טכניקות טיפול להפחתת מתח בעכברים

Summary

מאמר זה מתאר טכניקת טיפול בעכברים, טכניקת הטיפול בתלת-ממד, המאפשרת טיפול שגרתי על ידי הפחתת התנהגויות דמויות חרדה ומציגה פרטים על שתי טכניקות קשורות קיימות (טיפול במנהרה וזנב).

Abstract

חיות מעבדה נתונות למניפולציות מרובות על ידי מדענים או ספקי טיפול בבעלי חיים. הלחץ זה גורם יכול להיות השפעות עמוקות על רווחת בעלי חיים והוא יכול גם להיות גורם מבלבל עבור משתנים ניסיוניים כגון צעדי חרדה. במהלך השנים פותחו טכניקות טיפול הממזערות את הלחץ הקשור לטיפול עם דגש מיוחד על חולדות, ותשומת לב מועטה לעכברים. עם זאת, הוכח כי עכברים יכולים להיות מורגלים מניפולציות באמצעות טכניקות טיפול. התרגלות עכברים לטיפול מפחיתה את הלחץ, מקלה על טיפול שגרתי, משפרת את רווחת בעלי החיים, מפחיתה את השתנות הנתונים ומשפרת את האמינות הניסיונית. למרות ההשפעות המועילות של הטיפול, הגישה לאיסוף זנב, שהיא מלחיצה במיוחד, עדיין נמצאת בשימוש נרחב. מאמר זה מספק תיאור מפורט והדגמה של טכניקה חדשה לטיפול בעכבר שנועדה למזער את הלחץ שחוותה החיה במהלך אינטראקציה אנושית. טכניקה ידנית זו מבוצעת במשך 3 ימים (טכניקה לטיפול בתלת-ממד) ומתמקדת ביכולתו של בעל החיים להרגיל את הנסיין. מחקר זה מראה גם את ההשפעה של טכניקות טיפול במנהרות שהוקמו בעבר (באמצעות מנהרת פוליקרבונט) וטכניקת איסוף הזנב. נחקרו במיוחד הם ההשפעות שלהם על התנהגויות דמויי חרדה, באמצעות בדיקות התנהגותיות (מבוך גבוה פלוס והאכלה מדוכאת חידוש), אינטראקציה מרצון עם ניסויים ומדידה פיזיולוגית (רמות קורטיקוסטרון). טכניקת הטיפול בתלת-ממד וטכניקת הטיפול במנהרות הפחיתו פנוטיפים דמויי חרדה. בניסוי הראשון, באמצעות עכברים זכרים בני 6 חודשים, טכניקת הטיפול בתלת-ממד שיפרה באופן משמעותי את אינטראקציית הנסיין. בניסוי השני, באמצעות נקבה בת חודשיים וחצי, היא הפחיתה את רמות הקורטיקוסטרון. ככזה, טיפול בתלת-ממד הוא גישה שימושית בתרחישים שבהם נדרשת אינטראקציה עם הנסיין או מועדפת, או כאשר טיפול במנהרות עשוי שלא להיות אפשרי במהלך הניסוי.

Introduction

עכברים וחולדות הם נכסים חיוניים למחקרים פרה-קליניים^1,2 למטרות מרובות, כולל אנדוקרינלית, פיזיולוגית, מחקרים פרמקולוגיים או התנהגותיים². מהמספר ההולך וגדל של מחקרים הקשורים בבעלי חיים, עלה כי משתנים סביבתיים בלתי מבוקרים כולל אינטראקציה אנושית משפיעים על תוצאות שונות במחקר ביו-רפואי^3,4,5. זה אחראי על שונות משמעותית שנצפו על פני ניסויים ומעבדות מחקר^4,5, מהווה אזהרה גדולה במחקר בבעלי חיים.

גישות שונות יושמו במטרה להגביל את ההשפעה של גורמי לחץ סביבתיים והפחתת התגובה לאינטראקציה האנושית. לדוגמה, כדי להגביל את ההשפעה של גורמי לחץ סביבתיים, סטנדרטיזציה של תנאי הדיור ומערכות דיור אוטומטיות^6,7 יושמו במעבדות. לגבי אינטראקציה עם בני אדם, גישות נפוצות לטיפול והובלת בעלי חיים לא התייחסו כלל לאי נוחות ומתח של בעלי חיים. לדוגמה, איסוף בעלי חיים בזנבם או באמצעות מלקחיים⁸ מגביר את החרדה הבסיסית^9,10,11, מפחית את המחקר^9,12 ותורם רבות לשונות בין אינדיבידואלית בתוך ומרחב מחקרים^13,14. כתוצאה מכך, פותחו גישות אחרות, כגון טכניקת הטיפול בכוס, החלה על עכברים וחולדות. בגישה זו, בעלי החיים מכוסים מהכלוב שלהם, ומוחזקים על ידי הנסיינים עם ידיהם ויוצרים^9,10,11. חלופה שימושית נוספת לטיפול בזנב כוללת שימוש במנהרת פוליקרבונט להעברת עכברים^9,10,15. גישה זו מבטלת אינטראקציה ישירה בין העכבר לבין הנסיין. הן גישות הגביע והן גישות המנהרה הראו יעילות בהפחתת התנהגויות דמויי חרדה ופחד מהנסיין שניתן להגזים על ידי טכניקות טיפול מרתיעות, כגון איסוף זנב / טיפול בזנב^9,10.

