쥐에서 척수 압박에 의해 유도된 신경 세포 사멸 모델

요약

여기에서는 쥐의 척수 압박 모델을 생성하고, 행동 점수를 평가하고, 압박된 척수 영역을 관찰하는 프로토콜을 제시합니다. 행동 평가는 모니터 운동 장애가 감소한 것으로 나타났습니다. 헤마톡실린(Hematoxylin)과 에오신 염색(eosin staining) 및 면역염색(immunostaining)은 척수의 압박 부위에서 상당한 신경세포 자멸사(neuronal apoptosis)를 밝혀냈습니다.

초록

경추 척추 척수병증(CSM)은 중증의 진행성 퇴행성 질환으로 예후가 좋지 않으며 신체적 통증, 뻣뻣함, 운동 또는 감각 기능 장애, 척수 손상 및 고관절리증의 위험이 높습니다. 따라서 이 만성 및 진행성 질환에서 효율적인 척수 재생을 촉진하는 치료 전략이 시급히 필요합니다. CSM의 기저에 있는 복잡한 생물학적 메커니즘을 이해하기 위해서는 효과적이고 재현 가능한 동물 척수 압박 모델이 필요합니다. 대부분의 척수 손상 모델은 급성 및 구조적 파괴 상태를 반영하는 반면, CSM의 동물 모델은 척수의 만성적인 압박을 나타냅니다. 이 논문은 쥐의 척수 압박 모델을 생성하는 프로토콜을 제시하며, 이는 행동 점수를 평가하고 압박된 척수 영역을 관찰하여 추가로 평가되었습니다. 행동 평가에서는 관절 움직임, 스테핑 능력, 협응력, 몸통 안정성 및 사지 근력을 포함한 모니터 운동 장애가 감소한 것으로 나타났습니다. 헤마톡실린(Hematoxylin)과 에오신(eosin, H&E) 염색 및 면역염색 결과, 척수의 압박 부위에서 상당한 신경세포 사멸(neuronal apoptosis)이 밝혀졌습니다.

서문

흔한 진행성 퇴행성 질환인 CSM은 모든 경추증의 5-10%를 차지합니다¹. CSM을 앓고 있는 환자가 증상을 무시하고 적시에 효과적인 방식으로 치료하지 못할 경우, 척수 손상 및 사지 마비와 같은 심각한 합병증이 발생할 수 있으며, 이는 노화에 따라 악화되어 환자와 그 가족에게 상당한 경제적, 정신적 부담을 줄 수 있습니다 ^2,3. CSM의 발병 기전은 정적 요인과 동적 요인, 저산소증-허혈 이론, 내피 세포 손상, 혈수 장벽 파괴 이론, 염증 및 세포사멸 이론 ^4,5,6,7 등을 포함하는 복잡합니다.

척수에 가해지는 압박의 정적 및 동적 메커니즘은 임상 증상을 유발합니다. 돌출된 척추 디스크, 기형적인 척추체 및 석회화된 인대는 장기간의 척수 압박을 유발할 수 있으며, 이는 척수의 혈액-척수 장벽과 국소 미세혈관 구조에 점차적으로 영향을 미칠 수 있습니다 ^4,8. 차례로 허혈, 염증 및 세포사멸은 뉴런, 축삭 및 신경교세포에 영향을 미칩니다 ^6,9.

척수 손상의 실험 동물 모델에는 타박상 손상, 압박 손상, 견인 손상, 광화학 유발 손상 및 허혈-재관류 손상이 포함됩니다. 이러한 모델의 대부분은 또한 일부 급성 및 구조적 파괴 조건(절제 또는 화학적 독성)을 반영합니다. 그러나 이러한 CSM의 동물 모델은 척수에 진행성 신경 세포 사멸을 나타낼 수 없습니다.

