissez la souris explorer et se déplacer entre les mains pendant 1 min.
   1. À ce stade, les souris peuvent essayer de sauter. Positionnez les mains de manière à ce que si la souris saute, elle atterrisse sur un comptoir plutôt que sur le sol.
   2. Si une souris semble se préparer à sauter (se déplaçant vers le bord de la main et se redressant sur les pattes postérieures), placez lentement l’autre main devant elle et essayez de la guider pour qu’elle marche sur cette main. Évitez les mouvements brusques car cela augmente leur risque de sauter.
   3. Si une souris saute, essayez de la ramasser en évitant la manipulation de la queue et reprenez la session de manipulation. Si la souris reste sur le sol ou hors des mains pendant plus de 10 s, ajoutez du temps supplémentaire à la session de manipulation pour compenser chaque fois que la souris était hors des mains.
   4. Prenez des notes sur le saut. Le nombre total de sauts peut être utilisé pour évaluer la variabilité potentielle entre les animaux.
8. Après 1 min de manipulation avec les mains plates, relâchez la paume de la main et coupez légèrement la souris dans la main, avant de rouler doucement la souris entre les mains (Figure 1C).
   1. Pour « rouler », positionnez la souris dans la paume de la main, sur une main plate, perpendiculaire aux doigts.
   2. Fermez lentement la main, en plaçant les doigts sur le dos de la souris.
   3. Placez la main libre directement sous la main en tenant la souris.
   4. Tournez /faites pivoter lentement la main avec la souris pour transférer doucement la souris à l’autre main (flip à 180 °).
   5. Répétez ceci d’avant en arrière entre les mains.
9. Alternez entre le roulement doux entre les mains et l’exploration libre sur les mains ouvertes pendant 60 s, en alternant entre les techniques environ toutes les 20 s.
10. Effectuer un « test d’abri » (Figure 1D).
    1. Laissez la souris se déplacer sur le bord de la main puis rapprochez les 2 mains.
    2. Très lentement, coupez-les pour que la souris rentre dans un « abri » formé par les mains. Laissez une ouverture pour que la souris puisse s’échapper si nécessaire.
    3. Essayez de garder la souris à l’abri pendant 5 à 10 s, sans aucune contrainte.
    4. Alternez entre le test de l’abri, le roulis entre les mains et l’exploration libre des mains ouvertes pendant encore 60 s, en veillant à effectuer l’étape de l’abri 3 fois ou plus.
11. Dans toutes les procédures décrites à la section 2.10, ne précipitez pas le processus. Si la souris semble stressée (c.-à-d. tentative d’évasion, saute des mains, évite le contact avec les mains, etc.) en étant confinée à l’intérieur des mains, continuez à rouler entre les mains et à explorer librement pendant 20 s, puis réessayez.
12. Jalon : Effectuez au moins 1 test d’abri réussi de 10 s pour terminer le jour 1.
    1. Considérez un test d’abri réussi lorsque la souris reste dans les mains. Si la souris sort la tête et retourne à l’abri, c’est toujours un test réussi. Si l’animal sort entièrement du refuge, c’est un échec.
13. Permettre l’exploration libre dans les mains pendant 30 s.
14. Remplacez doucement la souris dans sa cage. Si le groupe est logé, placez la souris dans la cage temporaire jusqu’à ce que tous les compagnons de cage soient manipulés. Remettent les souris dans leur cage d’origine en les ramassant dans la paume de la main. N’utilisez pas de ramassage de queue.
15. Nettoyez la paillasse des matières fécales potentielles et de l’urine avec de l’éthanol à 70%.
16. Rincez soigneusement les gants avec de l’éthanol à 70% (ou une solution de nettoyage appropriée) ou changez de gants avant de manipuler la prochaine souris (il est possible de garder les mêmes gants pour les compagnons de cage).
    REMARQUE: Il est recommandé d’effectuer la manipulation avec un nombre raisonnable d’animaux pour éviter la fatigue du manipulateur. La manipulation de 24 souris prend environ 2 h et il est recommandé de ne pas dépasser 24 souris par manipulateur. Si plus d’animaux doivent être manipulés, il est recommandé soit d’avoir plusieurs manipulateurs, soit de diviser les procédures de manipulation en sous-groupes, sur plusieurs jours.

