Tecniche di manipolazione per ridurre lo stress nei topi

Riepilogo

Questo documento descrive una tecnica di manipolazione nei topi, la tecnica di manipolazione 3D, che facilita la manipolazione di routine riducendo i comportamenti simili all'ansia e presenta dettagli su due tecniche correlate esistenti (gestione del tunnel e della coda).

Abstract

Gli animali da laboratorio sono sottoposti a molteplici manipolazioni da parte di scienziati o fornitori di assistenza agli animali. Lo stress che questo provoca può avere effetti profondi sul benessere degli animali e può anche essere un fattore confondente per variabili sperimentali come le misure di ansia. Nel corso degli anni, sono state sviluppate tecniche di manipolazione che riducono al minimo lo stress correlato alla manipolazione con particolare attenzione ai ratti e poca attenzione ai topi. Tuttavia, è stato dimostrato che i topi possono essere bituati a manipolazioni utilizzando tecniche di manipolazione. Abituare i topi alla manipolazione riduce lo stress, facilita la manipolazione di routine, migliora il benessere degli animali, diminuisce la variabilità dei dati e migliora l'affidabilità sperimentale. Nonostante gli effetti benefici della manipolazione, l'approccio tail-pick up, che è particolarmente stressante, è ancora ampiamente utilizzato. Questo documento fornisce una descrizione dettagliata e la dimostrazione di una tecnica di manipolazione del topo di nuova concezione intesa a ridurre al minimo lo stress sperimentato dall'animale durante l'interazione umana. Questa tecnica manuale viene eseguita nell'arco di 3 giorni (tecnica di manipolazione 3D) e si concentra sulla capacità dell'animale di abituarsi allo sperimentatore. Questo studio mostra anche l'effetto delle tecniche di gestione del tunnel precedentemente stabilite (utilizzando un tunnel in policarbonato) e la tecnica di raccolta della coda. Specificamente studiati sono i loro effetti sui comportamenti ansiosi, utilizzando test comportamentali (Elevated-Plus Maze e Novelty Suppressed Feeding), interazione volontaria con gli sperimentatori e misurazione fisiologica (livelli di corticosterone). La tecnica di gestione 3D e la tecnica di gestione del tunnel hanno ridotto i fenotipi simili all'ansia. Nel primo esperimento, utilizzando topi maschi di 6 mesi, la tecnica di gestione 3D ha migliorato significativamente l'interazione dello sperimentatore. Nel secondo esperimento, utilizzando una femmina di 2,5 mesi, ha ridotto i livelli di corticosterone. Pertanto, la gestione 3D è un approccio utile in scenari in cui l'interazione con lo sperimentatore è richiesta o preferita, o in cui la gestione del tunnel potrebbe non essere possibile durante l'esperimento.

Introduzione

Topi e ratti sono risorse essenziali per gli studi preclinici^1,2 per molteplici scopi, tra cui studi endocrini, fisiologici, farmacologici o comportamentali². Dal crescente numero di studi che coinvolgono animali, è emerso che variabili ambientali incontrollate tra cui l'interazione umana influenzano vari risultati nella ricerca biomedica^3,4,5. Ciò è responsabile della significativa variabilità osservata tra esperimenti e laboratori di ricerca^4,5, ponendo un avvertimento importante nella ricerca sugli animali.

Sono stati implementati vari approcci con l'obiettivo di limitare l'impatto dei fattori di stress ambientale e ridurre la reattività all'interazione umana. Ad esempio, per limitare l'impatto dei fattori di stress ambientale, la standardizzazione delle condizioni abitative e i sistemi abitativi automatizzati^6,7 sono stati implementati in tutti i laboratori. Per quanto riguarda l'interazione con gli esseri umani, gli approcci comunemente usati per la manipolazione e il trasporto degli animali avevano poco riguardo per il disagio e lo stress degli animali. Ad esempio, raccogliere gli animali per la coda o usare la pinna⁸ aumenta l'ansia basale^9,10,11,riduce l'esplorazione^9,12 e contribuisce notevolmente alla variabilità interimpiale all'interno e tra gli studi^13,14. Di conseguenza, sono stati sviluppati altri approcci, come la tecnica di gestione della tazza, che è applicabile a topi e ratti. In questo approccio, gli animali vengono "coppettati" fuori dalla loro gabbia e tenuti dagli sperimentatori con le mani che formano una tazza^9,10,11. Un'altra utile alternativa alla movimentazione della coda prevede l'utilizzo di un tunnel in policarbonato per trasferire i topi^9,10,15. Questo approccio elimina l'interazione diretta tra il mouse e lo sperimentatore. Sia l'approccio a coppa che a tunnel hanno mostrato efficacia nel ridurre i comportamenti ansiosi e la paura dello sperimentatore che possono essere esagerati da tecniche di manipolazione avverse, come il pick up / tail handling^9,10.