이 논문은 쥐의 척수 압박 모델을 생성하기 위한 자세한 프로토콜을 설명하며, 이는 행동 점수를 평가하고 척수의 압박 영역을 관찰하여 추가로 평가되었습니다. 이 쥐의 척수 압박 모델은 CSM과 관련된 메커니즘에 대한 추가 연구를 위한 신뢰할 수 있는 동물 모델입니다.

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프로토콜

다음 절차는 상하이 중국 전통 의학 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받아 수행되었습니다. 모든 생존 수술은 NIH 지침에 명시된 멸균 상태에서 수행되었습니다. 통증과 감염 위험은 성공적인 결과를 보장하기 위해 적절한 진통제와 항생제로 관리되었습니다. 이 수술 절차는 생후 12주와 체중 400g의 Sprague-Dawley(SD) 근친 수컷 쥐에 최적화되어 있습니다.

1. PVA-폴리아크릴아미드 하이드로겔 제제

참고: 그림 1G, 1H에서 볼 수 있듯이 PVA-폴리아크릴아미드 하이드로겔은 수분을 흡수하는 폴리머 시트입니다. 자연 상태에서 젤은 작은 조각으로 자르는 것이 매우 어렵습니다. 제제는 다음과 같이 설명됩니다.

1. PVA-폴리아크릴아미드 하이드로겔을 물에 24시간 동안 넣어 수화 후 쉽게 절단할 수 있습니다.
2. 자체 제작 절단 도구(그림 1H)를 사용하여 전체 하이드로겔을 2mm x 2mm x 2mm 크기의 조각으로 나눕니다.
3. 이 하이드로겔 조각을 60°C의 오븐에서 12시간 동안 옮겨 탈수시켜 1mm x 1mm x 1mm의 작은 조각으로 주입 재료로 만듭니다.

2. 마취 및 준비

참고: 멸균 수술 과정 내내 수술용 모자, 일회용 의료용 마스크, 멸균 수술용 장갑을 착용하십시오.

1. 쥐를 가열 패드에 놓고 마취 중에 직장 온도가 37±1 °C로 유지되는지 확인합니다.
2. 쥐를 3% 이소플루란으로 채워진 마취실에 3분 동안 놓습니다.
3. 핀셋으로 쥐의 팔다리와 발가락을 부드럽게 꼬집어 금단 반응 상실을 테스트하면 성공적인 마취를 나타냅니다.
4. 쥐를 엎드린 자세로 수술대에 고정하고 쥐의 팔다리와 머리가 단단히 고정되었는지 확인하십시오.
5. 마취 마스크를 쥐의 얼굴에 고정하십시오. 척추 압박 수술 전반에 걸쳐 쥐를 마취하기 위해 표준 쥐 코 마스크를 통해 산소/공기 혼합물에 2% 이소플루란을 투여합니다.
6. 쥐와 수술대(그림 1A) 사이에 원통형 거즈 패드(약 30mm x 20mm x 60mm 크기)를 놓아 수술 내내 기도가 막히지 않고 수술 부위가 완전히 노출되도록 합니다.
7. 전기 면도기로 쥐의 목 수술 부위 주위의 털을 면도합니다.
8. 제모 크림을 바르면 남은 털을 제거하고 피부가 드러납니다.
9. 요오드로 수술 부위를 소독하십시오.
10. 소독된 부위를 멸균 수건으로 덮고 구멍이 뚫려 있어 쥐 목의 등쪽 수술 부위만 노출시킵니다.

