نموذج موت الخلايا المبرمج العصبي الناجم عن ضغط الحبل الشوكي في الفئران

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لإنشاء نموذج ضغط الحبل الشوكي للفئران ، وتقييم درجاته السلوكية ، ومراقبة منطقة الحبل الشوكي المضغوط. أظهرت التقييمات السلوكية انخفاضا في الإعاقة الحركية للمراقبة. كشف تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين والتلوين المناعي عن موت الخلايا المبرمج العصبي الكبير في المنطقة المضغوطة من الحبل الشوكي.

Abstract

كمرض تنكسي تدريجي حاد ، فإن اعتلال النخاع الفقاري العنقي (CSM) له تشخيص ضعيف ويرتبط بالألم الجسدي ، والتصلب ، والخلل الحركي أو الحسي ، وخطر الإصابة بإصابة الحبل الشوكي والشلل الأطراف. وبالتالي ، هناك حاجة ماسة إلى الاستراتيجيات العلاجية التي تعزز تجديد الحبل الشوكي الفعال في هذا المرض المزمن والتقدمي. مطلوب نماذج ضغط الحبل الشوكي الحيوانية الفعالة والقابلة للتكرار لفهم الآلية البيولوجية المعقدة الكامنة وراء CSM. تعكس معظم نماذج إصابات الحبل الشوكي الظروف المدمرة الحادة والهيكلية ، في حين أن النماذج الحيوانية ل CSM تمثل ضغطا مزمنا في النخاع الشوكي. تقدم هذه الورقة بروتوكولا لإنشاء نموذج ضغط الحبل الشوكي للفئران ، والذي تم تقييمه بشكل أكبر من خلال تقييم النتيجة السلوكية ومراقبة منطقة الحبل الشوكي المضغوط. أظهرت التقييمات السلوكية انخفاضا في الإعاقة الحركية للمراقبة ، بما في ذلك حركات المفاصل ، والقدرة على الخطو ، والتنسيق ، واستقرار الجذع ، وقوة عضلات الأطراف. كشف تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين (H & E) والتلوين المناعي عن موت الخلايا المبرمج العصبي الكبير في المنطقة المضغوطة من الحبل الشوكي.

Introduction

كمرض تنكسي تدريجي شائع ، يمثل CSM 5-10٪ من جميع حالات داء الفقار العنقي¹. إذا تجاهل المرضى الذين يعانون من CSM أعراضهم وفشلوا في علاجها في الوقت المناسب وبطريقة فعالة ، فقد يؤدي ذلك إلى مضاعفات خطيرة ، مثل إصابة الحبل الشوكي وشلل الأطراف ، والتي قد تتدهور مع تقدم العمر ، مما يشكل عبئا اقتصاديا وعقليا كبيرا على المرضى وعائلاتهم^2،3. التسبب في CSM معقد ، ويتضمن عوامل ثابتة وديناميكية ، ونظرية نقص الأكسجة ونقص التروية ، وإصابة الخلايا البطانية ، ونظرية تدمير حاجز الحبل الشوكي الدموي ، ونظرية الالتهاب وموت الخلايا المبرمج^4،5،6،7.

تسبب الآليات الثابتة والديناميكية للضغط على الحبل الشوكي أعراضا سريرية. قد تتسبب الأقراص الفقرية البارزة والأجسام الفقرية المشوهة والأربطة المتكلسة في ضغط الحبل الشوكي لفترات طويلة ، مما سيؤثر تدريجيا على حاجز الحبل الشوكي الدموي والأوعية الدموية الدقيقة المحلية في النخاع^{الشوكي 4،8}. في المقابل ، يؤثر نقص التروية والالتهاب وموت الخلايا المبرمج على الخلايا العصبية والمحاور والخلايا الدبقية^6،9.

تشمل النماذج الحيوانية التجريبية لإصابة الحبل الشوكي الإصابة المعدية ، والإصابة الانضغاطية ، وإصابة الجر ، والإصابة الناجمة عن المواد الكيميائية الضوئية ، وإصابة نقص التروية وإعادة التروية. تعكس معظم هذه النماذج أيضا بعض الظروف المدمرة الحادة والهيكلية (القطع أو السمية الكيميائية). ومع ذلك ، لا يمكن لهذه النماذج الحيوانية من CSM أن تقدم موت الخلايا المبرمج العصبي التدريجي في النخاع الشوكي.

