Técnicas de manuseio para reduzir o estresse em camundongos

Resumo

Este artigo descreve uma técnica de manuseio em camundongos, a técnica de manuseio 3D, que facilita o manuseio rotineiro reduzindo comportamentos semelhantes à ansiedade e apresenta detalhes sobre duas técnicas relacionadas existentes (manuseio de túneis e caudas).

Resumo

Animais de laboratório são submetidos a múltiplas manipulações por cientistas ou prestadores de cuidados com animais. O estresse que isso causa pode ter efeitos profundos no bem-estar animal e também pode ser um fator de confusão para variáveis experimentais, como medidas de ansiedade. Ao longo dos anos, técnicas de manuseio que minimizam o estresse relacionado ao manuseio foram desenvolvidas com um foco especial em ratos, e pouca atenção aos ratos. No entanto, foi demonstrado que os ratos podem ser habituados a manipulações usando técnicas de manuseio. Habituar camundongos ao manuseio reduz o estresse, facilita o manuseio de rotina, melhora o bem-estar animal, diminui a variabilidade dos dados e melhora a confiabilidade experimental. Apesar dos efeitos benéficos do manuseio, a abordagem de captação de cauda, que é particularmente estressante, ainda é amplamente utilizada. Este artigo fornece uma descrição detalhada e demonstração de uma técnica recém-desenvolvida de manuseio de camundongos destinada a minimizar o estresse experimentado pelo animal durante a interação humana. Esta técnica manual é realizada ao longo de 3 dias (técnica de manuseio 3D) e foca na capacidade do animal de habituar ao experimentador. Este estudo também mostra o efeito das técnicas previamente estabelecidas de manuseio de túneis (usando um túnel de policarbonato) e da técnica de captação de cauda. Especificamente estudados são seus efeitos sobre comportamentos semelhantes à ansiedade, usando testes comportamentais (Elevated-Plus Maze e Novelty Suppressed Feeding), interação voluntária com experimentadores e medição fisiológica (níveis de corticosterona). A técnica de manuseio 3D e a técnica de manuseio do túnel reduziram fenótipos semelhantes à ansiedade. No primeiro experimento, usando camundongos machos de 6 meses de idade, a técnica de manuseio 3D melhorou significativamente a interação dos experimentadores. No segundo experimento, usando fêmea de 2,5 meses, reduziu os níveis de corticosterona. Como tal, o manuseio 3D é uma abordagem útil em cenários onde a interação com o experimentador é necessária ou preferida, ou onde o manuseio do túnel pode não ser possível durante o experimento.

Introdução

Camundongos e ratos são ativos essenciais para estudos pré-clínicos^1,2 para múltiplos fins, incluindo estudos endocrinas, fisiológicos, farmacológicos ou comportamentais². A partir do crescente número de estudos envolvendo animais, surgiu que variáveis ambientais descontroladas, incluindo a interação humana, influenciam vários desfechos em pesquisas biomédicas^3,4,5. Isso é responsável pela variabilidade significativa observada em experimentos e laboratórios de pesquisa^4,5, representando uma grande ressalva na pesquisa animal.

Várias abordagens foram implementadas com o objetivo de limitar o impacto dos estressores ambientais e reduzir a reatividade à interação humana. Por exemplo, para limitar o impacto dos estressores ambientais, a padronização das condições de habitação e os sistemas de habitação automatizados^6,7 foram implementados em laboratórios. Quanto à interação com os seres humanos, abordagens comumente utilizadas para o manuseio e transporte de animais tinham pouca consideração pelo desconforto e estresse animal. Por exemplo, pegar animais pela cauda ou usar fórceps⁸ aumenta a ansiedade da linha de base^9,10,11, reduz a exploração^9,12 e contribui muito para a variabilidade inter-individual dentro e entre os estudos^13,14. Como resultado, outras abordagens foram desenvolvidas, como a técnica de manuseio de copos, que é aplicável a ratos e ratos. Nesta abordagem, os animais são "acotosados" para fora de sua gaiola, e mantidos pelos experimentadores com as mãos formando um copo^9,10,11. Outra alternativa útil ao manuseio da cauda envolve o uso de um túnel de policarbonato para transferir camundongos^9,10,15. Esta abordagem elimina a interação direta entre o mouse e o experimentador. Tanto as abordagens do copo quanto do túnel mostraram eficácia na redução de comportamentos semelhantes à ansiedade e medo do experimentador que pode ser exagerado por técnicas de manuseio aversivo, como o manuseio da cauda^9,10.