לכן, הגדלת הראיות מדגימה את התועלת של טיפול נכון בעכבר להפחתת השונות בין אנשים^9,11, ושיפור רווחת בעלי החיים¹⁰. עם זאת, הטכניקות שהוזכרו לעיל עדיין מתמודדות עם מגבלות. טכניקת הטיפול בגביע יושמה עם לוחות זמנים הנעים בין 10 ימים (10 מפגשים על פני שבועיים¹⁶) עד 15 שבועות¹⁷, וזה כמות ניכרת של זמן עבור צוות המתקן והנסיינים. בנוסף, האפקטיביות של טיפול בכוס משתנה על ידי^{זן 9} וטיפול כוסות קונבנציונאלי בידיים פתוחות עלול להוביל עכברים נאיביים או זנים קופצים במיוחד לקפוץ מהיד^9,18. טיפול במנהרות מביא לתוצאות עקביות יותר ובדרך כלל מהירות יותר בעדינות¹⁹. מנהרות משמשות גם כהעשרת כלוב ביתי. הם עוזרים לבעלי חיים להרגל להתמודד במהירות ומספקים את היתרונות הנוספים של העשרה. עם זאת, לטיפול במנהרות יש מגבלות בעת העברת בעלי חיים בין מכשירים. מעניין, הרסט ומערב⁹, והנדרסון ואח^'20 הוכיח כי באמצעות טיפול ידני עדין וקצר כדי להעביר בעלי חיים מהמנהרה למנגנון אינו משפיע על הפנוטיפ שלהם.

כדי לספק חלופה לשיטות קיימות, עם הרגל בר השגה בפרק זמן קצר, מאמר זה מתאר טכניקה חדשנית המתרחבת על טכניקת הטיפול בגביע, ולכן אינה דורשת ציוד מסוים. גישה זו משתמשת באבני דרך כדי לאמוד את רמת הנוחות שיש לעכברים בתהליך הטיפול. הוא מראה יעילות בהפחתת תגובתיות העכבר ומתח (ברמות ההתנהגותיות וההורמונליות), מקל על טיפול שגרתי ותורם להפחתת השונות בין בעלי החיים. פרטים על טכניקה זו מסופקים כאן, ויעילותה בהפחתת התנהגויות דמויות חרדה, שיפור האינטראקציה עם הנסיינים והגבלת שחרור הורמון הלחץ ההיקפי (קורטיקוסטרון) מוצגים בשני מחקרים נפרדים (עכברים זכרים ונקביים), בהשוואה לטיפול במנהרות (שליטה חיובית) וטכניקות טיפול בזנב (שליטה שלילית).

Protocol

נהלים הנוגעים לנושאים בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים CAMH ונערך בהתאם להנחיות המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים.

הערה: שיטת הטיפול המתוארת בזאת יכולה לשמש בזני עכבר שונים, כולל קווים לא מהונדסים (C57/BL6, BalbC, CD1, SV129 וכו ') וקווים מהונדסים. זה יכול לשמש גם עם עכברים צעירים או זקנים, וציין כי צעירים (4-6 שבועות) עכברים נוטים להיות קצת יותר פעילים מאשר עכברים מבוגרים או זקנים, במיוחד ביום 1.

1. הכנה ניסיונית

1. לפני תחילת הלימודים, לפי הנחיות ARRIVE²¹, הקצה עכברים באופן אקראי לכל קבוצת טיפול (טיפול בתלת-ממד, טיפול במנהרות או טיפול בזנב).
2. זהה את החדר לביצוע הטיפול. ניתן לבצע זאת בחדר הדיור, או בחדר נפרד. אם הטיפול מתבצע בחדר נפרד, המחייב את בעלי החיים להיות מועברים על עגלה נעה, לאפשר לבעלי החיים להרגיל לחדר החדש במשך 20-30 דקות לפני תחילת פרוטוקול הטיפול.
3. עבור בעלי חיים ששוכנו בקבוצה, השתמש בכלוב זמני כדי לשכן עכברים לאחר הטיפול, לפני שארגן מחדש את כולם בכלוב הביתי הראשוני שלהם. זה מפחית את הקרבות הפוטנציאליים בין בעלי חיים לפני הטיפול (במיוחד אצל זכרים).
4. עבודה על דלפק (רצוי משטח עבודה מנוקה) או בארון בטיחות ביולוגית, כאשר כלוב הדיור הרחק מהחיה מטופל. הקרבה לכלוב הדיור מגבירה את הסיכון לקפיצה. אם בעלי חיים הם קבוצה שוכנות, קפיצה של העכבר מטופל לתוך הכלוב הביתי עלול לגרום מתח לבני כלוב.
   הערה: עבודה בארון בטיחות ביולוגי מגבילה את הסיכון לעכברים לקפוץ על הרצפה, וניתן לדרוש זאת במתקנים מסוימים. טכניקה זו יכולה לשמש בארון בטיחות ביולוגית, הקפדה תמיד לבצע את כל השלבים בתוך ארון הבטיחות הביולוגית, והימנעות עכברים הליכה על זרועות המטפל.