3. JOUR 2 : 3 à 5 min par souris

1. Essayez de prendre la souris dans la paume de la main. À ce stade, cela devrait déjà être faisable et les souris ne devraient pas sauter de la main.
2. Commencez par ouvrir la paume comme le jour 1, ce qui permet à la souris d’explorer librement pendant 20 s.
3. Ensuite, roulez la souris entre les mains plusieurs fois (4-5 fois).
4. Effectuez le « test d’abri » pendant 5 s.
5. Répétez le test d’abri plusieurs fois (~5-6) sur une période de 2 à 3 minutes.
6. Au cours de la même période de 2 à 3 minutes, alternez avec le roulement entre les mains et l’exploration libre des mains ouvertes à partir du jour 1 pour améliorer l’accoutumabilité.
   1. Touchez la souris sur la tête et le dos (Figure 1E), 5 à 6 fois. Un signe d’accoutumant est lorsque la souris vous permet de la toucher sans tenter de vous échapper.
   2. Effectuez un « nose poke » : Essayez de toucher le museau de la souris, 2 à 3 fois (Figure 1F).
      1. Si la souris tente de mordre ou montre des signes évidents de stress au toucher, ne réessayez pas immédiatement de piquer le nez. Au lieu de cela, alternez avec l’exploration à la main plate et roulez. L’accoutumante se traduit par le fait que l’animal ne s’enfuit pas ou ne tourne pas la tête en cas de contact humain.
7. Dans toutes les procédures décrites aux 3.4-3.6, ne précipitez pas le processus. Si la souris semble stressée par le fait d’être confinée à l’intérieur des mains ou ne veut pas être touchée, continuez à rouler entre les mains pendant 20 à 30 s, puis réessayez.
8. Jalons: Effectuez au moins 1 piqûre de nez réussie pendant 2-3 s pour terminer le jour 2.
9. Arrêtez cette séance après environ 3 minutes de manipulation si l’animal réagit bien au « refuge », aux « caresses de tête », au « nez piqué », et si la souris semble disposée à explorer les mains sans signes de stress.
10. Si la souris continue de présenter des signes de stress ou ne réagit pas bien au test « shelter test » ou « nose poke », poursuivez la séance jusqu’à atteindre 5 min comme au jour 1.
11. Remplacez la souris dans sa cage, nettoyez la paillasse et les gants comme au Jour 1.

4. JOUR 3: Environ 3 min par souris

1. Le troisième jour, suivez les mêmes étapes qu’au jour 2, pendant 2 à 3 min.
   1. Prenez la souris dans la paume de la main.
   2. Transférez et roulez la souris entre les mains
   3. Effectuez un test d’abri.
   4. Essayez de caresser la souris sur le dos et la tête.
2. Alternez entre ces étapes sur environ 1 à 2 min.
3. Continuez la procédure jusqu’à ce que la souris soit suffisamment détendue pour s’asseoir dans la paume de la main sans tenter de s’échapper.
4. Avant la fin du jour 3, répétez le test d’abri et le test de piqûre de nez comme test d’accoutumant.
   1. Si les deux tests peuvent être complétés à leur première tentative, le processus d’accoutumant est terminé. Continuez à manipuler doucement la souris pendant 30 s à une minute.
   2. Si la souris est initialement résistante à l’un ou l’autre test, répétez les étapes 4.1 à 4.3 pendant 20 à 30 s avant de réessayer le test de piqûre de nez et d’abri.
   3. Si la souris reste résistante à ces tests après 3 min, le troisième jour peut être répété.
5. Jalons: Effectuez au moins 2 tests d’abri réussis de 10 s chacun, et 2 tests de piqûre de nez réussis pour terminer le jour 3 et terminer l’ensemble de la procédure de manipulation 3D.
6. Resser la souris dans sa cage, nettoyer la paillasse et les gants.

5. Approche facultative pour les animaux soumis à une contention pour injection ou gavage

REMARQUE: Le jour 3, si l’animal est retenu à des fins expérimentales (gavage oral, injection intra-péritonéale, etc.), les souris peuvent être soumises au test de pincement du cou.