Portanto, o aumento das evidências demonstra a utilidade do manejo adequado do camundongo para reduzir a variabilidade entre os indivíduos^9,11e melhorar o bem-estar animal¹⁰. No entanto, as técnicas mencionadas acima ainda enfrentam limitações. A técnica de manuseio do copo foi implementada com horários que variam de 10 dias (10 sessões ao longo de 2 semanas¹⁶) até 15 semanas¹⁷, o que é uma quantidade considerável de tempo para funcionários e experimentadores de instalações. Além disso, a eficácia do manuseio do copo varia de acordo com a tensão⁹ e o manuseio convencional do copo em mãos abertas pode levar a ratos ingênuos ou particularmente cepas saltitantes para saltar da mão^9,18. O manuseio do túnel resulta em resultados mais consistentes e geralmente mais rápidos na gentling¹⁹. Túneis também são usados como enriquecimento de gaiolas domésticas. Eles ajudam os animais a se habituarem a manusear rapidamente e fornecem os benefícios adicionais do enriquecimento. O manuseio do túnel, no entanto, tem limitações na transferência de animais entre aparelhos. Curiosamente, Hurst e West⁹, e Henderson et al.²⁰ demonstraram que o uso de manuseio manual suave e breve para transferir animais do túnel para o aparelho não afeta seu fenótipo.

Para fornecer uma alternativa aos métodos existentes, com habitação alcançável em um curto período de tempo, este artigo descreve uma nova técnica que se expande na técnica de manuseio do copo, não necessitando, portanto, de nenhum equipamento específico. Esta abordagem usa marcos para medir o nível de conforto que os ratos têm com o processo de manuseio. Mostra eficácia na diminuição da reatividade e estresse do camundongo (nos níveis comportamental e hormonal), facilita o manuseio rotineiro e contribui para reduzir a variabilidade entre os animais. Detalhes dessa técnica são fornecidos aqui, e sua eficácia na redução de comportamentos semelhantes à ansiedade, melhorando a interação com experimentadores e limitando a liberação periférica de hormônio do estresse (corticosterona) são demonstradas em dois estudos separados (camundongos masculinos e femininos), em comparação com técnicas de manuseio de túneis (controle positivo) e controle de cauda (controle negativo).

Protocolo

Os procedimentos envolvendo os animais foram aprovados pelo comitê de cuidados com animais do CAMH e realizados em conformidade com as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados com Animais.

NOTA: O método de manuseio aqui descrito pode ser usado em várias cepas de camundongos, incluindo linhas não transgênicas (C57/BL6, BalbC, CD1, SV129, etc.) e linhas transgênicas. Também pode ser usado com camundongos jovens ou velhos, observando que camundongos adultos jovens (4-6 semanas de idade) tendem a ser um pouco mais ativos do que ratos adultos ou velhos, especialmente no primeiro dia.

1. Preparação experimental

1. Antes do início do estudo, de acordo com as diretrizes do ARRIVE^21,atribua aleatoriamente ratos a cada grupo de manuseio (manuseio 3D, manuseio de túneis ou manuseio de cauda).
2. Identifique a sala para realizar o manuseio. Pode ser realizado na sala de alojamento, ou em uma sala separada. Se o manuseio for realizado em uma sala separada, o que exige que os animais sejam movidos em uma carroça em movimento, permita que os animais se habituam à nova sala por 20-30 minutos antes do início do protocolo de manuseio.
3. Para animais abrigados em grupo, use uma gaiola temporária para abrigar ratos após o manuseio, antes de reagrupar todos eles em sua gaiola inicial. Isso reduz possíveis brigas entre animais antes do manuseio (particularmente em machos).
4. Trabalhe em um balcão (preferencialmente uma bancada limpa) ou em um armário de biossegurança, com a gaiola de habitação longe do animal sendo manuseado. A proximidade com a gaiola de habitação aumenta o risco de pular. Se os animais são alojados em grupo, o salto do rato sendo manuseado na gaiola doméstica pode causar estresse aos companheiros de gaiola.
   NOTA: Trabalhar em um armário de biossegurança limita o risco de ratos saltarem no chão, e pode ser necessário em certas instalações. Esta técnica pode ser usada em um armário de biossegurança, certificando-se de sempre executar todos os passos dentro do armário de biossegurança, e evitando ratos andando em antebraços manipuladores.