2. יום 1: 5 דקות לעכבר

1. פתחו בעדינות את הכלוב והניחו את המכסה בצד, הסירו חומרי קינון והעשרה אחרת כגון גלגלי ריצה או מקלטים.
2. הציגו יד פתוחה בכפפות לכלוב הביתי, והניחו את היד באיטיות לאורך צד אחד של קיר הכלוב (הקיר הקרוב ביותר למפעיל, איור 1A).
   1. אל תנסה מיד להרים את העכבר.
3. הישארו ללא תנועה ואפשרו לחיה להרגיל לנוכחות היד בכלוב במשך כ -30.
4. נסה להרים את העכבר בכף היד (כלומר, להימנע להרים את החיה בזנבה).
   1. אם העכבר לא נאסף בקלות לאחר 3 ניסיונות, הנחה את העכבר לפינה וכוס בשתי הידיים.
   2. הזז בעדינות את הידיים מכוסות לכיוון העכבר כדי לנסות להרים אותו.
   3. אם לא מצליח לאחר מקסימום של 3 ניסיונות בשתי הידיים, הרם את העכבר בעדינות על ידי בסיס הזנב שלו, והעביר אותו לאמה או יד שטוחה.
5. עם העכבר ביד, לשמור על היד שטוחה ופתוחה ככל האפשר.
   הערה: פעולה זו מספקת פלטפורמה שטוחה לעכבר לצעוד עליו, ומגבילה את הסיכון לעקיצות.
6. מחזיקים את היד פתוחה ושטוחה עם כף יד למעלה, מניחים את היד השנייה צמודה ליד שמחזיקה את העכבר ומאפשרים לעכבר לנוע בחופשיות מיד ליד ללא כל מעצור(איור 1B).
7. תן לעכבר לחקור ולנוע בין הידיים במשך דקה אחת.
   1. בשלב זה עכברים עשויים לנסות לקפוץ משם. מקם את הידיים כך שאם העכבר קופץ, הוא ינחת על משטח ולא על הרצפה.
   2. אם עכבר נראה כאילו הוא מתכונן לקפוץ (נע לכיוון קצה היד וגידול על הרגליים האחוריות), לאט למקם את היד השנייה מולו ולנסות להנחות אותו ללכת על היד הזאת. הימנע תנועות פתאומיות כפי שהוא מגביר את הסיכון שלהם לקפוץ.
   3. אם עכבר אכן קופץ, נסה להרים אותו ולהימנע מטיפול בזנב ולחדש את הפעלת הטיפול. אם העכבר נשאר על הרצפה או מחוץ לידיים במשך יותר מ -10 s, הוסף זמן נוסף לפגישת הטיפול כדי לפצות על כל פעם שהעכבר היה מחוץ לידיים.
   4. תציין את הקפיצה. המספר הכולל של קפיצות יכול לשמש כדי להעריך שונות פוטנציאלית בין בעלי חיים.
8. לאחר דקה אחת של טיפול בידיים שטוחות, הרפה את כף היד, ועט העכבר ביד, לפני גלגול עדין של העכבר בין הידיים(איור 1C).
   1. כדי "לגלגל", למקם את העכבר בכף היד, על יד שטוחה, בניצב לאצבעות.
   2. סגור לאט את היד, מניח את האצבעות על גב העכבר.
   3. הנח את היד החופשית ישירות מתחת ליד מחזיק את העכבר.
   4. סובב/סובב את היד באיטיות עם העכבר כדי להעביר בעדינות את העכבר ליד השנייה (180° להעיף).
   5. חזור על זה הלוך ושוב בין הידיים.
9. לסירוגין מגלגול עדין בין ידיים וחקירה חופשית על ידיים פתוחות במשך 60 s, לסירוגין בין טכניקות על כל 20 s.
10. בצע "בדיקת מחסה"(איור 1D).
    1. תן לעכבר לזוז לקצה היד ואז לאחד את 2 הידיים.
    2. לאט מאוד, אותם כך העכבר מתאים בתוך מקלט שנוצר על ידי הידיים. השאר פתח כדי שהעכבר יוכל לברוח במידת הצורך.
    3. כוון לשמור את העכבר במקלט במשך 5-10 s, ללא כל איפוק.
    4. לסירוגין בין מבחן המקלט, להתגלגל בין הידיים וחקירה חופשית של ידיים פתוחות עוד 60 s, להיות בטוח לבצע את שלב המקלט 3 פעמים או יותר.
11. בכל ההליכים המתוארים ב 2.10, לא למהר את התהליך. אם העכבר נראה לחוץ (כלומר, מהוסס לברוח, קופץ מהידיים, הימנעות ממגע עם הידיים וכו ') על ידי להיות מרותק בתוך הידיים, להמשיך עם גלגול בין הידיים וחקירה חופשית במשך 20 s, ולאחר מכן לנסות שוב.
12. אבן דרך: בצע לפחות 1 מבחן מחסה מוצלח של 10 s להשלמת יום 1.
    1. שקול מבחן מחסה מוצלח כאשר העכבר נשאר בידיים. אם העכבר מוציא את ראשו וחוזר למקלט, הוא עדיין מבחן מוצלח. אם החיה יוצאת לחלוטין מהמקלט, זה כישלון.
13. אפשר חקירה חופשית בידיים במשך 30 s.
14. החלף בעדינות את העכבר בכלוב שלו. אם הקבוצה שוכנת, הנח את העכבר בכלוב הזמני עד שכל חברי הכלוב יטופלו. החזר את העכברים לכלוב המקורי שלהם על ידי הרמתם בכף היד. אין להשתמש באיסוף זנב.
15. נקה את הספסל העליון של צואה פוטנציאלית ושתן עם 70% אתנול.
16. יש לשטוף את הכפפות ביסודיות עם 70% אתנול (או תמיסת ניקוי מתאימה) או להחליף כפפות לפני הטיפול בעכבר הבא (ניתן לשמור את אותן כפפות עבור בני זוג בכלוב).
    הערה: מומלץ לבצע את הטיפול עם מספר סביר של בעלי חיים כדי למנוע עייפות מהמטפל. טיפול ב-24 עכברים אורך כ-2 שעות ומומלץ לא לחרוג מ-24 עכברים לכל מטפל. אם יש לטפל בבעלי חיים נוספים, מומלץ שיהיו להם מטפלים מרובים, או לפצל את הליכי הטיפול לקבוצות משנה, במשך מספר ימים.