تصف هذه الورقة بروتوكولا مفصلا لإنشاء نموذج ضغط الحبل الشوكي للفئران ، والذي تم تقييمه بشكل أكبر من خلال تقييم النتيجة السلوكية ومراقبة المنطقة المضغوطة من الحبل الشوكي. يعد نموذج ضغط الحبل الشوكي للفئران نموذجا حيوانيا موثوقا به لمزيد من التحقيق في الآليات التي ينطوي عليها CSM.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم تنفيذ الإجراء التالي بموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) ، جامعة شنغهاي للطب الصيني التقليدي. تم إجراء جميع جراحات البقاء على قيد الحياة في ظل ظروف معقمة كما هو موضح في إرشادات المعاهد الوطنية للصحة. تمت إدارة الألم ومخاطر العدوى باستخدام المسكنات والمضادات الحيوية المناسبة لضمان نتيجة ناجحة. تم تحسين هذا الإجراء الجراحي لذكور Sprague-Dawley (SD) في عمر 12 أسبوعا ووزن 400 جرام.

1. تحضير هيدروجيل PVA-بولي أكريلاميد

ملاحظة: كما هو موضح في الشكل 1G ، 1H ، فإن هيدروجيل PVA-polyacrylamide عبارة عن لوح بوليمر ممتص للماء. في الحالة الطبيعية ، يصعب للغاية تقطيع الجل إلى قطع صغيرة. يتم وصف التحضير على النحو التالي.

1. ضع هيدروجيل PVA-polyacrylamide في الماء لمدة 24 ساعة لتسهيل القطع بعد الترطيب.
2. استخدم أداة قطع ذاتية الصنع (الشكل 1H) لتقسيم الهيدروجيل بالكامل إلى قطع بحجم 2 مم × 2 مم × 2 مم.
3. انقل قطع الهيدروجيل هذه إلى فرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 12 ساعة للتجفيف إلى قطع صغيرة من 1 مم × 1 مم × 1 مم كمواد زرع.

2. التخدير والتحضير

ملاحظة: تأكد من ارتداء قبعة جراحية وأقنعة طبية يمكن التخلص منها وقفازات جراحية معقمة طوال العملية الجراحية المعقمة.

1. ضع الجرذ على وسادة تدفئة ، وتأكد من الحفاظ على درجة حرارة المستقيم عند 37±1 درجة مئوية أثناء التخدير.
2. ضع الجرذ في حجرة التخدير المملوءة ب 3٪ أيزوفلوران لمدة 3 دقائق.
3. اضغط برفق على أطراف الجرذ وأصابع قدميه بالملاقط لاختبار فقدان استجابة الانسحاب ، مما يشير إلى التخدير الناجح.
4. ثبت الجرذ على طاولة العمليات في وضع الانبطاح ، مع التأكد من تثبيت أطراف ورأس الفئران بإحكام.
5. ثبت قناع التخدير على وجه الفئران. قم بإعطاء 2٪ إيزوفلوران في خليط الأكسجين / الهواء عبر قناع أنف الفئران القياسي لتخدير الجرذ طوال جراحة ضغط العمود الفقري.
6. ضع وسادة شاش أسطوانية (بحجم حوالي 30 مم × 20 مم × 60 مم) بين الجرذ وطاولة العمليات (الشكل 1 أ) لضمان مجرى الهواء دون عائق وموقع جراحي مكشوف بالكامل طوال الجراحة.
7. احلق الشعر حول المنطقة الجراحية من رقبة الجرذ باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية.
8. ضعي كريم إزالة الشعر لإزالة الشعر المتبقي وفضح الجلد.
9. تطهير منطقة الجراحة باليودوفور.
10. قم بتغطية المنطقة المطهرة بمنشفة معقمة بها ثقب يكشف فقط المنطقة الجراحية على الجانب الظهري من عنق الجرذ.