2. DIA 1: 5 min por mouse

1. Abra suavemente a gaiola e coloque a tampa ao lado, remova materiais de aninhamento e outros enriquecimentos, como rodas de corrida ou abrigos.
2. Introduza uma mão aberta enluvada na gaiola de casa, colocando lentamente a mão ao longo de um lado da parede da gaiola (a parede mais próxima do manipulador, Figura 1A).
   1. Não tente imediatamente pegar o mouse.
3. Mantenha-se imóvel e deixe o animal habituar-se à presença da mão na gaiola por cerca de 30 s.
4. Tente pegar o rato na palma da mão (ou seja, evite pegar o animal pela cauda).
   1. Se o mouse não for facilmente captado após 3 tentativas, guie o mouse para um canto e copo com ambas as mãos.
   2. Mova suavemente as mãos em direção ao mouse para tentar pegá-lo.
   3. Se não tiver sucesso após um máximo de 3 tentativas com ambas as mãos, pegue o mouse suavemente pela base de sua cauda, e transfira-o para o antebraço ou mão plana.
5. Com o mouse na mão, mantenha a mão o mais plana e aberta possível.
   NOTA: Isso fornece uma plataforma plana para o mouse pisar e limita o risco de mordidas.
6. Segurando a mão aberta e plana com a palma da mão para cima, coloque a outra mão adjacente à mão segurando o mouse e deixe o mouse se mover livremente de mão em mão sem qualquer restrição(Figura 1B).
7. Deixe o mouse explorar e mover-se entre as mãos por 1 minuto.
   1. Neste ponto, os ratos podem tentar pular. Posicione as mãos de tal forma que se o mouse pular, ele vai pousar em uma bancada em vez do chão.
   2. Se um rato parece estar se preparando para saltar (movendo-se em direção à borda da mão e criando em pernas traseiras), lentamente coloque a outra mão na frente dele e tente guiá-lo para caminhar sobre esta mão. Evite movimentos bruscos à medida que aumenta o risco de pular.
   3. Se um mouse pular, tente pegá-lo evitando o manuseio da cauda e retome a sessão de manuseio. Se o mouse ficar no chão ou fora das mãos por mais de 10 s, adicione mais tempo à sessão de manuseio para compensar qualquer momento que o mouse estivesse fora das mãos.
   4. Tome notas do salto. O número total de saltos pode ser usado para avaliar a variabilidade potencial entre os animais.
8. Após 1 min de manuseio com as mãos planas, relaxe a palma da mão e levemente copo o mouse na mão, antes de rolar suavemente o mouse entre as mãos(Figura 1C).
   1. Para "rolar", posicione o rato na palma da mão, em uma mão plana, perpendicular aos dedos.
   2. Feche lentamente a mão, colocando os dedos na parte de trás do mouse.
   3. Coloque a mão livre diretamente sob a mão segurando o mouse.
   4. Gire/gire lentamente a mão com o mouse para transferir suavemente o mouse para a outra mão (180° flip).
   5. Repita isso para frente e para trás entre as mãos.
9. Alternar de rolamento suave entre as mãos e exploração livre em mãos abertas para os anos 60, alternando entre técnicas a cada 20 s.
10. Realizar um "teste de abrigo"(Figura 1D).
    1. Deixe o mouse mover-se para a borda da mão e, em seguida, juntar as 2 mãos.
    2. Muito lentamente, dou-os para que o rato se encaixe dentro de um "abrigo" formado pelas mãos. Deixe uma abertura para que o rato possa escapar se necessário.
    3. Procure manter o rato no abrigo por 5-10 s, sem qualquer restrição.
    4. Alternar entre o teste do abrigo, rolar entre as mãos e a exploração livre de mãos abertas por outros 60 anos, com certeza realizará o passo do abrigo 3 ou mais vezes.
11. Em todos os procedimentos descritos em 2.10, não apresse o processo. Se o mouse aparecer estressado (ou seja, tentar escapar, pular das mãos, evitar contato com as mãos etc.) por estar confinado dentro das mãos, continuar rolando entre as mãos e exploração livre por 20 s, e depois tentar novamente.
12. Marco: Realize pelo menos 1 teste de abrigo bem sucedido de 10 s para conclusão do dia 1.
    1. Considere um teste de abrigo bem sucedido quando o rato ficar nas mãos. Se o rato estourar a cabeça e voltar para o abrigo, ainda é um teste bem sucedido. Se o animal sair totalmente do abrigo, é um fracasso.
13. Permitir a exploração gratuita em mãos por 30 s.
14. Substitua suavemente o mouse em sua gaiola. Se o grupo estiver alojado, coloque o rato na gaiola temporária até que todos os companheiros de gaiola sejam manipulados. Devolva os ratos para sua gaiola original pegando-os na palma da mão. Não use uma pega-pega de cauda.
15. Limpe o banco de fezes potenciais e urina com 70% de etanol.
16. Enxágüe bem as luvas com 70% de etanol (ou solução de limpeza apropriada) ou troque as luvas antes de manusear o próximo mouse (é possível manter as mesmas luvas para os companheiros de gaiola).
    NOTA: Recomenda-se realizar o manuseio com um número razoável de animais para evitar a fadiga do manipulador. O manuseio de 24 ratos leva cerca de 2h e recomenda-se não exceder 24 ratos por manipulador. Se mais animais precisarem ser manuseados, recomenda-se ter vários manipuladores ou dividir os procedimentos de manuseio em subgrupos, ao longo de vários dias.