3. יום 2: 3 עד 5 דקות לעכבר

1. נסה להרים את העכבר בכף היד. בשלב זה, זה צריך להיות כבר ריאלי ועכברים לא צריכים לקפוץ מהיד.
2. התחל עם כף יד פתוחה כמו ביום 1, ומאפשר לעכבר לחקור בחופשיות במשך 20s.
3. לאחר מכן, לגלגל את העכבר בין הידיים כמה פעמים (4-5 פעמים).
4. בצע את "מבחן מחסה" עבור 5 s.
5. חזור על מבחן המקלט מספר פעמים (~ 5-6) על פני תקופה של 2 עד 3 דקות.
6. במהלך אותה תקופה של 2 עד 3 דקות, לסירוגין עם רול בין הידיים וחקירה חופשית של ידיים פתוחות צעד מהיום 1 כדי לשפר את ההרגלה.
   1. גע בעכבר בראשו ובגבו(איור 1E),5-6 פעמים. סימן להרגלה הוא כאשר העכבר מאפשר לך לגעת בו מבלי לנסות לברוח.
   2. בצע "דחיפה באף": נסה לגעת חוטם של העכבר, 2 עד 3 פעמים (איור 1F).
      1. אם העכבר מנסה לנשוך או מראה סימנים ברורים של מתח על נגע, לא מיד לנסות את האף לתקוע שוב. במקום זאת, לסירוגין עם חקר יד שטוחה לגלגל. "הרגלה" משתקפת על ידי החיה לא בורחת או מפנה את ראשה במקרים של מגע אנושי.
7. בכל ההליכים המתוארים 3.4-3.6, לא למהר את התהליך. אם העכבר נראה לחוץ על ידי להיות מרותק בתוך הידיים או לא רוצה לגעת, להמשיך עם גלגול בין הידיים במשך 20-30 s ולאחר מכן לנסות שוב.
8. אבני דרך: בצע לפחות 1 דחיפה מוצלחת באף עבור 2-3 s להשלמת יום 2.
9. עצור מושב זה לאחר כ 3 דקות של טיפול אם החיה מגיבה היטב "מקלט", "ליטוף ראש", "דחיפה באף", ואם העכבר נראה מוכן לחקור את הידיים ללא סימני לחץ.
10. אם העכבר ממשיך להפגין סימני לחץ או אינו מגיב היטב לבדיקת "מבחן מחסה" או "דחיפה באף", המשך את הפגישה עד שתגיע ל -5 דקות כמו ביום 1.
11. החלף את העכבר בכלוב שלו, לנקות את הספסל העליון וכפפות כמו ביום 1.