Pertanto, prove crescenti dimostrano l'utilità di una corretta manipolazione del topo per ridurre la variabilità tra gli individui^9,11e migliorare il benessere degli animali¹⁰. Tuttavia, le tecniche sopra menzionate devono ancora affrontare limitazioni. La tecnica di gestione della tazza è stata implementata con programmi che vanno da 10 giorni (10 sessioni in 2 settimane¹⁶⁾fino a 15 settimane^17,che è una notevole quantità di tempo per il personale della struttura e gli sperimentatori. Inoltre, l'efficacia della manipolazione della tazza varia in base al ceppo⁹ e la manipolazione convenzionale della tazza in mani aperte può portare a topi ingenui o ceppi particolarmente saltellanti a saltare dalla mano^9,18. La movimentazione delle gallerie si traduce in risultati più coerenti e generalmente più rapidi nella manipolazione¹⁹. I tunnel sono anche usati come arricchimento della gabbia domestica. Aiutano gli animali ad abituarsi a maneggiare rapidamente e forniscono i benefici aggiuntivi dell'arricchimento. La gestione delle gallerie, tuttavia, presenta limitazioni nel trasferimento di animali tra apparati. È interessante notare che Hurst e West⁹e Henderson et al.²⁰ hanno dimostrato che l'uso di una manipolazione manuale delicata e breve per trasferire gli animali dal tunnel all'apparato non influisce sul loro fenotipo.

Per fornire un'alternativa ai metodi esistenti, con un'assuefazione realizzabile in un breve periodo di tempo, questo articolo descrive una nuova tecnica che espande la tecnica di movimentazione della tazza, quindi non richiede particolari attrezzature. Questo approccio utilizza pietre miliari per valutare il livello di comfort che i topi hanno con il processo di manipolazione. Mostra efficacia nel ridurre la reattività e lo stress del topo (a livello comportamentale e ormonale), facilita la manipolazione di routine e contribuisce a ridurre la variabilità tra gli animali. I dettagli di questa tecnica sono forniti qui e la sua efficacia nel ridurre i comportamenti simili all'ansia, migliorare l'interazione con gli sperimentatori e limitare il rilascio dell'ormone dello stress periferico (corticosterone) sono dimostrati in due studi separati (topi maschi e femmine), rispetto alla gestione del tunnel (controllo positivo) e alle tecniche di manipolazione della coda (controllo negativo).

Protocollo

Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal comitato per la cura degli animali camh e condotte in conformità con le linee guida del Canadian Council on Animal Care.

NOTA: Il metodo di manipolazione qui descritto può essere utilizzato in vari ceppi di topo, comprese le linee non transgeniche (C57/BL6, BalbC, CD1, SV129, ecc.) e transgeniche. Può anche essere usato con topi giovani o vecchi, notando che i topi giovani adulti (4-6 settimane) tendono ad essere leggermente più attivi dei topi adulti o vecchi, specialmente il giorno 1.

1. Preparazione sperimentale

1. Prima dell'inizio dello studio, secondo le linee guida ARRIVE^21,assegnare casualmente i topi a ciascun gruppo di gestione (3D-Handling, Tunnel Handling o Tail Handling).
2. Identificare la stanza in cui eseguire la manipolazione. Può essere eseguito nella stanza di alloggiamento o in una stanza separata. Se la manipolazione viene eseguita in una stanza separata, che richiede che gli animali vengano spostati su un carrello in movimento, consentire agli animali di abituarsi alla nuova stanza per 20-30 minuti prima dell'inizio del protocollo di manipolazione.
3. Per gli animali ospitati in gruppo, utilizzare una gabbia temporanea per ospitare i topi dopo la manipolazione, prima di raggrupparli tutti nella loro gabbia domestica iniziale. Ciò riduce i potenziali combattimenti tra animali prima della manipolazione (in particolare nei maschi).
4. Lavora su un bancone (preferibilmente un piano di lavoro sgomberato) o in un armadietto di biosicurezza, con la gabbia di alloggiamento lontana dall'animale che viene maneggiato. La vicinanza alla gabbia abitativa aumenta il rischio di saltare. Se gli animali sono alloggiati in gruppo, saltare il topo che viene maneggiato nella gabbia domestica può causare stress ai compagni di gabbia.
   NOTA: Lavorare in un armadio di biosicurezza limita il rischio che i topi saltino sul pavimento e può essere richiesto in alcune strutture. Questa tecnica può essere utilizzata in un armadio di biosicurezza, assicurandosi di eseguire sempre tutti i passaggi all'interno dell'armadio di biosicurezza ed evitando che i topi camminino sugli avambracci del gestore.