3. DIA 2: 3 a 5 min por mouse

1. Tente pegar o rato na palma da mão. Nesta fase, já deve ser viável e os ratos não devem pular da mão.
2. Comece com a palma da mão aberta como no dia 1, permitindo que o mouse explore livremente por 20 s.
3. Em seguida, role o mouse entre as mãos algumas vezes (4-5 vezes).
4. Realize o "teste de abrigo" para 5 s.
5. Repita o teste de abrigo várias vezes (~5-6) durante um período de 2 a 3 minutos.
6. Durante o mesmo período de 2 a 3 minutos, alternar com o rolo entre as mãos e a exploração livre das mãos abertas passo a partir do primeiro dia para melhorar a habitação.
   1. Toque o mouse na cabeça e atrás(Figura 1E), 5-6 vezes. Um sinal de habitação é quando o rato permite que você toque nele sem tentar escapar.
   2. Faça um "cutuces do nariz": Tente tocar o focinho do mouse, 2 a 3 vezes(Figura 1F).
      1. Se o rato tentar morder ou mostrar sinais óbvios de estresse ao ser tocado, não tente imediatamente o nariz cutucar novamente. Em vez disso, alternar com exploração de mão plana e rolar. "Habituação" é refletida pelo animal não fugir ou virar a cabeça em casos de contato humano.
7. Em todos os procedimentos descritos em 3.4-3.6, não apresse o processo. Se o mouse aparecer estressado por estar confinado dentro das mãos ou não quiser ser tocado, continue rolando entre as mãos por 20-30 s e depois tente novamente.
8. Marcos: Realize pelo menos 1 poke de nariz bem sucedido para 2-3 s para a conclusão do dia 2.
9. Pare esta sessão após cerca de 3 minutos de manuseio se o animal reagir bem ao "abrigo", "acariciar a cabeça", "cutucar o nariz", e se o rato parece estar disposto a explorar as mãos sem sinais de estresse.
10. Se o mouse continuar a exibir sinais de estresse ou não estiver reagindo bem ao teste de "teste de abrigo" ou "cutucador de nariz", continue a sessão até chegar a 5 minutos como no dia 1.
11. Substitua o mouse em sua gaiola, limpe a parte superior do banco e as luvas como no dia 1.