4. יום 3: כ-3 דקות לעכבר

1. ביום השלישי, המשיכו באותם שלבים כמו ביום 2, למשך 2 עד 3 דקות.
   1. הרם את העכבר בכף היד.
   2. העברה וגלגל של העכבר בין הידיים
   3. בצע בדיקת מחסה.
   4. נסה ללטף את העכבר בגב ובראש.
2. לסירוגין בין שלבים אלה על פני כ 1 עד 2 דקות.
3. המשך את ההליך עד שהעכבר רגוע מספיק כדי לשבת בכף היד מבלי לנסות לברוח.
4. לפני סוף היום השלישי, חזור על בדיקת המקלט ובדיקת דחיפה באף כמבחן להרגלה.
   1. אם ניתן להשלים את שתי הבדיקות בניסיון הראשון שלהן, תהליך ההרגלה הושלם. המשך לטפל בעדינות בעכבר במשך 30 עד דקה.
   2. אם העכבר עמיד בתחילה בפני כל אחת מהבדיקות, חזור על שלבים 4.1-4.3 עבור 20-30 s לפני חיבור מחדש של חבטת האף ובדיקת מחסה.
   3. אם העכבר נשאר עמיד לבדיקות אלה לאחר 3 דקות, היום השלישי עשוי לחזור על עצמו.
5. אבני דרך: בצע לפחות 2 בדיקות מחסה מוצלחות של 10 s כל אחת, ו-2 בדיקות מוצלחות של דחיפה לאף להשלמת היום השלישי, והשלמת כל הליך הטיפול בתלת-ממד.
6. החזירו את העכבר לכלוב שלו, נקו את הספסל והכפפות.

5. גישה אופציונלית לבעלי חיים להיות נתון לאיפוק להזרקה או gavage

הערה: ביום 3, אם החיה תהיה מרוסנת למטרות ניסיוניות (gavage אוראלי, הזרקה תוך-צפקית, וכו '), העכברים יכולים להיות כפופים לבדיקת צביטת הצוואר.

1. תאפינו את העורף בין האגודל לאפרון(איור 1G).
2. הרם את העכבר 3-5 ס"מ מעל היד עבור 2-3 s.
   הערה: זוהי בדרך כלל עמדה לא טבעית לעכברים בוגרים, ואם העכברים נשארים ליד אי תנועה, הם רגילים היטב לטיפול ויהיה קל לרסן למטרות ניסיוניות.
3. הנח את העכבר בחזרה ביד השטוחה, או אם העכבר מגיב לצביטת הצוואר, שקול להניח אותו על שרוול הנסיין, מכסה הכלוב או משטח העבודה
   הערה: אם אתה עובד בארון בטיחות ביולוגית, אל תניח את העכבר על השרוול או שהוא יכול לעלות ולצאת מארון הבטיחות הביולוגית. מעדיף להניח את העכבר על השיש בתוך ארון הבטיחות הביולוגית.
4. השאירו את העכבר כדי לחקור בחופשיות את ידו של הנסיין במשך דקה אחת.

6. גישה אופציונלית לימים נוספים של טיפול

1. במקרה של קו עכבר לחוץ מאוד, להוסיף ימים נוספים כדי להקטין את התגובה ואת רמת הלחץ של בעלי החיים, באמצעות השיטות המתוארות ביום 2/3.
   הערה: גורמים רבים יכולים להשפיע על הלחץ הבסיסי של בעלי החיים כולל מתח, נוכחות של שינוי מהונדס, גיל, מין ותנאי דיור. אם גורמים אלה אינם עקביים בין קבוצות כגון בעלי חיים בגיל שנבדקו נגד פקדים צעירים או בעלי חיים מהונדסים הנבדקים נגד פקדי סוג בר, מומלץ כי אותו מספר של ימי מגורים משמשים עבור כל קבוצה.

7. טיפול במנהרות

הערה: טכניקה זו חלה רק על העכברים המטופלים במנהרה. המנהרות הן צינורות פוליקרבונט באורך של כ-13 ס"מ ובקוטר של 5 ס"מ.

1. הנח את המנהרה בכלוב של העכבר.
2. השאר את המנהרה בכלוב במשך 7 ימים לפני הטיפול.
3. פתחו את הכלוב והניחו את המכסה בצד.
4. להנחות בעדינות את העכבר לתוך מנהרת פוליקרבונט (כבר בכלוב).
5. הרם את המנהרה מהכלוב, אופקית. במידת הצורך לכסות באופן רופף את קצות המנהרה כדי למנוע את החיה לקפוץ / ליפול מהמנהרה, פוטנציאל נופל בחזרה בכלוב שלה או על הרצפה.
6. תזיז את החיה במנהרה הרחק מהכלוב הביתי ותרחיק אותה מכל משטח במשך 30 מעלות.
7. הנח את המנהרה בחזרה בכלוב הביתי, ומאפשר לעכבר לצאת מהצינור.
8. המתן 60 s ולאחר מכן חזור על שלבים 7.4-7.7 פעם אחת.
9. יש לשטוף את הכפפות ביסודיות עם 70% אתנול או להחליף כפפות לפני ההרגלה של העכבר הבא.
10. חזור על הליך זה במשך 10 ימים רצופים.

