מודל אפופטוזיס עצבי המושרה על ידי דחיסת חוט השדרה בחולדה

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת מודל דחיסת חוט השדרה של חולדה, להעריך את הציון ההתנהגותי שלו ולהתבונן באזור חוט השדרה הדחוס. ההערכות ההתנהגותיות הראו ירידה בנכות המוטורית של המסך. צביעת המטוקסילין ואאוזין וצביעה חיסונית חשפו אפופטוזיס עצבי ניכר באזור הדחוס של חוט השדרה.

Abstract

כמחלה ניוונית פרוגרסיבית חמורה, למיאלופתיה ספונדילוטית צווארית (CSM) יש פרוגנוזה גרועה והיא קשורה לכאב פיזי, נוקשות, תפקוד מוטורי או תחושתי, וסיכון גבוה לפגיעה בחוט השדרה ושיתוק. לפיכך, יש צורך בדחיפות באסטרטגיות טיפוליות המקדמות התחדשות יעילה של חוט השדרה במחלה כרונית ומתקדמת זו. נדרשים מודלים יעילים וניתנים לשחזור של דחיסת חוט השדרה של בעלי חיים כדי להבין את המנגנון הביולוגי המורכב העומד בבסיס CSM. רוב המודלים של פגיעות בחוט השדרה משקפים מצבים הרסניים חריפים ומבניים, בעוד שמודלים של בעלי חיים של CSM מציגים דחיסה כרונית בחוט השדרה. מאמר זה מציג פרוטוקול ליצירת מודל דחיסת חוט השדרה של חולדות, שהוערך עוד יותר על ידי הערכת הציון ההתנהגותי והתבוננות באזור חוט השדרה הדחוס. ההערכות ההתנהגותיות הראו ירידה בנכות המוטורית של המסך, כולל תנועות מפרקים, יכולת צעד, קואורדינציה, יציבות תא המטען וחוזק שרירי הגפיים. צביעה וצביעה חיסונית של המטוקסילין ואאוזין (H&E) חשפו אפופטוזיס עצבי ניכר באזור הדחוס של חוט השדרה.

Introduction

כמחלה ניוונית פרוגרסיבית נפוצה, CSM מהווה 5-10% מכלל ספונדילוזיס צוואר הרחם¹. אם חולים הסובלים מ- CSM מתעלמים מהתסמינים שלהם ולא מטפלים בהם בזמן וביעילות, הדבר עלול להוביל לסיבוכים חמורים, כגון פגיעה בחוט השדרה ושיתוק גפיים, אשר יתדרדר עם ההזדקנות, ויהווה נטל כלכלי ונפשי משמעותי על החולים ^ובני משפחותיהם. הפתוגנזה של CSM היא מורכבת, וכוללת גורמים סטטיים ודינמיים, תיאוריית ההיפוקסיה-איסכמיה, פגיעה בתאי אנדותל, תיאוריית הרס מחסום חוט השדרה בדם ותאוריית הדלקת והאפופטוזיס 4,5,6,7.

המנגנונים הסטטיים והדינמיים של דחיסה על חוט השדרה גורמים לתסמינים קליניים. דיסקים בולטים של חוליות, גופי חוליות מעוותים ורצועות מסויידות עלולים לגרום לדחיסה ממושכת של חוט השדרה, אשר תשפיע בהדרגה על מחסום הדם-חוט השדרה ועל מיקרו-כלי דם מקומיים בחוט השדרה ^4,8. בתורם, איסכמיה, דלקת ואפופטוזיס משפיעים על הנוירונים, האקסונים ותאי הגליה ^6,9.

המודלים הניסיוניים של בעלי חיים של פגיעה בחוט השדרה כוללים פגיעה חובשתית, פגיעה דחיסה, פגיעה במתיחה, פגיעה הנגרמת על ידי פוטוכימיה ופגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה. רוב המודלים הללו משקפים גם כמה תנאים הרסניים אקוטיים ומבניים (טרנסקציה או רעילות כימית). עם זאת, מודלים בעלי חיים אלה של CSM אינם יכולים להציג אפופטוזיס עצבי מתקדם בחוט השדרה.

מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט ליצירת מודל דחיסת חוט השדרה של חולדות, אשר הוערך עוד יותר על ידי הערכת הציון ההתנהגותי והתבוננות באזור הדחוס של חוט השדרה. מודל דחיסת חוט השדרה של חולדה הוא מודל חיות אמין לחקירה נוספת של המנגנונים המעורבים ב- CSM.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ההליך הבא בוצע באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC), אוניברסיטת שנחאי לרפואה סינית מסורתית. כל ניתוחי ההישרדות בוצעו בתנאים סטריליים כפי שמתואר בהנחיות ה-NIH. הכאב והסיכון לזיהומים נוהלו באמצעות משככי כאבים ואנטיביוטיקה מתאימים כדי להבטיח תוצאה מוצלחת. הליך כירורגי זה מותאם לחולדות זכרים של Sprague-Dawley (SD) בגיל 12 שבועות ומשקל של 400 גרם.

1. הכנת הידרוג'ל PVA-פוליאקרילאמיד

הערה: כפי שמוצג באיור 1G, 1H, ההידרוג'ל PVA-polyacrylamide הוא יריעת פולימר סופגת מים. במצב הטבעי, קשה מאוד לחתוך את הג'ל לחתיכות קטנות. ההכנה מתוארת כדלקמן.

1. הניחו הידרוג'ל PVA-פוליאקרילאמיד במים למשך 24 שעות כדי להקל על החיתוך לאחר הידרציה.
2. השתמשו בכלי חיתוך מתוצרת עצמית (איור 1H) כדי לחלק את כל ההידרוג'ל לחתיכות, בגודל 2 מ"מ x 2 מ"מ x 2 מ"מ.
3. העבירו את חתיכות ההידרוג'ל הללו לתנור בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות לייבוש לחתיכות קטנות של 1 מ"מ x 1 מ"מ x 1 מ"מ כחומרי השתלה.

2. הרדמה והכנה

הערה: הקפד לחבוש כובע כירורגי, מסכות רפואיות חד פעמיות וכפפות כירורגיות סטריליות לאורך כל התהליך הכירורגי הסטרילי.

1. הניחו את החולדה על כרית חימום, וודאו שטמפרטורת פי הטבעת נשמרת על 37±1 מעלות צלזיוס במהלך ההרדמה.
2. הכניסו את החולדה לתא ההרדמה המלא באיזופלורן 3% למשך 3 דקות.
3. צבט בעדינות את הגפיים והבהונות של החולדה בפינצטה כדי לבדוק אובדן תגובת נסיגה, מה שמעיד על הרדמה מוצלחת.
4. קבע את החולדה על שולחן הניתוחים במצב נוטה, וודא שהגפיים וראש החולדה קבועים היטב.
5. תקן את מסכת ההרדמה לפנים של החולדה. יש לתת איזופלורן 2% בתערובת חמצן/אוויר באמצעות מסכת אף רגילה של חולדה כדי להרדים את החולדה לאורך כל ניתוח דחיסת עמוד השדרה.
6. הנח כרית גזה גלילית (גודל של כ-30 מ"מ x 20 מ"מ x 60 מ"מ) בין החולדה לשולחן הניתוחים (איור 1A) כדי להבטיח דרכי נשימה ללא הפרעה ואתר ניתוח חשוף לחלוטין לאורך כל הניתוח.
7. לגלח את השיער סביב אזור הניתוח של צוואר החולדה בעזרת מכונת גילוח חשמלית.
8. מרחו קרם אפילציה כדי להסיר את שאריות השיער ולחשוף את העור.
9. לחטא את אזור הניתוח ביודופור.
10. יש לכסות את האזור המחוטא במגבת סטרילית עם חור החושף רק את אזור הניתוח בצד הגבי של צוואר החולדה.