3. 외과적 접근법

1. 두 번째 경추 척추 돌기와 두 번째 흉추 돌기를 경피적으로 배치한 후 두 번째 경추 가시돌기에서 두 번째 흉추돌기로 메스로 등쪽 정중선을 세로로 절개합니다.
2. Blunt는 피하 조직과 근막을 층별로 절단한 후 C2-T2 층을 노출시키기 위해 지혈 겸자로 양쪽의 근육을 분리합니다.
3. 경추 층류에 구멍(1mm x 1mm)을 뚫습니다(그림 1B).
   알림: 척수에 과도한 부상을 입지 않으려면 쥐의 목이 등쪽 아치 상태로 유지되어 경추 얇은 판 사이에 충분한 공간이 있는지 확인하십시오.
4. 미세수술 겸자를 사용하여 1mm x 1mm x 1mm 크기의 PVA-폴리아크릴아미드 하이드로겔 조각을 잡고 이전에 뚫린 구멍에 삽입합니다(그림 1C, 1D).
   참고: 일시적인 경련 성능은 척수 압박 모델이 성공적으로 설정되었음을 나타냅니다.
5. 근육, 근막, 피하 및 피부 조직을 삼각형 바늘과 5-0 봉합사를 사용하여 층별로 봉합합니다.
6. 소독 후 동물을 우리로 다시 옮기고 따뜻하게 유지하십시오.
7. 부프레노르핀 염산염 진통제(0.03mg/kg)를 수술 후 3일간 6시간 간격으로 피하주사하고 그 후 필요에 따라 투여합니다.

4. 수술 후 관리

1. 하루에 한 번 100,000 단위의 페니실린을 복강내 주사하여 수술 후 감염을 예방하고 통증을 완화합니다.
2. 수술 후 적절한 열 보존을 보장하기 위해 적외선 램프로 지속적으로 가열된 새 케이지로 쥐를 옮깁니다.
   알림: 쥐의 의식이 회복된 후 난방 램프를 제거하십시오.
3. 쥐의 먹이 케이지의 위생과 환기를 유지하십시오.
4. 쥐가 하루에 두 번 먹고 마시는 것을 도와주세요. 필요한 경우 소변 기능이 회복될 때까지 배뇨를 돕기 위해 방광 마사지를 실시합니다.

5. 행동 평가

1. BBB(Basso, Beattie 및 Bresnahan) 평가 척도를 사용하여 수술 후 행동을 평가합니다.
   참고: BBB 등급 척도는 쥐의 척수 관련 기능을 평가하는 데 사용되는 황금 표준(표 1)입니다. 0(뒷다리 움직임이 관찰되지 않음)에서 21(보행 협응, 발가락 공간 일관성, 전체 자세에서 평행한 주요 발톱 위치, 일관된 몸통 안정성 및 일관된 꼬리 높이)까지의 점수에 따라 쥐의 움직임을 평가합니다.

6. 악력 시험

1. 전자 그립 강도 측정기를 사용하여 그립 강도를 측정하십시오.
2. 쥐의 아래쪽 절반을 잡아 쥐를 매달고 전면 그립 미터의 금속 막대를 잡을 수 있도록 합니다.
3. 쥐가 금속 막대를 잡으면 당겨서 그립 강도를 기록하십시오.
4. 각 쥐의 악력을 세 번 측정하고 가장 높은 점수를 기록합니다.

7. 경사판 시험

1. 각도를 조절할 수 있는 고무판에 쥐를 놓습니다.
2. 쥐가 균형을 잡고 5초 동안 단단히 서 있을 때까지 매번 경사판 각도를 5°씩 점차적으로 높입니다.
3. 쥐가 경사판에서 균형을 잡을 수 있는 최대 각도를 기록하십시오.
4. 각 쥐에 대해 최대 각도를 세 번 측정하고 가장 높은 점수를 기록합니다.

8. 안락사, 척수 분리 및 동결 임베딩

알림: 파라포름알데히드 및 포름알데히드 가스로부터 눈, 얼굴 및 호흡기를 보호하기 위해 적절한 눈 고글과 안면 보호대/마스크를 착용하십시오.