2. GIORNO 1: 5 min per mouse

1. Aprire delicatamente la gabbia e posizionare il coperchio sul lato, rimuovere i materiali di nidificazione e altri arricchimenti come ruote da corsa o rifugi.
2. Introdurre una mano aperta guantata nella gabbia di casa, posizionando lentamente la mano lungo un lato della parete della gabbia (la parete più vicina al conduttore, Figura 1A).
   1. Non provare immediatamente a prendere il mouse.
3. Rimanere immobili e permettere all'animale di abituarsi alla presenza della mano nella gabbia per circa 30 s.
4. Cerca di prendere il mouse nel palmo della mano (cioè, evita di raccogliere l'animale per la coda).
   1. Se il mouse non viene facilmente raccolto dopo 3 tentativi, guidare il mouse in un angolo e in una tazza con entrambe le mani.
   2. Muovi delicatamente le mani a coppa verso il mouse per cercare di raccoglierlo.
   3. Se non ha successo dopo un massimo di 3 tentativi con entrambe le mani, prendi delicatamente il mouse dalla base della coda e trasferiscilo sull'avambraccio o sulla mano piatta.
5. Con il mouse in mano, tieni la mano il più piatta e aperta possibile.
   NOTA: questo fornisce una piattaforma piatta su cui il mouse può calpestare e limita il rischio di morsi.
6. Tenendo la mano aperta e piatta con il palmo verso l'alto, posizionare l'altra mano adiacente alla mano che tiene il mouse e consentire al mouse di muoversi liberamente da una mano all'altra senza alcun ritegno (Figura 1B).
7. Lascia che il mouse esplori e si muova tra le mani per 1 minuto.
   1. A questo punto i topi possono provare a saltare via. Posiziona le mani in modo tale che se il mouse salta, atterrerà su un piano di lavoro piuttosto che sul pavimento.
   2. Se un topo sembra che si stia preparando a saltare (muovendosi verso il bordo della mano e alzandosi sulle zampe posteriori), posiziona lentamente l'altra mano di fronte ad esso e cerca di guidarlo a camminare su questa mano. Evita movimenti improvvisi in quanto aumenta il rischio di saltare.
   3. Se un mouse salta, prova a prenderlo evitando la manipolazione della coda e riprendi la sessione di gestione. Se il mouse rimane sul pavimento o fuori dalle mani per più di 10 s, aggiungere ulteriore tempo alla sessione di manipolazione per compensare ogni volta che il mouse è stato fuori dalle mani.
   4. Prendi appunti del salto. Il numero totale di salti può essere utilizzato per valutare la potenziale variabilità tra gli animali.
8. Dopo 1 minuto di manipolazione con le mani piatte, rilassare il palmo della mano e leggermente prendere il mouse in mano, prima di far rotolare delicatamente il mouse tra le mani (Figura 1C).
   1. Per "rotolare", posizionare il mouse nel palmo della mano, su una mano piatta, perpendicolare alle dita.
   2. Chiudi lentamente la mano, posizionando le dita sul retro del mouse.
   3. Posizionare la mano libera direttamente sotto la mano tenendo il mouse.
   4. Ruotare lentamente la mano con il mouse per trasferire delicatamente il mouse all'altra mano (rotazione di 180 °).
   5. Ripeti questo avanti e indietro tra le mani.
9. Alterna il delicato rotolamento tra le mani e l'esplorazione libera a mani aperte per 60 s, alternando tecniche circa ogni 20 s.
10. Eseguire un "test del rifugio" (Figura 1D).
    1. Lascia che il mouse si sposti sul bordo della mano, quindi unisci le 2 mani.
    2. Molto lentamente, coppettali in modo che il mouse si adatti all'interno di un "rifugio" formato dalle mani. Lasciare un'apertura in modo che il mouse possa fuggire se necessario.
    3. Cerca di tenere il mouse nel rifugio per 5-10 s, senza alcun ritegno.
    4. Alternare tra il test del rifugio, rotolare tra le mani e l'esplorazione libera delle mani aperte per altri 60 anni, assicurandosi di eseguire il passaggio del rifugio 3 o più volte.
11. In tutte le procedure descritte in 2.10, non affrettare il processo. Se il mouse appare stressato (cioè, tentativo di fuga, salti dalle mani, evitando il contatto con le mani ecc.) essendo confinato all'interno delle mani, continuare con il rotolamento tra le mani e l'esplorazione libera per 20 s, e poi riprovare.
12. Pietra miliare: eseguire almeno 1 test di rifugio di successo di 10 s per il completamento del giorno 1.
    1. Considera un test di rifugio di successo quando il mouse rimane nelle mani. Se il mouse fa scoppiare la testa e ritorna al rifugio, è ancora un test riuscito. Se l'animale esce completamente dal rifugio, è un fallimento.
13. Consenti l'esplorazione gratuita nelle mani per 30 s.
14. Sostituire delicatamente il mouse nella sua gabbia. Se il gruppo è alloggiato, metti il topo nella gabbia temporanea fino a quando tutti i compagni di gabbia non vengono maneggiati. Riporta i topi nella loro gabbia originale raccogliendoli nel palmo della mano. Non utilizzare un pick up di coda.
15. Pulire il banco di potenziali feci e urina con il 70% di etanolo.
16. Risciacquare accuratamente i guanti con etanolo al 70% (o soluzione detergente appropriata) o cambiare i guanti prima di maneggiare il mouse successivo (è possibile tenere gli stessi guanti per i compagni di gabbia).
    NOTA: Si consiglia di eseguire la manipolazione con un numero ragionevole di animali per evitare l'affaticamento del conduttore. La gestione di 24 topi richiede circa 2 ore e si consiglia di non superare i 24 topi per conduttore. Se è necessario maneggiare più animali, si consiglia di avere più conduttori o di dividere le procedure di manipolazione in sottogruppi, per più giorni.