4. DIA 3: Cerca de 3 minutos por mouse

1. No terceiro dia, siga pelos mesmos passos do dia 2, por 2 a 3 min.
   1. Pegue o rato na palma da mão.
   2. Transfira e role o mouse entre as mãos
   3. Faça um teste de abrigo.
   4. Tente acariciar o rato nas costas e na cabeça.
2. Alternar entre essas etapas ao longo de aproximadamente 1 a 2 min.
3. Continue o procedimento até que o rato esteja relaxado o suficiente para sentar na palma da mão sem tentar escapar.
4. Antes do final do dia 3, repita o teste de abrigo e o teste de cutucada do nariz como um teste de habitação.
   1. Se ambos os testes puderem ser concluídos em sua primeira tentativa, o processo de habitação estará completo. Continue manuseando suavemente o mouse por 30 s a um minuto.
   2. Se o mouse for inicialmente resistente a qualquer teste, repita as etapas 4.1-4.3 para 20-30 s antes de repetir o poke do nariz e o teste de abrigo.
   3. Se o rato permanecer resistente a esses testes após 3 minutos, o terceiro dia pode ser repetido.
5. Marcos: Realize pelo menos 2 testes de abrigo bem sucedidos de 10 s cada, e 2 testes bem sucedidos de cutucada no nariz para conclusão do dia 3, e conclusão de todo o procedimento de manuseio 3D.
6. Devolva o rato para sua gaiola, limpe a parte superior do banco e as luvas.

5. Abordagem opcional para que os animais sejam submetidos a contenção para injeção ou gavage

NOTA: No dia 3, se o animal será contido para fins experimentais (gavage oral, injeção intra-peritoneal, etc.), os camundongos podem ser submetidos ao teste de beliscão do pescoço.

1. Segure a nuca entre o polegar e o dedo indicador(Figura 1G).
2. Levante o mouse 3-5 cm acima da mão para 2-3 s.
   NOTA: Esta é normalmente uma posição não natural para ratos adultos, e se os ratos permanecem perto de imóveis, eles estão bem habituados ao manuseio e serão fáceis de conter para fins experimentais.
3. Coloque o mouse de volta na mão plana, ou se o mouse estiver reativo ao aperto do pescoço, considere colocá-lo na manga do experimentador, tampa da gaiola ou bancada
   NOTA: Se trabalhar em um armário de biossegurança, não coloque o mouse na manga ou ele pode subir e sair do armário de biossegurança. Prefira colocar o mouse na bancada dentro do armário de biossegurança.
4. Deixe o mouse explorar livremente a mão do experimentador por 1 min.

6. Abordagem opcional para dias adicionais de manuseio

1. Na eventualidade de uma linha de camundongos altamente estressada, adicione dias adicionais para diminuir a reatividade e o nível de estresse dos animais, utilizando os métodos descritos no dia 2/3.
   NOTA: Muitos fatores podem afetar o estresse básico dos animais, incluindo tensão, presença de modificação transgênica, idade, sexo e condições de moradia. Se esses fatores não forem consistentes entre grupos como animais idosos sendo testados contra controles jovens ou animais transgênicos sendo testados contra controles do tipo selvagem, recomenda-se que o mesmo número de dias de habituação seja utilizado para cada grupo.

7. Manuseio de túneis

NOTA: Esta técnica é aplicável apenas aos ratos manuseados pelo Túnel. Os túneis são tubos de policarbonato de aproximadamente 13 cm de comprimento e 5 cm de diâmetro.

1. Coloque o túnel na gaiola do rato.
2. Deixe o túnel na gaiola por 7 dias antes do manuseio.
3. Abra a gaiola e coloque a tampa ao lado.
4. Guie suavemente o mouse para dentro do túnel de policarbonato (já na gaiola).
5. Levante o túnel da gaiola, horizontalmente. Se necessário, cubra livremente as extremidades do túnel para evitar que o animal pule/caia do túnel, potencialmente caindo de volta em sua gaiola ou no chão.
6. Mova o animal no túnel para longe da gaiola e segure-o longe de qualquer superfície por 30 s.
7. Coloque o túnel de volta na gaiola de casa, permitindo que o rato saia do tubo.
8. Aguarde 60 s e repita as etapas 7.4-7.7 uma vez.
9. Enxágüe bem as luvas com 70% de etanol ou troque as luvas antes de habituar o próximo mouse.
10. Repita este procedimento por 10 dias consecutivos.

8. Manuseio de cauda

NOTA: Esta técnica é aplicável apenas aos camundongos manuseados por cauda. É usado para transferir ratos de sua gaiola para um aparelho, e vice-versa.