1. 10% 클로랄 수화물에 해당하는 것을 복강내에 주입하여 쥐를 마취한 후 흉골을 열어 심장을 노출시킵니다.
2. 관류 바늘을 심장 정점에 삽입하고 지혈 겸자로 고정한 다음 일반 식염수를 천천히 주입합니다.
3. 깨끗한 생리식염수가 우심방에서 흘러나올 때까지 우심방 부속기에 구멍을 뚫어 성공적인 주입을 나타냅니다.
4. 간이 하얗게 변한 후 정상적인 식염수 관류를 중단하십시오.
5. 쥐의 몸이 뻣뻣해질 때까지 10% 상당의 파라포름알데히드를 주입합니다.
6. 파라포름알데히드 관류 후 척추 주변의 피부, 근육 및 연조직을 제거합니다. 경추의 C2-C7 분절을 분리한다. 그리고 하룻밤 동안 고정을 위해 10% 파라포름알데히드에 담그십시오.
7. 척추에서 경추를 분리하고 점진적인 탈수를 위해 10%, 20% 및 30% 자당 용액의 농도 구배에 놓습니다.
8. 2mm 높이의 압축된 척수를 OCT 임베딩제와 함께 -80°C 냉동고에 옮깁니다.
9. 7μm 두께의 절편으로 절편화하고 염색(H&E 염색 및 dUTP 닉 엔드 라벨링(TUNEL)/뉴런 핵(NeuN), 섹션 9 참조)한 후 각각 척수 및 신경 세포 사멸의 조직 병리학을 관찰합니다.

9. TUNEL/NeuN 면역 염색

1. 척수 절편을 실온에서 10분 동안 인산염 완충 식염수(PBS)에 담근 다음 0.3% Triton X-100 및 5% 소 혈청 알부민(BSA)이 함유된 PBS 용액으로 1시간 동안 차단합니다.
2. 4°C에서 하룻밤 동안 rabbit polyclonal anti-NeuN anti-NeuN antibody(1:200;)로 척수 절편을 배양합니다.
3. PBS에서 척수 부분을 세 번 헹굽니다. 그 후 실온에서 2시간 동안 Alexa Fluor 594 복합 2차 항체를 배양합니다.
4. 원스텝 TUNEL 세포사멸 분석 키트(녹색 형광)를 수행하여 척수 절편의 자가사멸핵을 염색합니다.

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결과

척수 압박 손상은 사지의 신경근 장애로 이어질 수 있습니다.
하이드로겔 조각이 점진적으로 팽창함에 따라 장기간 동안 척수 부위를 지속적으로 압박하여 경추 척수 질환으로 인한 앞다리 장애를 시뮬레이션합니다 ^8,10. 현재 모델에서는 모델 그룹의 대부분의 쥐(9/10)에서 상당한 동측 앞발 구축이 관찰되었습니...

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토론

이 수술 절차의 목표는 쥐의 척수에 재현 가능하고 장기간의 신경 사멸을 생성하는 것이었습니다. 이 모델의 주요 장점은 팽창성 하이드로겔 임플란트가 척수를 장기간 압박하여 CSM의 병리학적 과정과 일치하는 점진적인 신경 세포사멸 반응을 유도한다는 것입니다(그림 2C). 본 연구에서 척수 손상으로 인한 사망률은 극히 낮았지만(50명 중 ~2명), 이...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic ointment			Prevent wound infection
Buprenorphine-SR			Pain relief
Isoflurane	Veteasy		Anesthesia
Inhalant anesthesia equipment			Anesthesia
Micro ophthalmic forceps	Mingren medical equipment	Length: 11 cm, Head diameter: 0.3 mm	Clip the muscle
Ophthalmic forceps	Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory	JD1050	Clip the skin
Ophthalmic scissors (10 cm)	Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory	Y00030	Skin incision
SD male rats	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd	SCXK2018-0004	Animal model
Sterile surgical blades (22#)	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	35T0707	Muscle incision
Small animal trimmer			Hair removal
Veet hair removal cream	RECKITT BENCKISER (India) Ltd		Hair removal
Venus shears	Mingren medical equipment	Length: 12.5 cm	Muscle incision