8. טיפול בזנב

הערה: טכניקה זו חלה רק על העכברים עם ידי זנב. הוא משמש להעברת עכברים מהכלוב שלהם למנגנון, ולהיפך.

1. פתחו את הכלוב והניחו את המכסה בצד.
2. תפוס את העכברים בבסיס הזנב בין האגודל לאבות.
3. תרים את העכבר מהכלוב.
4. ב 2-3 s, להעביר את העכבר לזרוע הנגדית של הנסיין תוך שמירה על אחיזה בזנב כדי למנוע את העכבר מתנדנד.
5. כאשר נדרש טיפול בזנב ביישום ניסוי זה (למשל, לפני בדיקת דם לבדיקות קורטיזול) בעלי חיים מועברים לאמה של הנסיין על ידי טיפול בזנב ומוחזקים במשך 15 s לפני שהם מוחזרים לכלוב שלהם.

9. מבוך מוגבה פלוס

1. הגדרת חדר
   1. הניחו את המבוך באמצע החדר, תחת מצלמה דיגיטלית המצוידת בכרטיס זיכרון.
   2. הגדר את אור החדר ב ~ 60 Lux באמצעות 2 מנורות עומדות להציב מאחורי המבוך.
   3. כבה כל תאורה תקורה כדי למנוע אור ישיר על המבוך שיוצר השתקפות ומשבש את זיהוי בעלי החיים במבוך.
   4. לאחר כל הציוד מוגדר, להעביר את החיות לחדר ולתת להם להתאקלם להגדרות האור והסביבה החדשה במשך 30 דקות.
2. בדיקות
   1. נקה את המבוך עם 70% אתנול כדי למנוע ריחות מאבק או מן החיה שנבדקה בעבר.
   2. תפעיל את המצלמה.
   3. השתמש בחתיכת נייר עם מזהה החיה כדי להקליט את תעודת הזהות בסרטון, לפני הצבת החיה במבוך (זה יאפשר את הזיהוי הנכון של איזה עכבר מצולם בכל סרטון).
   4. השתמש בטכניקת הטיפול המתאימה לכל בעל חיים כדי להעביר אותו למבוך.
   5. הנח את העכבר על הרציף המרכזי, מול זרוע פתוחה.
   6. אפשר לעכבר לחקור את המנגנון במשך 10 דקות, ללא הפרעה.
   7. אחרי 10 דקות, לעצור את המצלמה.
   8. לאחזר את העכבר מהמבוך ולהחזיר אותו לכלוב שלה.
   9. צואה נקייה ושתן מהמבוך עם 70% אתנול.
   10. לאחר השלמת הבדיקה עם כל העכברים, העבר קטעי וידאו מכרטיס הזיכרון למחשב למעקב אחר וידאו.
   11. באמצעות תוכנת מעקב אוטומטית אחר בעלי חיים, עקוב אחר מספר הכניסות לזרועות הפתוחות והסגורות, ואת הזמן שהוקדש בזרועות פתוחות או סגורות (כאן Ethovision XT 14).

10. אינטראקציית נסיון (נגזר הרסט ומערב⁹)

1. הגדרת חדר
   1. הנח שולחן באמצע חדר הבדיקות תחת מצלמה דיגיטלית המצוידת בכרטיס זיכרון.
   2. הגדירו את האור ב-50-70 Lux עם 4 נורות שהונחו בפינת החדר הפונה עד התקרה. כבה תאורה תקורה כדי למנוע אור ישיר על המבוך שיוצר השתקפות ולשבש את זיהוי בעלי החיים בזירה.
   3. תביאו את החיות לחדר.
   4. תן להם להתאקלם בחדר במשך 30 דקות.
2. ניסוי
   1. הנח את כלוב הבית מתחת למצלמה הדיגיטלית.
   2. הסר את המכסה.
   3. הסר חומר קינון והעשרה אחרת שעלולה להפריע למעקב אחר בעלי חיים.
   4. תפעיל את המצלמה.
   5. השתמש בכרטיס הכלוב עם תעודת הזהות של החיה כדי לזהות את החיה בסרטון.
   6. מניחים יד בכלוב הביתי לאורך קיר הכלוב בצד ימין הקדמי.
      1. ודא שראש המטפל אינו חוסם את המצלמה כדי לצלם את העכבר.
   7. התחל שעון שעון.
   8. שמור את היד ללא תנועה במשך 2 דקות, ולתת לעכבר לחקור את היד.
   9. הסר את היד מהכלוב במשך 15s.
   10. נסה להרים את העכבר באמצעות ידיים מכוסות ולתעד אם העכבר בורח.
   11. חזור על הצעד האחרון עד חמש פעמים, כל 5 שניות, או עד שהעכבר מרשה לעצמו להיות הרים.
   12. הקלט את מספר הניסיונות הדרושים כדי להרים את העכבר.
   13. מחזירים חומר קינון והעשרה לכלוב.
   14. יש לנקות כפפות עם 70% אתנול או להחליף כפפות לפני שתמשיך לחיה הבאה.
   15. לאחר הבדיקה, העבר סרטוני וידאו מכרטיס הזיכרון למחשב.
   16. באמצעות תוכנת מעקב וידאו אוטומטית, לחלק את הכלוב לארבעה רבעים שווים ולתעד את הזמן בילה על ידי העכבר בכל רבע (כאן, Ethovision XT 14).