1. Abra a gaiola e coloque a tampa ao lado.
2. Segure os ratos pela base da cauda entre o polegar e o dedo indicador.
3. Levante o rato da gaiola.
4. Em 2-3 s, transfira o mouse para o antebraço oposto do experimentador, mantendo um aperto na cauda para evitar que o mouse pende.
5. Quando o manuseio da cauda é necessário na implementação deste experimento (por exemplo, antes de coleta de sangue para testes de cortisol) os animais são transferidos para o antebraço do experimentador por manuseio de cauda e mantidos por 15 s antes de serem devolvidos à gaiola.

9. Labirinto de Mais Elevado

1. Configuração do quarto
   1. Coloque o labirinto no meio da sala, sob uma câmera digital equipada com um cartão de memória.
   2. Coloque a luz da sala em ~60 Lux usando 2 lâmpadas em pé colocadas atrás do labirinto.
   3. Desligue qualquer iluminação aérea para evitar a luz direta no labirinto que cria reflexão e interrompe a detecção dos animais no labirinto.
   4. Uma vez que todo o equipamento é configurado, transfira os animais para a sala e deixe-os aclimatar-se às configurações de luz e ao novo ambiente por 30 minutos.
2. Teste
   1. Limpe o labirinto com 70% de etanol para evitar cheiros de poeira ou do animal que foi testado anteriormente.
   2. Ligue a câmera.
   3. Use um pedaço de papel com o ID animal para gravar o ID no vídeo, antes de colocar o animal no labirinto (isso facilitará a identificação adequada de qual rato está sendo filmado em cada vídeo).
   4. Use a técnica de manuseio adequada para cada animal para transferi-lo para o labirinto.
   5. Coloque o mouse na plataforma central, de frente para um braço aberto.
   6. Deixe o mouse explorar o aparelho por 10 minutos, sem ser perturbado.
   7. Depois de 10 minutos, pare a câmera.
   8. Recupere o rato do labirinto e coloque-o de volta em sua gaiola.
   9. Limpe fezes e urina do labirinto com 70% de etanol.
   10. Uma vez que o teste esteja completo com todos os ratos, transfira vídeos do cartão de memória para um computador para rastreamento de vídeo.
   11. Usando um software automatizado de rastreamento animal, rastreie o número de entradas para os braços abertos e fechados, e o tempo gasto em braços abertos ou fechados (aqui Ethovision XT 14).

10. Interação experimentador (derivada de Hurst e West⁹)

1. Configuração do quarto
   1. Coloque uma mesa no meio da sala de testes sob uma câmera digital equipada com um cartão de memória.
   2. Coloque a luz em 50-70 Lux com 4 lâmpadas colocadas no canto da sala voltadas para o teto. Desligue a iluminação aérea para evitar a luz direta no labirinto que cria reflexão e interrompe a detecção dos animais na arena.
   3. Leve os animais para o quarto.
   4. Deixe-os aclimatar para o quarto por 30 minutos.
2. Experimentar
   1. Coloque a gaiola em casa sob a câmera digital.
   2. Retire a tampa.
   3. Remova o material de aninhamento e outros enriquecimentos que possam interferir no rastreamento dos animais.
   4. Ligue a câmera.
   5. Use o cartão da gaiola com a identificação do animal para identificar o animal no vídeo.
   6. Coloque uma mão na gaiola ao longo da parede da gaiola no lado direito da frente.
      1. Certifique-se de que a cabeça do manipulador não está bloqueando a câmera para filmar o mouse.
   7. Comece um temporizador.
   8. Mantenha a mão imóvel por 2 minutos e deixe o mouse explorar a mão.
   9. Retire a mão da gaiola por 15 s.
   10. Tente pegar o mouse usando as mãos e registrar se o mouse foge.
   11. Repita o último passo até cinco vezes, a cada 5 segundos, ou até que o mouse se permita ser pego.
   12. Regisso número de tentativas necessárias para pegar o mouse.
   13. Devolva material de aninhamento e enriquecimento para a gaiola.
   14. Limpe luvas com 70% de etanol ou troque luvas antes de seguir para o próximo animal.
   15. Após o teste, transfira vídeos do cartão de memória para um computador.
   16. Usando um software automatizado de rastreamento de vídeo, divida a gaiola em quatro quadrantes iguais e registe o tempo gasto pelo mouse em cada quadrante (aqui, Ethovision XT 14).