3. النهج الجراحي

1. قم بعمل شق طولي في خط الوسط الظهري بمشرط من العملية الشائكة العنقية الثانية إلى العملية الشائكة الصدرية الثانية ، بعد وضع العملية الشائكة العنقية الثانية عن طريق الجلد والعملية الشائكة الصدرية الثانية.
2. افصل عضلات كلا الجانبين بملقط مرقئ لفضح الصفيحة C2-T2 بعد قطع الأنسجة تحت الجلد واللفافة طبقة تلو الأخرى.
3. حفر حفرة (1 مم × 1 مم) على رقائق عنق الرحم (الشكل 1 ب).
   ملاحظة: لتجنب الإصابة المفرطة في الحبل الشوكي ، تأكد من الحفاظ على رقبة الجرذ في حالة القوس الظهري ، مما يتيح مساحة كافية بين صفيحات عنق الرحم.
4. استخدم ملقطا جراحيا مجهريا لإمساك قطعة من هيدروجيل PVA-polyacrylamide بحجم 1 مم × 1 مم × 1 مم وإدخالها في الحفرة المحفورة مسبقا (الشكل 1C ، 1D).
   ملاحظة: يشير أداء الوخز العابر إلى أن نموذج ضغط الحبل الشوكي قد تم إنشاؤه بنجاح.
5. خياطة العضلات واللفافة وتحت الجلد وأنسجة الجلد ، طبقة تلو الأخرى ، باستخدام إبر مثلثة وخياطة 5-0.
6. بعد التطهير ، انقل مرة أخرى إلى القفص واحتفظ بها دافئة.
7. حقن تسكين البوبرينورفين هيدروكلوريد تحت الجلد (0.03 مجم / كغ) كل 6 ساعات لمدة 3 أيام بعد الجراحة وحسب الحاجة بعد ذلك.

4. إدارة ما بعد الجراحة

1. حقن ما يعادل 100,000 وحدة من البنسلين داخل الصفاق في الفئران مرة واحدة يوميا لمنع العدوى بعد الجراحة وتخفيف الألم.
2. انقل الفئران إلى أقفاص جديدة تم تسخينها باستمرار باستخدام مصباح الأشعة تحت الحمراء لضمان الحفاظ على الحرارة بشكل كاف بعد الجراحة.
   ملاحظة: قم بإزالة مصباح التدفئة بعد استعادة وعي الفئران
3. الحفاظ على نظافة وتهوية قفص تغذية الفئران.
4. ساعد الفئران في الأكل والشرب مرتين في اليوم. إذا لزم الأمر ، قم بإجراء تدليك المثانة للمساعدة في التبول حتى يتم استعادة وظيفة المسالك البولية.

5. التقييم السلوكي

1. استخدم مقياس تصنيف Basso و Beattie و Bresnahan (BBB) لتقييم سلوك ما بعد الجراحة.
   ملاحظة: مقياس تصنيف BBB هو معيار ذهبي (الجدول 1) يستخدم لتقييم الوظيفة المتعلقة بالحبل الشوكي في الفئران. يقوم بتقييم حركة الفئران وفقا لدرجات تتراوح من 0 (لم يتم ملاحظة أي حركة للطرف الخلفي) إلى 21 (تنسيق المشي ، واتساق مساحة إصبع القدم ، وموضع المخلب الرئيسي الموازي في الموقف بأكمله ، واستقرار الجذع المتسق ، وارتفاع الذيل المتسق).

6. اختبار قوة القبضة

1. استخدم مقياس قوة القبضة الإلكتروني لقياس قوة القبضة.
2. أمسك النصف السفلي من الجرذ لتعليق الجرذ والسماح له بالامساك بالقضيب المعدني لمقياس القبضة الأمامي.
3. عندما يمسك الجرذ بالقضيب المعدني ، اسحبه بعيدا وسجل قوة القبضة.
4. قم بقياس قوة القبضة ثلاث مرات لكل فأر وسجل أعلى درجة.

7. اختبار لوحة مائلة

1. ضع الجرذ على صفيحة مطاطية بزاوية قابلة للتعديل.
2. ارفع زاوية الصفيحة المائلة تدريجيا بمقدار 5 درجات في كل مرة حتى يتمكن الجرذ من التوازن والثبات لمدة 5 ثوان.
3. سجل الزاوية القصوى التي يمكن للفأر أن يوازن بها نفسه على اللوحة المائلة.
4. قم بقياس الزاوية القصوى ثلاث مرات لكل فأر وسجل أعلى درجة.

8. القتل الرحيم ، وفصل الحبل الشوكي ، والتضمين المجمد

ملاحظة: تأكد من ارتداء نظارات العين المناسبة وواقي / قناع الوجه لحماية العينين والوجه والجهاز التنفسي من غاز بارافورمالدهيد وفورمالديهايد.