11. האכלה מודחקת חידוש

1. מחסור במזון
   1. 3 ימים לפני הבדיקה, לבצע שינוי כלוב מלא, ובית יחיד בעלי החיים (דיור יחיד עדיף לבצע את בדיקות כלוב הבית).
      הערה: מתן מצעים טריים מסיר אבק פוטנציאלי או חתיכות קטנות של מזון המצטבר במצעים מאז שינוי הכלוב האחרון.
   2. יום לפני הבדיקות, לשקול את כל בעלי החיים סביב 18:00.
   3. הסר את כל המזון מן הופר מזון, ולוודא כי אין חתיכות של מזון בכלוב או במצעים.
2. הגדרת חדר
   1. הנח את תא NSF על שולחן.
   2. מלאו את התא בשכבה דקה של מצעים תירס (או מצעים אחרים השונים ממצעים המשמשים בכלוב הביתי של בעלי החיים).
   3. הגדר את האור ב 70 Lux עם 4 נורות להציב בפינת השולחן שבו התא עומד, פונה עד התקרה. כבה את האורות התקורה כדי לשמור על תאורת חדר נמוכה.
   4. מניחים גלולה אחת של צ'או סטנדרטי המשמש במתקן, בצד התא מול הנסיין (≈10 ס"מ מהקיר).
3. בדיקות
   1. בבוקר לאחר מחסור במזון, הביאו את בעלי החיים לחדר 30 דקות לפני הבדיקות כדי לאפשר להם להתאקלם להגדרות האור ולסביבה החדשה.
   2. שקול את כל בעלי החיים על מנת למדוד את הירידה במשקל שלהם בהתבסס על המשקל שנמדד יום קודם לכן. בעלי חיים צריכים לאבד 8-12% בן לילה כדי להיות מסוגל לבצע את המשימה כראוי.
   3. מיין את בעלי החיים לירידה במשקל, ומסך אותם החל מהעכבר שאיבד הכי הרבה לעכבר שאיבד את המשקל הנמוך ביותר.
   4. ודא כי התא מלא מצעים עם גלולה אחת.
   5. מניחים את החיה בצד השני של החדר, הרחק מכדור המזון.
   6. הפעל את שעון התזמן באופן מיידי.
   7. תן לעכבר לחקור את התא עד 12 דקות.
   8. למדוד את ההשהיה להתקרב להאכיל (בעלי חיים חייב לנשוך ולאכול) על גלולה המזון.
      1. קח את זה להיות גישה כאשר החיה מתקרבת לכדור, מריח אותו ולא לנשוך.
      2. הגדר נשיכה כמו כאשר החיה מתחילה לצרוך את הכדור.
   9. הקלט את ההשהיה כדי להתקרב ולהאכיל את הכדור בשניות.
   10. לאחר שהעכבר ניזון מכדור המזון, הסר את העכבר מהתא.
   11. להשליך את המצעים אבל לשמור את הכדור שישמש לבדיקת כונן תיאבון בכלוב הבית העכבר.
   12. אפס את התא עבור החיה הבאה ולהמשיך עם החיה הבאה.
   13. 15 דקות לאחר השלמת הבדיקה בחדר, זרוק את הכדור המשמש במהלך הבדיקה, בתוך הכלוב הביתי של העכבר, על הקיר בחלק הקדמי של הכלוב.
   14. למדוד את ההשהיה כדי להאכיל על הכדור כאשר הכדור הוא בכלוב הבית. זהו מדד לכונן תיאבון.
       1. עדיף להסיר את חומר הקינון כדי להבטיח שהעכבר יראה את הכדור נופל בכלוב שלו.