3. GIORNO 2: da 3 a 5 minuti per mouse

1. Prova a prendere il mouse nel palmo della mano. In questa fase, dovrebbe essere già fattibile e i topi non dovrebbero saltare fuori dalla mano.
2. Inizia con il palmo aperto come il giorno 1, consentendo al mouse di esplorare liberamente per 20 s.
3. Quindi, rotolare il mouse tra le mani un paio di volte (4-5 volte).
4. Eseguire il "test del rifugio" per 5 s.
5. Ripetere il test del rifugio più volte (~ 5-6) per un periodo da 2 a 3 minuti.
6. Durante lo stesso periodo di 2 o 3 minuti, alternare con il rotolo tra le mani e l'esplorazione libera delle mani aperte passo dal giorno 1 per migliorare l'assuefazione.
   1. Toccare il mouse sulla testa e sulla schiena (Figura 1E), 5-6 volte. Un segno di assuefazione è quando il mouse ti permette di toccarlo senza tentare di fuggire.
   2. Eseguire un "Nose poke": provare a toccare il muso del mouse, 2 o 3 volte (Figura 1F).
      1. Se il mouse tenta di mordere o mostra evidenti segni di stress per essere toccato, non tentare immediatamente di nuovo il colpo del naso. Invece, alterna con l'esplorazione e il rollio a mano piatta. "L'assuefazione" si riflette nel fatto che l'animale non scappa o gira la testa in caso di contatto umano.
7. In tutte le procedure descritte in 3.4-3.6, non affrettare il processo. Se il mouse appare stressato dall'essere confinato all'interno delle mani o non vuole essere toccato, continuare a rotolare tra le mani per 20-30 s e poi riprovare.
8. Pietre miliari: eseguire almeno 1 colpo al naso di successo per 2-3 s per il completamento del giorno 2.
9. Interrompere questa sessione dopo circa 3 minuti di manipolazione se l'animale reagisce bene al "rifugio", "accarezzamento della testa", "colpo al naso" e se il topo sembra essere disposto a esplorare le mani senza segni di stress.
10. Se il topo continua a mostrare segni di stress o non sta reagendo bene al test di "rifugio" o al test "nose poke", continuare la sessione fino a raggiungere i 5 minuti come nel giorno 1.
11. Sostituisci il mouse nella sua gabbia, pulisci il piano di lavoro e i guanti come nel giorno 1.