11. Nova alimentação suprimida

1. Privação de alimentos
   1. 3 dias antes do teste, realize uma mudança completa da gaiola e abriga os animais (a única carcaça é preferível para realizar o teste da gaiola domiciliar).
      NOTA: Fornecer roupa de cama fresca remove poeira potencial ou pequenos pedaços de alimentos acumulados na cama desde a última mudança de gaiola.
   2. Um dia antes do teste, pesam todos os animais por volta das 18h.
   3. Retire todos os alimentos do funil alimentar e certifique-se de que não há pedaços de comida na gaiola ou na cama.
2. Configuração do quarto
   1. Coloque a câmara NSF sobre uma mesa.
   2. Encha a câmara com uma fina camada de cama de milho (ou outra roupa de cama diferente da cama usada em animais de casa).
   3. Coloque a luz em 70 Lux com 4 lâmpadas colocadas no canto da mesa onde fica a câmara, de frente para o teto. Desligue as luzes aéreas para manter a iluminação baixa do quarto.
   4. Coloque uma pelota de chow padrão usada na instalação, na lateral da câmara de frente para o experimentador (≈10 cm da parede).
3. Teste
   1. Pela manhã, após a privação de alimentos, leve os animais para a sala 30 minutos antes dos testes para deixá-los se aclimatar às configurações de luz e ao novo ambiente.
   2. Pesar todos os animais para medir sua perda de peso com base no peso medido no dia anterior. Os animais devem perder de 8 a 12% durante a noite para serem capazes de realizar a tarefa corretamente.
   3. Classifique os animais por perda de peso, e trie-os a partir do mouse que mais perdeu para o rato que perdeu menos peso.
   4. Certifique-se de que a câmara está cheia de roupa de cama e com uma única pelota.
   5. Coloque o animal do lado oposto da câmara, longe da pelota de comida.
   6. Inicie o temporizador imediatamente.
   7. Deixe o mouse explorar a câmara por até 12 minutos.
   8. Meça a latência para se aproximar e alimentar (o animal deve morder e comer) na pelota de alimentos.
      1. Considere que é uma abordagem quando o animal se aproxima da pelota, cheira e não morde.
      2. Defina uma mordida como quando o animal começa a consumir a pelota.
   9. Regissua a latência para se aproximar e se alimentar da pelota em segundos.
   10. Uma vez que o rato tenha se alimentado da pelota de comida, remova o rato da câmara.
   11. Descarte a cama, mas guarde a pelota que será usada para testar o apetite na gaiola do mouse.
   12. Reinicie a câmara para o próximo animal e prossiga com o próximo animal.
   13. 15 min após a conclusão do teste na câmara, solte a pelota usada durante o teste, dentro da gaiola do mouse, contra a parede na frente da gaiola.
   14. Meça a latência para se alimentar da pelota quando a pelota estiver na gaiola. Esta é uma medida para a unidade de apetite.
       1. É preferível remover o material de aninhamento para garantir que o rato veja a pelota sendo deixada cair em sua gaiola.