1. Saisissez la nuque entre le pouce et l’index(Figure 1G).
2. Soulevez la souris de 3 à 5 cm au-dessus de la main pendant 2 à 3 s.
   REMARQUE: Il s’agit normalement d’une position non naturelle pour les souris adultes, et si les souris restent presque immobiles, elles sont bien habituées à la manipulation et seront faciles à retenir à des fins expérimentales.
3. Replacez la souris dans la main plate ou, si la souris est réactive au pincement du cou, envisagez de la placer sur la manche, le couvercle de la cage ou le comptoir de l’expérimentateur.
   REMARQUE: Si vous travaillez dans une armoire de biosécurité, ne placez pas la souris sur le manchon ou elle pourrait se lever et sortir de l’armoire de biosécurité. Préférez placer la souris sur le comptoir à l’intérieur de l’armoire de biosécurité.
4. Laissez la souris explorer librement la main de l’expérimentateur pendant 1 min.

6. Approche facultative pour les jours supplémentaires de manutention

1. Dans l’éventualité d’une lignée de souris très stressée, ajoutez des jours supplémentaires pour diminuer la réactivité et le niveau de stress des animaux, en utilisant les méthodes décrites au jour 2/3.
   REMARQUE: De nombreux facteurs peuvent affecter le stress de base des animaux, y compris la souche, la présence de modifications transgéniques, l’âge, le sexe et les conditions de logement. Si ces facteurs ne sont pas cohérents entre des groupes tels que les animaux âgés testés sur de jeunes témoins ou les animaux transgéniques testés sur des témoins de type sauvage, il est recommandé d’utiliser le même nombre de jours d’accoutumant pour chaque groupe.

7. Manutention des tunnels

REMARQUE: Cette technique s’applique uniquement aux souris à manipulation tunnel. Les tunnels sont des tubes en polycarbonate d’environ 13 cm de long et 5 cm de diamètre.

1. Placez le tunnel dans la cage de la souris.
2. Laissez le tunnel dans la cage pendant 7 jours avant la manipulation.
3. Ouvrez la cage et placez le couvercle sur le côté.
4. Guidez doucement la souris dans le tunnel en polycarbonate (déjà dans la cage).
5. Soulevez le tunnel de la cage, horizontalement. Si nécessaire, couvrez lâchement les extrémités du tunnel pour empêcher l’animal de sauter / tomber du tunnel, retombant potentiellement dans sa cage ou sur le sol.
6. Éloignez l’animal dans le tunnel de la cage de la maison et tenez-le à l’écart de toute surface pendant 30 s.
7. Replacez le tunnel dans la cage de la maison, ce qui permet à la souris de sortir du tube.
8. Attendez 60 s, puis répétez les étapes 7.4 à 7.7 une fois.
9. Rincez soigneusement les gants avec de l’éthanol à 70% ou changez de gants avant d’habituer la souris suivante.
10. Répétez cette procédure pendant 10 jours consécutifs.

8. Manipulation de la queue

REMARQUE: Cette technique s’applique uniquement aux souris à manche de queue. Il est utilisé pour transférer des souris de leur cage à un appareil, et vice versa.

1. Ouvrez la cage et placez le couvercle sur le côté.
2. Saisissez les souris par la base de la queue entre le pouce et l’index.
3. Soulevez la souris de la cage.
4. En 2-3 s, transférez la souris à l’avant-bras opposé de l’expérimentateur tout en maintenant une prise sur la queue pour éviter que la souris ne pende.
5. Lorsque la manipulation de la queue est nécessaire dans la mise en œuvre de cette expérience (p. ex., avant les prélèvements sanguins pour les tests de cortisol), les animaux sont transférés à l’avant-bras de l’expérimentateur par manipulation de la queue et maintenus pendant 15 s avant d’être renvoyés dans leur cage.