4. GIORNO 3: Circa 3 minuti per mouse

1. Il terzo giorno, procedi attraverso gli stessi passaggi del giorno 2, per 2 o 3 minuti.
   1. Prendi il mouse nel palmo della mano.
   2. Trasferisci e rotola il mouse tra le mani
   3. Eseguire un test di rifugio.
   4. Prova ad accarezzare il mouse sulla schiena e sulla testa.
2. Alternare questi passaggi per circa 1-2 minuti.
3. Continuare la procedura fino a quando il mouse è abbastanza rilassato da sedersi nel palmo della mano senza tentare di fuggire.
4. Prima della fine del giorno 3, ripeti il test del rifugio e il test del naso come test di assuefazione.
   1. Se entrambi i test possono essere completati al primo tentativo, il processo di assuefazione è completo. Continuare a maneggiare delicatamente il mouse per 30 s a un minuto.
   2. Se il mouse è inizialmente resistente a entrambi i test, ripetere i passaggi 4.1-4.3 per 20-30 s prima di riesamino il test del naso e del riparo.
   3. Se il topo rimane resistente a questi test dopo 3 minuti, il terzo giorno può essere ripetuto.
5. Pietre miliari: eseguire almeno 2 test di rifugio di successo di 10 s ciascuno e 2 test di poke del naso di successo per il completamento del giorno 3 e il completamento dell'intera procedura di gestione 3D.
6. Riportare il mouse nella sua gabbia, pulire il piano di lavoro e i guanti.

5. Approccio facoltativo per gli animali da sottoporre a ritenuta per iniezione o gavage

NOTA: Il giorno 3, se l'animale sarà trattenuto per scopi sperimentali (gavage orale, iniezione intra-peritoneale, ecc.), I topi possono essere sottoposti al test del pizzico del collo.

1. Afferrare la nuca tra il pollice e l'indice (Figura 1G).
2. Sollevare il mouse 3-5 cm sopra la mano per 2-3 s.
   NOTA: Questa è normalmente una posizione non naturale per i topi adulti, e se i topi rimangono quasi immobili, sono ben bituati alla manipolazione e saranno facili da trattenere per scopi sperimentali.
3. Rimettere il mouse nella mano piatta o, se il mouse è reattivo al pizzico del collo, prendere in considerazione la possibilità di posizionarlo sulla manica dello sperimentatore, sul coperchio della gabbia o sul piano di lavoro
   NOTA: se si lavora in un armadio di biosicurezza, non posizionare il mouse sulla manica o potrebbe salire e uscire dall'armadio di biosicurezza. Preferisci posizionare il mouse sul piano di lavoro all'interno dell'armadio di biosicurezza.
4. Lascia il mouse per esplorare liberamente la mano dello sperimentatore per 1 minuto.

6. Approccio facoltativo per ulteriori giorni di gestione

1. Nell'eventualità di una linea di topo altamente stressata, aggiungere ulteriori giorni per ridurre la reattività e il livello di stress degli animali, utilizzando i metodi descritti nel Giorno 2/3.
   NOTA: Molti fattori possono influenzare lo stress basale degli animali, tra cui il ceppo, la presenza di modificazioni transgeniche, l'età, il sesso e le condizioni abitative. Se questi fattori non sono coerenti tra gruppi come gli animali anziani sottoposti a test contro i controlli giovani o gli animali transgenici testati contro i controlli di tipo selvatico, si raccomanda di utilizzare lo stesso numero di giorni di assuefazione per ciascun gruppo.

7. Gestione delle gallerie

NOTA: questa tecnica è applicabile solo ai mouse con gestione tunnel. I tunnel sono tubi in policarbonato di circa 13 cm di lunghezza e 5 cm di diametro.

1. Posiziona il tunnel nella gabbia del mouse.
2. Lasciare il tunnel nella gabbia per 7 giorni prima della manipolazione.
3. Aprire la gabbia e posizionare il coperchio sul lato.
4. Guidare delicatamente il mouse nel tunnel in policarbonato (già nella gabbia).
5. Sollevare il tunnel dalla gabbia, orizzontalmente. Se necessario, coprire liberamente le estremità del tunnel per evitare che l'animale salti / cada fuori dal tunnel, potenzialmente ricadendo nella sua gabbia o sul pavimento.
6. Sposta l'animale nel tunnel lontano dalla gabbia di casa e tienilo lontano da qualsiasi superficie per 30 s.
7. Posiziona il tunnel nella gabbia di casa, consentendo al mouse di uscire dal tubo.
8. Attendere 60 s e quindi ripetere i passaggi 7.4-7.7 una volta.
9. Risciacquare accuratamente i guanti con etanolo al 70% o cambiare i guanti prima di abituare il mouse successivo.
10. Ripetere questa procedura per 10 giorni consecutivi.

8. Manipolazione della coda

NOTA: questa tecnica è applicabile solo ai topi con manico a coda. È usato per trasferire i topi dalla loro gabbia a un apparato e viceversa.