1. حقن ما يعادل 10٪ هيدرات الكلور داخل الصفاق لتخدير الفئران قبل فتح القص لفضح القلب.
2. أدخل إبرة التروية في قمة القلب ، وثبتها بالملقط المرقئ ، وقم بنقع المحلول الملحي العادي ببطء.
3. احفر ثقبا في الزائدة الأذينية اليمنى حتى يتدفق محلول ملحي طبيعي نظيف من الأذين الأيمن ، مما يشير إلى التسريب الناجح.
4. أوقف التروية المالحة الطبيعية بعد أن يتحول الكبد إلى اللون الأبيض.
5. ينقع بما يعادل 10٪ بارافورمالديهايد حتى يصبح جسم الفئران قاسيا.
6. بعد نضح بارافورمالديهايد ، قم بإزالة الجلد والعضلات والأنسجة الرخوة حول العمود الفقري ؛ فصل الجزء C2-C7 من العمود الفقري العنقي ؛ واغمرها في 10٪ بارافورمالدهيد للتثبيت طوال الليل.
7. افصل الحبل الشوكي العنقي عن العمود الفقري وضعه في تدرج تركيز 10٪ و 20٪ و 30٪ من محاليل السكروز للجفاف التدريجي.
8. انقل الحبل الشوكي المضغوط بارتفاع 2 مم مع عامل تضمين OCT إلى فريزر -80 درجة مئوية.
9. بعد التقسيم إلى شرائح بسمك 7 ميكرومتر والتلوين (تلطيخ H & E ووضع العلامات على نهاية النيك dUTP (TUNEL) / نوى الخلايا العصبية (NeuN) ، انظر القسم 9) ، لاحظ علم الأنسجة المرضي للحبل الشوكي وموت الخلايا المبرمج العصبي ، على التوالي.

9. تلغيم مناعي TUNEL / NeuN

1. اغمر أقسام الحبل الشوكي في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بتثبيته بمحلول PBS الذي يحتوي على 0.3٪ Triton X-100 و 5٪ ألبومين مصل بقري (BSA) لمدة 1 ساعة.
2. احتضان أقسام الحبل الشوكي بجسم مضاد متعدد النسيلة مضاد ل NeuN للأرانب (مخفف 1: 200 ؛) طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
3. اشطف أقسام الحبل الشوكي ثلاث مرات في PBS. بعد ذلك ، احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المترافقة Alexa Fluor 594 لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.
4. قم بإجراء مجموعة فحص موت الخلايا المبرمج TUNEL المكونة من خطوة واحدة (التألق الأخضر) لتلطيخ نوى موت الخلايا المبرمج لأقسام الحبل الشوكي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

قد تؤدي إصابة ضغط الحبل الشوكي إلى إعاقة عصبية عضلية في الأطراف
عندما تتوسع قطعة الهيدروجيل تدريجيا ، فإنها تضغط باستمرار على منطقة الحبل الشوكي لفترة طويلة ، مما يحاكي إعاقات الأطراف الأمامية الناجمة عن أمراض الحبل الشوكي^{العنقي 8،}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

كان الهدف من هذا الإجراء الجراحي هو توليد موت الخلايا المبرمج العصبي القابل للتكاثر والمطول في الحبل الشوكي للفئران. تتمثل الميزة الرئيسية لهذا النموذج في أن غرسات الهيدروجيل القابلة للتوسيع توفر ضغطا طويلا على الحبل الشوكي ، مما يؤدي إلى استجابة موت الخلايا المبرمج ا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic ointment			Prevent wound infection
Buprenorphine-SR			Pain relief
Isoflurane	Veteasy		Anesthesia
Inhalant anesthesia equipment			Anesthesia
Micro ophthalmic forceps	Mingren medical equipment	Length: 11 cm, Head diameter: 0.3 mm	Clip the muscle
Ophthalmic forceps	Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory	JD1050	Clip the skin
Ophthalmic scissors (10 cm)	Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory	Y00030	Skin incision
SD male rats	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd	SCXK2018-0004	Animal model
Sterile surgical blades (22#)	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	35T0707	Muscle incision
Small animal trimmer			Hair removal
Veet hair removal cream	RECKITT BENCKISER (India) Ltd		Hair removal
Venus shears	Mingren medical equipment	Length: 12.5 cm	Muscle incision