3. גישה כירורגית

1. בצע חתך אורכי בקו האמצע הגבי בעזרת אזמל מהתהליך הקוצני הצווארי השני לתהליך הקוצני השני של בית החזה, לאחר מיקום מלעורי של התהליך הקוצני השני של צוואר הרחם והתהליך הקוצני השני של בית החזה.
2. הפרד את השרירים משני הצדדים בעזרת מלקחיים המוסטטיים כדי לחשוף את הלמינה C2-T2 לאחר חיתוך רקמה תת עורית ופאשיה שכבה אחר שכבה.
3. קדחו חור (1 מ"מ x 1 מ"מ) על למינרית צוואר הרחם (איור 1B).
   הערה: כדי למנוע פציעה מוגזמת בחוט השדרה, ודא שצוואר החולדה נשמר במצב קשת גבי, המאפשר מרווח מספיק בין למינות צוואר הרחם.
4. השתמש במלקחיים מיקרו-כירורגיים כדי לתפוס חתיכה של הידרוג'ל PVA-פוליאקרילאמיד בגודל של 1 מ"מ x 1 מ"מ x 1 מ"מ והכנס אותה לתוך החור שנקדח קודם לכן (איור 1C, 1D).
   הערה: ביצועי עוויתות חולפות מצביעים על כך שמודל דחיסת חוט השדרה הוקם בהצלחה.
5. לתפור את רקמות השריר, הפאשיה, התת עורי והעור, שכבה אחר שכבה, באמצעות מחטים משולשות ותפר 5-0.
6. לאחר החיטוי, העבירו את בעלי החיים בחזרה לכלוב ושמרו על חום.
7. יש להזריק משככי כאבים בופרנורפין הידרוכלוריד (0.03 מ"ג/ק"ג) כל 6 שעות במשך 3 ימים לאחר הניתוח ולפי הצורך לאחר מכן.

4. ניהול לאחר הניתוח

1. הזריק שווה ערך ל-100,000 יחידות של פניצילין תוך צפקי לחולדות פעם ביום כדי למנוע זיהום לאחר הניתוח ולהקל על הכאב.
2. העבירו את החולדות לכלובים חדשים שחוממו ברציפות עם מנורת אינפרא אדום כדי להבטיח שימור חום נאות לאחר הניתוח.
   הערה: הסר את החימום lamp לאחר שחזור ההכרה של החולדה
3. שמרו על היגיינה ואוורור של כלוב ההאכלה של החולדה.
4. עזרו לחולדות באכילה ושתייה פעמיים ביום. במידת הצורך, יש לבצע עיסוי שלפוחית השתן כדי לסייע במתן שתן עד לשיקום תפקוד השתן.

5. הערכה התנהגותית

1. השתמש בסולם הדירוג Basso, Beattie ו-Bresnahan (BBB) כדי להעריך התנהגות לאחר הניתוח.
   הערה: סולם דירוג BBB הוא תקן זהב (טבלה 1) המשמש להערכת תפקוד הקשור לחוט השדרה בחולדות. הוא מעריך את תנועת החולדות על פי ציונים הנעים בין 0 (לא נצפתה תנועת גפיים אחוריות) ל-21 (תיאום הליכה, עקביות מרחב הבוהן, מיקום טופר ראשי מקביל בכל היציבה, יציבות עקבית של תא המטען וגובה זנב עקבי).

6. מבחן חוזק אחיזה

1. השתמש במד חוזק אחיזה אלקטרוני כדי למדוד את חוזק האחיזה.
2. תפוס את החצי התחתון של החולדה כדי לתלות את החולדה ולאפשר לה לתפוס את מוט המתכת של מד האחיזה הקדמי.
3. כאשר החולדה אוחזת במוט המתכת, משוך אותו ורשום את חוזק האחיזה.
4. מדוד את חוזק האחיזה שלוש פעמים עבור כל חולדה ורשום את הציון הגבוה ביותר.

7. מבחן צלחת נוטה

1. הניחו את החולדה על צלחת גומי עם זווית מתכווננת.
2. הרם בהדרגה את זווית הצלחת המשופעת ב-5 מעלות בכל פעם עד שהחולדה מצליחה לאזן ולעמוד איתן במשך 5 שניות.
3. רשום את הזווית המקסימלית שבה החולדה יכולה לאזן את עצמה על הצלחת המשופעת.
4. מדוד את הזווית המקסימלית שלוש פעמים עבור כל חולדה ורשום את הציון הגבוה ביותר.

8. המתת חסד, הפרדת חוט השדרה והטבעה קפואה

הערה: ודא כי משקפי ראייה ומגן/מסכה מתאימים נלבשים כדי להגן על העיניים, הפנים ודרכי הנשימה מפני פרפורמלדהיד וגז פורמלדהיד.