1. Aprire la gabbia e posizionare il coperchio sul lato.
2. Afferra i topi per la base della coda tra pollice e indice.
3. Sollevare il mouse dalla gabbia.
4. In 2-3 s, trasferire il mouse all'avambraccio opposto dello sperimentatore mantenendo una presa sulla coda per evitare che il mouse penzoli.
5. Quando è necessaria la manipolazione della coda nell'attuazione di questo esperimento (ad esempio, prima dei prelievi di sangue per il test del cortisolo) gli animali vengono trasferiti all'avambraccio dello sperimentatore mediante manipolazione della coda e tenuti per 15 s prima di essere restituiti alla loro gabbia.

9. Labirinto Elevato Plus

1. Configurazione della sala
   1. Posiziona il labirinto al centro della stanza, sotto una fotocamera digitale dotata di una scheda di memoria.
   2. Imposta la luce della stanza a ~ 60 Lux usando 2 lampade da terra posizionate dietro il labirinto.
   3. Spegni l'illuminazione dall'alto per evitare la luce diretta sul labirinto che crea riflessione e interrompe il rilevamento degli animali nel labirinto.
   4. Una volta configurata tutta l'attrezzatura, trasferire gli animali nella stanza e lasciarli acclimatare alle impostazioni di luce e al nuovo ambiente per 30 minuti.
2. Collaudo
   1. Pulire il labirinto con il 70% di etanolo per evitare odori di polvere o dell'animale che è stato testato in precedenza.
   2. Avviare la fotocamera.
   3. Usa un pezzo di carta con l'ID dell'animale per registrare l'ID sul video, prima di posizionare l'animale nel labirinto (questo faciliterà la corretta identificazione di quale topo viene filmato su ciascun video).
   4. Usa la tecnica di manipolazione appropriata per ogni animale per trasferirlo nel labirinto.
   5. Posiziona il mouse sulla piattaforma centrale, di fronte a un braccio aperto.
   6. Lascia che il mouse esplori l'apparato per 10 minuti, indisturbato.
   7. Dopo 10 minuti, arrestare la fotocamera.
   8. Recupera il mouse dal labirinto e rimettelo nella sua gabbia.
   9. Pulire le feci e l'urina dal labirinto con il 70% di etanolo.
   10. Una volta completato il test con tutti i mouse, trasferire i video dalla scheda di memoria a un computer per il monitoraggio video.
   11. Utilizzando un software di tracciamento automatizzato degli animali, tieni traccia del numero di voci a braccia aperte e chiuse e del tempo trascorso a braccia aperte o chiuse (qui Ethovision XT 14).

10. Interazione dello sperimentatore (derivato da Hurst e West⁹⁾

1. Configurazione della sala
   1. Posizionare un tavolo al centro della sala prove sotto una fotocamera digitale dotata di una scheda di memoria.
   2. Imposta la luce a 50-70 Lux con 4 lampadine posizionate nell'angolo della stanza rivolte verso il soffitto. Spegni l'illuminazione dall'alto per evitare la luce diretta sul labirinto che crea riflessione e interrompe il rilevamento degli animali nell'arena.
   3. Porta gli animali nella stanza.
   4. Lasciateli acclimatare nella stanza per 30 minuti.
2. Rsperimento
   1. Posizionare la gabbia domestica sotto la fotocamera digitale.
   2. Rimuovere il coperchio.
   3. Rimuovere il materiale di nidificazione e altri arricchimenti che potrebbero interferire con il monitoraggio degli animali.
   4. Avviare la fotocamera.
   5. Usa la scheda della gabbia con l'ID dell'animale per identificare l'animale nel video.
   6. Metti una mano nella gabbia di casa lungo la parete della gabbia nella parte anteriore destra.
      1. Assicurarsi che la testa del gestore non stia bloccando la fotocamera per filmare il mouse.
   7. Avviare un timer.
   8. Tenere la mano immobile per 2 minuti e lasciare che il mouse esplori la mano.
   9. Rimuovere la mano dalla gabbia per 15 s.
   10. Prova a prendere il mouse usando le mani a coppa e registra se il mouse fugge.
   11. Ripeti l'ultimo passaggio fino a cinque volte, ogni 5 secondi o fino a quando il mouse non si lascia prendere.
   12. Registrare il numero di tentativi necessari per prendere il mouse.
   13. Restituire il materiale di nidificazione e l'arricchimento alla gabbia.
   14. Pulire i guanti con etanolo al 70% o cambiare i guanti prima di procedere all'animale successivo.
   15. Dopo il test, trasferire i video dalla scheda di memoria a un computer.
   16. Utilizzando un software di tracciamento video automatizzato, dividere la gabbia in quattro quadranti uguali e registrare il tempo trascorso dal mouse in ciascun quadrante (qui, Ethovision XT 14).