9. Labyrinthe Surélevé Plus

1. Configuration de la salle
   1. Placez le labyrinthe au milieu de la pièce, sous un appareil photo numérique équipé d’une carte mémoire.
   2. Installez la lumière de la pièce à ~60 Lux à l’aide de 2 lampes debout placées derrière le labyrinthe.
   3. Éteignez tout éclairage aérien pour éviter la lumière directe sur le labyrinthe qui crée une réflexion et perturbe la détection des animaux dans le labyrinthe.
   4. Une fois tout l’équipement installé, transférez les animaux dans la pièce et laissez-les s’acclimater aux réglages de lumière et au nouvel environnement pendant 30 minutes.
2. Test
   1. Nettoyez le labyrinthe avec de l’éthanol à 70% pour éviter les odeurs de poussière ou de l’animal qui a été testé précédemment.
   2. Démarrez l’appareil photo.
   3. Utilisez un morceau de papier avec l’ID de l’animal pour enregistrer l’ID sur la vidéo, avant de placer l’animal dans le labyrinthe (cela facilitera l’identification correcte de la souris filmée sur chaque vidéo).
   4. Utilisez la technique de manipulation appropriée à chaque animal pour le transférer dans le labyrinthe.
   5. Placez la souris sur la plate-forme centrale, face à un bras ouvert.
   6. Laissez la souris explorer l’appareil pendant 10 minutes, sans être dérangé.
   7. Après 10 minutes, arrêtez la caméra.
   8. Récupérez la souris du labyrinthe et remettez-la dans sa cage.
   9. Nettoyez les matières fécales et l’urine du labyrinthe avec 70% d’éthanol.
   10. Une fois le test terminé avec toutes les souris, transférez les vidéos de la carte mémoire vers un ordinateur pour le suivi vidéo.
   11. À l’aide d’un logiciel automatisé de suivi des animaux, suivez le nombre d’entrées dans les bras ouverts et fermés, et le temps passé dans les bras ouverts ou fermés (ici Ethovision XT 14).

10. Interaction de l’expérimentateur (dérivée de Hurst et West⁹⁾

1. Configuration de la salle
   1. Placez une table au milieu de la salle de test sous un appareil photo numérique équipé d’une carte mémoire.
   2. Installez la lumière à 50-70 Lux avec 4 ampoules placées dans le coin de la pièce face au plafond. Éteignez l’éclairage aérien pour éviter la lumière directe sur le labyrinthe qui crée une réflexion et perturbe la détection des animaux dans l’arène.
   3. Amenez les animaux dans la pièce.
   4. Laissez-les s’acclimater à la pièce pendant 30 minutes.
2. Expérience
   1. Placez la cage de la maison sous l’appareil photo numérique.
   2. Retirez le couvercle.
   3. Enlevez le matériel de nidification et tout autre enrichissement qui pourrait interférer avec le suivi des animaux.
   4. Démarrez l’appareil photo.
   5. Utilisez la carte de cage avec l’identifiant de l’animal pour identifier l’animal sur la vidéo.
   6. Placez une main dans la cage de la maison le long du mur de la cage à l’avant droit.
      1. Assurez-vous que la tête du manipulateur ne bloque pas l’appareil photo pour filmer la souris.
   7. Démarrez une minuterie.
   8. Gardez la main immobile pendant 2 minutes et laissez la souris explorer la main.
   9. Retirez la main de la cage pendant 15 s.
   10. Essayez de ramasser la souris à l’aide de mains coupées et enregistrez si la souris s’enfuit.
   11. Répétez la dernière étape jusqu’à cinq fois, toutes les 5 secondes, ou jusqu’à ce que la souris se permette d’être ramassée.
   12. Enregistrez le nombre de tentatives nécessaires pour décrocher la souris.
   13. Retournez le matériel de nidification et l’enrichissement dans la cage.
   14. Nettoyez les gants avec de l’éthanol à 70% ou changez de gants avant de passer à l’animal suivant.
   15. Après le test, transférez les vidéos de la carte mémoire vers un ordinateur.
   16. À l’aide d’un logiciel de suivi vidéo automatisé, divisez la cage en quatre quadrants égaux et enregistrez le temps passé par la souris dans chaque quadrant (ici, Ethovision XT 14).