12. Coleta de Soro e Medição de Corticosterona

1. Manuseie animais por 1 min usando a técnica atribuída, 15 minutos antes da coleta de sangue (isso pode ser feito com animais alojados em grupo ou alojados, tendo em mente o risco de lutas ao reagrupar camundongos).
   1. Para o túnel manuseado ratos, guie-os até o túnel, levante o túnel da gaiola por 1 minuto, e substitua o rato em sua gaiola.
   2. Para ratos manuseados na cauda, pegue a base traseira do mouse e remova o mouse de sua gaiola. Transfira o mouse para a manga dos experimentadores por 1 min, e devolva o mouse para sua gaiola por manuseio da cauda.
   3. Para ratos manuseados em 3D, use as mãos com as mãos para remover o mouse de sua gaiola. Segure o rato em mãos com as mãos por 1 min, e devolva-o à sua gaiola.
2. 15 min após o manuseio, proceda com coleta de sangue da veia submandibular²².
3. Escroto firmemente do mouse de tal forma que a cabeça do mouse esteja firmemente imobilizada.
4. Localize o local da punção.
   1. Há uma pequena covinha sem cabelo ao longo da mandíbula do rosto que pode ser usada como um marco para localizar o local da punção. Desenhando uma linha entre a base da mandíbula e esta covinha o local da punção está atrás desta covinha em direção à orelha por cerca de 5 mm, logo atrás da dobradiça da mandíbula.
5. Segure uma agulha limpa de 23 G perpendicular ao local da punção e use um movimento de lancing firme rápido. A ponta da agulha deve penetrar em uma profundidade entre 1-2 mm, o sangue fluirá imediatamente assim que a veia for perfurada.
6. Colete ~150 μL de sangue em tubos de coleta revestidos EDTA e armazene no gelo.
7. Aplique uma leve pressão com uma gaze estéril no local da punção por 5 s ou mais para permitir que o sangue coagula.
8. Uma vez que o sangue tenha coagulado, devolva o rato para sua gaiola.
9. Centrifugar sangue a 4 °C 3.500 x g por 10 min.
10. Decantar o supernatante.
11. Armazene o supernatante a -20 °C para análises a jusante.
12. Meça os níveis de corticosterona usando um kit ELISA corticosterona seguindo o protocolo do fabricante.
13. Use um espectrômetro para ler os resultados ELISA.

Resultados

Dois estudos separados foram realizados com camundongos C57BL/6. O estudo #1 incluiu homens de 6 meses de idade e #2 de estudo incluiu mulheres de 2,5 meses de idade (N=36/estudo) dos Laboratórios Jackson (Cat #000664). Os ratos chegaram à instalação aos 2 meses de idade. Enquanto o Estudo #2 fêmeas foram tratadas e testadas duas semanas após a chegada, o Estudo #1 os machos só foram tratados e testados aos 6 meses de idade (atraso devido à paralisação pandêmica global). Durante esse tempo, um rato de Study #2...

Discussão

Este estudo e o desenvolvimento de métodos baseiam-se na observação de que as técnicas de manuseio em camundongos ainda são negligenciadas pela comunidade científica, e que alguns laboratórios ainda estão relutantes em implementar técnicas de habitação ou manuseio para reduzir o estresse e a reatividade de seus animais antes dos experimentos. Ao mesmo tempo em que representa um compromisso de tempo, o manejo animal proporciona efeitos benéficos aos animais que podem contribuir para o sucesso dos experimentos ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
23 G x 1 in. BD PrecisionGlide general use sterile hypodermic needle. Regular wall type and regular bevel.	BD	2546-CABD305145	Needles for Blood collection
BD Vacutainer® Venous Blood Collection EDTA Tubes with Lavender BD Hemogard™ closure, 2.0ml (13x75mm), 100/pk	BD	367841	EDTA Coated tubes for blood collection
Bed’o cobs ¼” Corn cob laboratory animal bedding	Bed-O-Cobs	BEDO1/4	Novel bedding for novelty suppressed feeding
Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5424 R	For centrifugation of blood.
Corticosterone ELISA Kit	Arbor Assays	K003-H1W
Digital Camera	Panasonic	HC-V770	Camera to record EPM/Experimenter interactions
Elevated Plus Maze	Home Made	n/a	Custom Maze made of four black Plexiglas arms (two open arms (29cm long by 7 cm wide) and two enclosed arms (29 cm long x7 cm wide with 16 cm tall walls)) that form a cross shape with the two open arms opposite to each other held 55 cm above the floor
Ethanol	Medstore House Brand	39753-P016-EA95	Dilute to 70% with Distilled water, for cleaning
Ethovision XT 15	Noldus	n/a	Automated animal tracking software
Laboratory Rodent Diet	LabDiet	Rodent Diet 5001	Standard Rodent diet
Memory Card	Kingstone Technology	SDA3/64GB	For video recording and file transfer
Novelty Suppressed Feeding Chamber	Home Made	n/a	Custom test plexiglass test chamber with clear floors and walls 62cm long, by 31cm wide by 40cm tall .
Parlycarbonate tubes	Home Made	n/a	13 cm in length and 5cm in diameter
Purina Yesterday’s news recycled newspaper bedding	Purina	n/a	Standard Bedding
Spectrophotometer	Biotek	Epoch Microplate Reader