11. Novità alimentazione soppressa

1. Deprivazione alimentare
   1. 3 giorni prima del test, eseguire un cambio di gabbia completo e ospitare gli animali (è preferibile un singolo alloggiamento per eseguire il test della gabbia domestica).
      NOTA: fornire biancheria da letto fresca rimuove la polvere potenziale o piccoli pezzi di cibo che si accumulano nella lettiera dall'ultimo cambio di gabbia.
   2. Il giorno prima del test, pesare tutti gli animali intorno alle 18:00.
   3. Rimuovere tutto il cibo dalla tramoggia del cibo e assicurarsi che non ci siano pezzi di cibo nella gabbia o nella lettiera.
2. Configurazione della sala
   1. Posizionare la camera NSF su un tavolo.
   2. Riempire la camera con un sottile strato di lettiera di mais (o altra lettiera diversa dalla lettiera utilizzata nella gabbia domestica degli animali).
   3. Impostare la luce a 70 Lux con 4 lampadine poste nell'angolo del tavolo dove si trova la camera, rivolte verso il soffitto. Spegnere le luci a soffitto per mantenere bassa l'illuminazione della stanza.
   4. Posizionare un pellet di chow standard utilizzato nella struttura, sul lato della camera rivolto verso lo sperimentatore (≈10 cm dal muro).
3. Collaudo
   1. Al mattino dopo la privazione del cibo, porta gli animali nella stanza 30 minuti prima del test per farli acclimatare alle impostazioni di luce e al nuovo ambiente.
   2. Pesare tutti gli animali per misurare la loro perdita di peso in base al peso misurato il giorno precedente. Gli animali dovrebbero perdere l'8-12% durante la notte per essere in grado di eseguire correttamente il compito.
   3. Ordina gli animali per perdita di peso e selezionali a partire dal mouse che ha perso di più al mouse che ha perso meno peso.
   4. Assicurarsi che la camera sia riempita con lettiera e con un singolo pellet.
   5. Posizionare l'animale sul lato opposto della camera, lontano dal pellet di cibo.
   6. Avviare immediatamente il timer.
   7. Lascia che il mouse esplori la camera per un massimo di 12 minuti.
   8. Misurare la latenza per avvicinarsi e nutrirsi (l'animale deve mordere e mangiare) sul pellet alimentare.
      1. Consideralo un approccio quando l'animale si avvicina al pellet, lo annusa e non morde.
      2. Definisci un morso come quando l'animale inizia a consumare il pellet.
   9. Registra la latenza per avvicinarsi e alimentare il pellet in pochi secondi.
   10. Una volta che il mouse si è nutrito del pellet alimentare, rimuovere il mouse dalla camera.
   11. Scartare la biancheria da letto ma salvare il pellet che verrà utilizzato per testare l'appetito nella gabbia domestica del topo.
   12. Ripristina la camera per l'animale successivo e procedi con l'animale successivo.
   13. 15 minuti dopo il completamento del test nella camera, far cadere il pellet utilizzato durante il test, all'interno della gabbia domestica del topo, contro la parete nella parte anteriore della gabbia.
   14. Misurare la latenza per alimentare il pellet quando il pellet è nella gabbia domestica. Questa è una misura per l'appetito.
       1. È preferibile rimuovere il materiale di nidificazione per assicurarsi che il topo veda il pellet cadere nella sua gabbia.