12. איסוף סרום ומדידת קורטיקוסטרון

1. לטפל בבעלי חיים במשך 1 דקות באמצעות הטכניקה שהוקצתה, 15 דקות לפני איסוף הדם (זה יכול להיעשות עם קבוצה שוכנים או בעלי חיים בודדים, תוך התחשבות בסיכון לקרבות בעת ארגון מחדש של עכברים).
   1. עבור עכברים מטופלים במנהרה, להנחות אותם למנהרה, להרים את המנהרה מהכלוב במשך 1 דקות, ולהחליף את העכבר בכלוב שלה.
   2. לעכברים עם זנב, תפוס את בסיס הזנב של העכבר והסר את העכבר מהכלוב שלו. העבר את העכבר לשרוול הנסיינים למשך דקה אחת, והחזר את העכבר לכלוב שלו על ידי טיפול בזנב.
   3. עבור עכברים עם ידית תלת-ממדית, השתמש בידיים מכוסות כדי להסיר את העכבר מהכלוב שלו. החזק את העכבר בידיים מכוסות במשך 1 דקות, ולהחזיר אותו לכלוב שלה.
2. 15 דקות לאחר הטיפול, להמשיך עם איסוף דם מן הווריד submandibular²².
3. קשקוש בחוזקה את העכבר כך שראש העכבר משותק היטב.
4. אתר את אתר הניקור.
   1. יש גומה קטנה ללא שיער לאורך הלסת של הפנים שיכול לשמש כציון דרך כדי לאתר את אתר הדקירה. ציור קו בין בסיס הלסת לבין גומה זו אתר הדקירה נמצא מאחורי גומה זו לכיוון האוזן על ידי בערך 5 מ"מ, ממש מאחורי הציר של הלסת.
5. החזק מחט 23 G נקי בניצב לאתר הדקירה והשתמש בתנועת פנסים מהירה. קצה המחט צריך לחדור לעומק בין 1-2 מ"מ, הדם יזרום מיד ברגע הווריד מנוקב.
6. לאסוף ~ 150 μL של דם בצינורות איסוף מצופה EDTA ולאחסן על קרח.
7. החל לחץ קל עם כרית גזה סטרילית לאתר הדקירה עבור 5 s או יותר כדי לאפשר את הדם לקריש.
8. לאחר שהדם נקרש, החזירו את העכבר לכלוב הביתי שלו.
9. דם צנטריפוגות ב 4 °C 3,500 x g במשך 10 דקות.
10. דקאנט סופר-טבעי.
11. אחסן את supernatant ב -20 °C (50 °F) עבור ניתוחים במורד הזרם.
12. מדוד את רמות הקורטיקוסטרון באמצעות ערכת ELISA קורטיקוסטרון בהתאם לפרוטוקול היצרן.
13. השתמש בספקטרופוטומטר כדי לקרוא את תוצאות ELISA.

תוצאות

שני מחקרים נפרדים בוצעו עם עכברי C57BL/6. המחקר #1 כלל זכרים בני 6 חודשים ומחקר #2 כללו נקבות בנות חודשיים וחצי (N= 36/מחקר) ממעבדות ג'קסון (Cat #000664). עכברים הגיעו למתקן בגיל חודשיים. בעוד מחקר #2 נקבות טופלו ונבדקו שבועיים לאחר ההגעה, מחקר #1 זכרים טופלו ונבדקו רק בגיל 6 חודשים (עיכוב עקב השבתת המגפה העול...

Discussion

מחקר זה ופיתוח השיטה מבוססים על התצפית כי טיפול בטכניקות בעכברים עדיין מתעלמים על ידי הקהילה המדעית, וכי מעבדות מסוימות עדיין מסרבות ליישם הרגלה או טיפול בטכניקות כדי להפחית את הלחץ והתגובה של בעלי החיים שלהם לפני ניסויים. בעוד המייצג מחויבות זמן, טיפול בבעלי חיים מספק השפעות מועילות לבע?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
23 G x 1 in. BD PrecisionGlide general use sterile hypodermic needle. Regular wall type and regular bevel.	BD	2546-CABD305145	Needles for Blood collection
BD Vacutainer® Venous Blood Collection EDTA Tubes with Lavender BD Hemogard™ closure, 2.0ml (13x75mm), 100/pk	BD	367841	EDTA Coated tubes for blood collection
Bed’o cobs ¼” Corn cob laboratory animal bedding	Bed-O-Cobs	BEDO1/4	Novel bedding for novelty suppressed feeding
Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5424 R	For centrifugation of blood.
Corticosterone ELISA Kit	Arbor Assays	K003-H1W
Digital Camera	Panasonic	HC-V770	Camera to record EPM/Experimenter interactions
Elevated Plus Maze	Home Made	n/a	Custom Maze made of four black Plexiglas arms (two open arms (29cm long by 7 cm wide) and two enclosed arms (29 cm long x7 cm wide with 16 cm tall walls)) that form a cross shape with the two open arms opposite to each other held 55 cm above the floor
Ethanol	Medstore House Brand	39753-P016-EA95	Dilute to 70% with Distilled water, for cleaning
Ethovision XT 15	Noldus	n/a	Automated animal tracking software
Laboratory Rodent Diet	LabDiet	Rodent Diet 5001	Standard Rodent diet
Memory Card	Kingstone Technology	SDA3/64GB	For video recording and file transfer
Novelty Suppressed Feeding Chamber	Home Made	n/a	Custom test plexiglass test chamber with clear floors and walls 62cm long, by 31cm wide by 40cm tall .
Parlycarbonate tubes	Home Made	n/a	13 cm in length and 5cm in diameter
Purina Yesterday’s news recycled newspaper bedding	Purina	n/a	Standard Bedding
Spectrophotometer	Biotek	Epoch Microplate Reader