11. Nouveauté Alimentation supprimée

1. Privation de nourriture
   1. 3 jours avant le test, effectuez un changement complet de la cage et hébergez individuellement les animaux (un seul logement est préférable pour effectuer le test de la cage à domicile).
      REMARQUE: Fournir de la literie fraîche élimine la poussière potentielle ou les petits morceaux de nourriture qui s’accumulent dans la litière depuis le dernier changement de cage.
   2. La veille du test, pesez tous les animaux vers 18 heures.
   3. Retirez tous les aliments de la trémie et assurez-vous qu’il n’y a pas de morceaux de nourriture dans la cage ou dans la litière.
2. Configuration de la salle
   1. Placez la chambre NSF sur une table.
   2. Remplissez la chambre avec une fine couche de litière de maïs (ou d’une autre litière différente de la litière utilisée dans la cage domestique des animaux).
   3. Installez la lumière à 70 Lux avec 4 ampoules placées dans le coin de la table où se trouve la chambre, face au plafond. Éteignez les plafonniers pour maintenir un faible éclairage de la pièce.
   4. Placez une pastille de chow standard utilisée dans l’installation, sur le côté de la chambre face à l’expérimentateur (≈10 cm du mur).
3. Test
   1. Le matin, après la privation de nourriture, amenez les animaux dans la pièce 30 minutes avant le test pour les laisser s’acclimater aux paramètres de lumière et au nouvel environnement.
   2. Peser tous les animaux afin de mesurer leur perte de poids en fonction du poids mesuré la veille. Les animaux devraient perdre 8 à 12% du jour au lendemain pour pouvoir effectuer la tâche correctement.
   3. Triez les animaux par perte de poids et filtrez-les en partant de la souris qui a le plus perdu jusqu’à la souris qui a perdu le moins de poids.
   4. Assurez-vous que la chambre est remplie de litière et d’une seule pastille.
   5. Placez l’animal du côté opposé de la chambre, loin de la pastille de nourriture.
   6. Démarrez la minuterie immédiatement.
   7. Laissez la souris explorer la chambre pendant 12 minutes.
   8. Mesurez la latence pour approcher et nourrir (l’animal doit mordre et manger) sur le granulé alimentaire.
      1. Considérez qu’il s’agit d’une approche lorsque l’animal s’approche de la pastille, la sent et ne mord pas.
      2. Définissez une morsure comme lorsque l’animal commence à consommer le granulé.
   9. Enregistrez la latence pour approcher et alimenter la pastille en quelques secondes.
   10. Une fois que la souris s’est nourrie de la pastille alimentaire, retirez-la de la chambre.
   11. Jetez la literie, mais conservez le granulé qui sera utilisé pour tester l’entraînement de l’appétit dans la cage de la souris.
   12. Réinitialisez la chambre pour l’animal suivant et passez à l’animal suivant.
   13. 15 min après la fin du test dans la chambre, déposer la pastille utilisée pendant le test, à l’intérieur de la cage de la souris, contre le mur à l’avant de la cage.
   14. Mesurez la latence pour vous nourrir de la pastille lorsque la pastille est dans la cage de la maison. Il s’agit d’une mesure de l’entraînement de l’appétit.
       1. Il est préférable de retirer le matériau de nidification pour s’assurer que la souris voit la pastille tomber dans sa cage.