12. Raccolta del siero e misurazione del corticosterone

1. Maneggiare gli animali per 1 minuto utilizzando la tecnica assegnata, 15 minuti prima della raccolta del sangue (questo può essere fatto con animali alloggiati in gruppo o singoli ospitati, tenendo presente il rischio di combattimenti quando si raggruppano i topi).
   1. Per i topi gestiti dal tunnel, guidali verso il tunnel, solleva il tunnel dalla gabbia per 1 minuto e sostituisci il topo nella sua gabbia.
   2. Per i topi con la coda, afferrare la base della coda del mouse e rimuovere il mouse dalla sua gabbia. Trasferire il mouse nella manica degli sperimentatori per 1 minuto e riportare il mouse nella sua gabbia maneggiando la coda.
   3. Per i topi maneggiati in 3D, utilizzare le mani a coppa per rimuovere il mouse dalla sua gabbia. Tenere il mouse in mani a coppa per 1 minuto e riportarlo nella sua gabbia.
2. 15 minuti dopo la manipolazione, procedere con la raccolta del sangue dalla vena sottomandibolare²².
3. Scollare saldamente il mouse in modo tale che la testa del mouse sia immobilizzata saldamente.
4. Individua il sito di foratura.
   1. C'è una piccola fossetta glatta lungo la mandibola del viso che può essere utilizzata come punto di riferimento per individuare il sito di puntura. Disegnando una linea tra la base della mascella e questa fossetta, il sito di puntura si trova dietro questa fossetta verso l'orecchio di circa 5 mm, appena dietro la cerniera della mascella.
5. Tenere un ago pulito da 23 G perpendicolare al sito di puntura e utilizzare un rapido movimento di lancing deciso. La punta dell'ago deve penetrare a una profondità compresa tra 1-2 mm, il sangue scorrerà immediatamente non appena la vena viene perforata.
6. Raccogliere ~ 150 μL di sangue in tubi di raccolta rivestiti di EDTA e conservare sul ghiaccio.
7. Applicare una leggera pressione con una garza sterile al sito di puntura per 5 s o più per consentire al sangue di coagulare.
8. Una volta che il sangue si è coagulato, riportare il topo nella sua gabbia di casa.
9. Centrifugare il sangue a 4 °C 3.500 x g per 10 min.
10. Decantare il surnatante.
11. Conservare il surnatante a -20 °C per le analisi a valle.
12. Misurare i livelli di corticosterone utilizzando un kit ELISA di corticosterone seguendo il protocollo del produttore.
13. Utilizzare uno spettrofotometro per leggere i risultati ELISA.

Risultati

Due studi separati sono stati condotti con topi C57BL/6. I #1 dello studio includevano maschi di 6 mesi e i #2 dello studio includevano femmine di 2,5 mesi (N = 36 / studio) dei Jackson Laboratories (Cat #000664). I topi sono arrivati nella struttura all'età di 2 mesi. Mentre le femmine #2 sono state maneggiate e testate due settimane dopo l'arrivo, i maschi #1 dello studio sono stati maneggiati e testati solo all'età di 6 mesi (ritardo dovuto alla chiusura della pandemia globale). Durante questo periodo, un topo dello...

Discussione

Questo studio e lo sviluppo del metodo si basano sull'osservazione che le tecniche di manipolazione nei topi sono ancora trascurate dalla comunità scientifica e che alcuni laboratori sono ancora riluttanti a implementare tecniche di assuefazione o manipolazione per ridurre lo stress e la reattività dei loro animali prima degli esperimenti. Pur rappresentando un impegno di tempo, la manipolazione degli animali fornisce effetti benefici agli animali che possono contribuire al successo degli esperimenti da eseguire e impe...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
23 G x 1 in. BD PrecisionGlide general use sterile hypodermic needle. Regular wall type and regular bevel.	BD	2546-CABD305145	Needles for Blood collection
BD Vacutainer® Venous Blood Collection EDTA Tubes with Lavender BD Hemogard™ closure, 2.0ml (13x75mm), 100/pk	BD	367841	EDTA Coated tubes for blood collection
Bed’o cobs ¼” Corn cob laboratory animal bedding	Bed-O-Cobs	BEDO1/4	Novel bedding for novelty suppressed feeding
Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5424 R	For centrifugation of blood.
Corticosterone ELISA Kit	Arbor Assays	K003-H1W
Digital Camera	Panasonic	HC-V770	Camera to record EPM/Experimenter interactions
Elevated Plus Maze	Home Made	n/a	Custom Maze made of four black Plexiglas arms (two open arms (29cm long by 7 cm wide) and two enclosed arms (29 cm long x7 cm wide with 16 cm tall walls)) that form a cross shape with the two open arms opposite to each other held 55 cm above the floor
Ethanol	Medstore House Brand	39753-P016-EA95	Dilute to 70% with Distilled water, for cleaning
Ethovision XT 15	Noldus	n/a	Automated animal tracking software
Laboratory Rodent Diet	LabDiet	Rodent Diet 5001	Standard Rodent diet
Memory Card	Kingstone Technology	SDA3/64GB	For video recording and file transfer
Novelty Suppressed Feeding Chamber	Home Made	n/a	Custom test plexiglass test chamber with clear floors and walls 62cm long, by 31cm wide by 40cm tall .
Parlycarbonate tubes	Home Made	n/a	13 cm in length and 5cm in diameter
Purina Yesterday’s news recycled newspaper bedding	Purina	n/a	Standard Bedding
Spectrophotometer	Biotek	Epoch Microplate Reader