1. הזריק שווה ערך ל-10% כלורל הידרט תוך צפקי כדי להרדים את החולדות לפני פתיחת עצם החזה כדי לחשוף את הלב.
2. הכניסו מחט זלוף לקודקוד הלב, קבעו אותה בעזרת מלקחיים המוסטטיים והחדירו לאט לאט מי מלח רגילים.
3. קדחו חור בתוספתן הפרוזדורים הימני עד שתמיסת מלח רגילה ונקייה תזרום מהפרוזדור הימני, מה שמעיד על עירוי מוצלח.
4. הפסק את הזלוף הרגיל של מי מלח לאחר שהכבד הופך ללבן.
5. יש להחדיר כמות שוות ערך ל-10% פרפורמלדהיד עד שגוף החולדה הופך נוקשה.
6. לאחר זלוף פרפורמלדהיד, הסר את העור, השרירים והרקמות הרכות סביב עמוד השדרה; להפריד את קטע C2-C7 בעמוד השדרה הצווארי; ולטבול אותו ב-10% פרפורמלדהיד לקיבוע בן לילה.
7. הפרד את חוט השדרה הצווארי מעמוד השדרה והנח אותו בשיפוע ריכוז של 10%, 20% ו-30% תמיסות סוכרוז להתייבשות הדרגתית.
8. העבירו את חוט השדרה הדחוס בגובה 2 מ"מ יחד עם חומר הטמעת OCT למקפיא של -80 מעלות צלזיוס.
9. לאחר חיתוך לפרוסות בעובי 7 מיקרומטר וצביעה (צביעת H&E ותיוג קצה ניק dUTP (TUNEL)/גרעינים עצביים (NeuN), ראה סעיף 9), התבונן בהיסטופתולוגיה של חוט השדרה ואפופטוזיס עצבי, בהתאמה.

9. צביעה חיסונית של TUNEL/NeuN

1. טבלו את חלקי חוט השדרה בתמיסת מלח עם פוספט (PBS) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן חסמו עם תמיסת PBS המכילה 0.3% טריטון X-100 ו-5% אלבומין בסרום בקר (BSA) למשך שעה.
2. דגרו על קטעי חוט השדרה עם נוגדן אנטי-NeuN רב-שבטי של ארנב (מדולל 1:200;) למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
3. שטפו את חלקי חוט השדרה שלוש פעמים ב- PBS. לאחר מכן יש לדגור עם נוגדנים משניים מצומדים של Alexa Fluor 594 למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
4. בצע את ערכת בדיקת האפופטוזיס של TUNEL בשלב אחד (פלואורסצנטי ירוק) כדי לצבוע את הגרעינים האפופטוטיים של קטעי חוט השדרה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

פגיעה בדחיסה של חוט השדרה עלולה להוביל לנכות עצבית-שרירית בגפיים
כאשר חתיכת ההידרוג'ל מתרחבת בהדרגה, היא דוחסת בהתמדה את אזור חוט השדרה לתקופה ממושכת, המדמה את נכויות הגפיים הקדמיות הנגרמות על ידי מחלות חוט השדרה הצווארי ^8,10. במ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מטרת הליך כירורגי זה הייתה ליצור אפופטוזיס עצבי ממושך וניתן לשחזור בחוט השדרה של החולדה. יתרון מרכזי של מודל זה הוא ששתלי ההידרוג'ל הניתנים להרחבה מספקים דחיסה ממושכת על חוט השדרה, ובכך מובילים לתגובה אפופטוטית עצבית מתקדמת (איור 2C), העולה בקנה אחד עם התה?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic ointment			Prevent wound infection
Buprenorphine-SR			Pain relief
Isoflurane	Veteasy		Anesthesia
Inhalant anesthesia equipment			Anesthesia
Micro ophthalmic forceps	Mingren medical equipment	Length: 11 cm, Head diameter: 0.3 mm	Clip the muscle
Ophthalmic forceps	Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory	JD1050	Clip the skin
Ophthalmic scissors (10 cm)	Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory	Y00030	Skin incision
SD male rats	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd	SCXK2018-0004	Animal model
Sterile surgical blades (22#)	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	35T0707	Muscle incision
Small animal trimmer			Hair removal
Veet hair removal cream	RECKITT BENCKISER (India) Ltd		Hair removal
Venus shears	Mingren medical equipment	Length: 12.5 cm	Muscle incision