12. Collecte de sérum et mesure de la corticostérone

1. Manipulez les animaux pendant 1 min en utilisant la technique assignée, 15 min avant la collecte de sang (cela peut être fait avec des animaux logés en groupe ou en individuel, en gardant à l’esprit le risque de bagarres lors du regroupement de souris).
   1. Pour les souris manipulées par le tunnel, guidez-les vers le tunnel, soulevez le tunnel de la cage pendant 1 min et remplacez la souris dans sa cage.
   2. Pour les souris manipulées par la queue, attrapez la base de la queue de la souris et retirez la souris de sa cage. Transférez la souris dans la pochette de l’expérimentateur pendant 1 min et ramenez la souris dans sa cage en manipulant la queue.
   3. Pour les souris manipulées en 3D, utilisez des mains en coupe pour retirer la souris de sa cage. Tenez la souris dans des mains coupées pendant 1 min et retournez-la dans sa cage.
2. 15 min après la manipulation, procéder à la collecte de sang dans la veine sous-maxillaire²².
3. Frottez fermement la souris de manière à ce que la tête de la souris soit solidement immobilisée.
4. Localisez le site de la ponction.
   1. Il y a une petite fossette sans poils le long de la mandibule du visage qui peut être utilisée comme point de repère pour localiser le site de ponction. En traçant une ligne entre la base de la mâchoire et cette fossette, le site de ponction se trouve derrière cette fossette vers l’oreille d’environ 5 mm, juste derrière la charnière de la mâchoire.
5. Tenez une aiguille propre de 23 G perpendiculairement au site de ponction et utilisez un mouvement d’autopiqueur ferme et rapide. La pointe de l’aiguille doit pénétrer à une profondeur comprise entre 1 et 2 mm, le sang circulera immédiatement dès que la veine est perforée.
6. Recueillir environ 150 μL de sang dans des tubes de collecte enduits d’EDTA et les stocker sur de la glace.
7. Appliquez une légère pression avec un tampon de gaze stérile sur le site de ponction pendant 5 s ou plus pour permettre au sang de coaguler.
8. Une fois que le sang a coagulé, ramenez la souris dans sa cage d’origine.
9. Centrifuger le sang à 4 °C 3 500 x g pendant 10 min.
10. Décantez le surnageant.
11. Stocker le surnageant à -20 °C pour les analyses en aval.
12. Mesurez les niveaux de corticostérone à l’aide d’un kit ELISA de corticostérone en suivant le protocole du fabricant.
13. Utilisez un spectrophotomètre pour lire les résultats ELISA.

Résultats

Deux études distinctes ont été réalisées avec des souris C57BL/6. Les #1 de l’étude incluaient des mâles de 6 mois et l’étude #2 incluait des femelles de 2,5 mois (N = 36 / étude) de Jackson Laboratories (Cat #000664). Les souris sont arrivées dans l’établissement à l’âge de 2 mois. Alors que l’étude #2 les femmes ont été manipulées et testées deux semaines après leur arrivée, l’étude #1 les hommes n’ont été manipulés et testés qu’à l’âge de 6 mois (retard dû à l’arrêt de...

Discussion

Cette étude et le développement de méthodes sont basés sur l’observation que les techniques de manipulation chez la souris sont encore négligées par la communauté scientifique, et que certains laboratoires sont encore réticents à mettre en œuvre des techniques d’accoutumant ou de manipulation pour réduire le stress et la réactivité de leurs animaux avant les expériences. Tout en représentant un engagement de temps, la manipulation des animaux fournit des effets bénéfiques aux animaux qui peuvent cont...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
23 G x 1 in. BD PrecisionGlide general use sterile hypodermic needle. Regular wall type and regular bevel.	BD	2546-CABD305145	Needles for Blood collection
BD Vacutainer® Venous Blood Collection EDTA Tubes with Lavender BD Hemogard™ closure, 2.0ml (13x75mm), 100/pk	BD	367841	EDTA Coated tubes for blood collection
Bed’o cobs ¼” Corn cob laboratory animal bedding	Bed-O-Cobs	BEDO1/4	Novel bedding for novelty suppressed feeding
Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5424 R	For centrifugation of blood.
Corticosterone ELISA Kit	Arbor Assays	K003-H1W
Digital Camera	Panasonic	HC-V770	Camera to record EPM/Experimenter interactions
Elevated Plus Maze	Home Made	n/a	Custom Maze made of four black Plexiglas arms (two open arms (29cm long by 7 cm wide) and two enclosed arms (29 cm long x7 cm wide with 16 cm tall walls)) that form a cross shape with the two open arms opposite to each other held 55 cm above the floor
Ethanol	Medstore House Brand	39753-P016-EA95	Dilute to 70% with Distilled water, for cleaning
Ethovision XT 15	Noldus	n/a	Automated animal tracking software
Laboratory Rodent Diet	LabDiet	Rodent Diet 5001	Standard Rodent diet
Memory Card	Kingstone Technology	SDA3/64GB	For video recording and file transfer
Novelty Suppressed Feeding Chamber	Home Made	n/a	Custom test plexiglass test chamber with clear floors and walls 62cm long, by 31cm wide by 40cm tall .
Parlycarbonate tubes	Home Made	n/a	13 cm in length and 5cm in diameter
Purina Yesterday’s news recycled newspaper bedding	Purina	n/a	Standard Bedding
Spectrophotometer	Biotek	Epoch Microplate Reader