Sıçanlarda Omurilik Sıkışmasının Neden Olduğu Bir Nöronal Apoptoz Modeli

Özet

Burada, bir sıçan omurilik kompresyon modeli oluşturmak, davranışsal skorunu değerlendirmek ve sıkıştırılmış omurilik bölgesini gözlemlemek için bir protokol sunuyoruz. Davranışsal değerlendirmeler monitör motor özürlülüğünün azaldığını gösterdi. Hematoksilen ve eozin boyaması ve immün boyama, omuriliğin basılmış bölgesinde önemli nöronal apoptozu ortaya çıkardı.

Özet

Ciddi ilerleyici bir dejeneratif hastalık olan servikal spondilotik miyelopati (CSM) kötü bir prognoza sahiptir ve fiziksel ağrı, sertlik, motor veya duyusal disfonksiyon ve yüksek omurilik yaralanması ve akroparaliz riski ile ilişkilidir. Bu nedenle, bu kronik ve ilerleyici hastalıkta verimli omurilik rejenerasyonunu destekleyen terapötik stratejilere acilen ihtiyaç vardır. CSM'nin altında yatan karmaşık biyolojik mekanizmayı anlamak için etkili ve tekrarlanabilir hayvan omuriliği kompresyon modelleri gereklidir. Çoğu omurilik yaralanması modeli akut ve yapısal yıkıcı durumları yansıtırken, CSM'nin hayvan modelleri omurilikte kronik bir kompresyon gösterir. Bu makale, davranışsal skorun değerlendirilmesi ve sıkıştırılmış omurilik bölgesinin gözlemlenmesiyle daha fazla değerlendirilen bir sıçan omurilik kompresyon modeli oluşturmak için bir protokol sunmaktadır. Davranışsal değerlendirmeler, eklem hareketleri, adım atma yeteneği, koordinasyon, gövde stabilitesi ve uzuv kas gücü dahil olmak üzere monitör motor sakatlığının azaldığını gösterdi. Hematoksilen ve eozin (H&E) boyaması ve immün boyama, omuriliğin sıkışmış bölgesinde önemli nöronal apoptozu ortaya çıkardı.

Giriş

Yaygın bir ilerleyici dejeneratif hastalık olan CSM, tüm servikal spondilozların %5-10'unu oluşturur¹. CSM'den muzdarip hastalar semptomlarını görmezden gelir ve bunları zamanında ve etkili bir şekilde tedavi etmezlerse, bu durum omurilik yaralanması ve uzuv felci gibi yaşlanmayla birlikte kötüleşecek ciddi komplikasyonlara yol açarak hastalar ve aileleri için önemli bir ekonomik ve zihinsel yük oluşturabilir ^2,3. CSM'nin patogenezi karmaşıktır, statik ve dinamik faktörleri, hipoksi-iskemi teorisini, endotel hücre hasarını, kan omurilik bariyeri yıkım teorisini ve inflamasyon ve apoptoz teorisini içerir 4,5,6,7.

Omuriliğe basının statik ve dinamik mekanizmaları klinik belirtilere neden olur. Çıkıntılı omur diskleri, deforme olmuş omur gövdeleri ve kalsifiye ligamentler, uzun süreli omurilik sıkışmasına neden olabilir, bu da kan-omurilik bariyerini ve omurilikteki lokal mikrovaskülatürü kademeli olarak etkileyecektir ^4,8. Buna karşılık, iskemi, iltihaplanma ve apoptoz nöronları, aksonları ve glial hücreleri^{etkiler 6,9}.

Omurilik yaralanmasının deneysel hayvan modelleri arasında kontüzif yaralanma, kompresyon yaralanması, traksiyon yaralanması, fotokimyasal kaynaklı yaralanma ve iskemi-reperfüzyon yaralanması bulunur. Bu modellerin çoğu aynı zamanda bazı akut ve yapısal yıkıcı koşulları (transeksiyon veya kimyasal toksisite) yansıtır. Bununla birlikte, CSM'nin bu hayvan modelleri omurilikte ilerleyici nöronal apoptoz gösteremez.

Bu makale, davranışsal skoru değerlendirerek ve omuriliğin sıkıştırılmış bölgesini gözlemleyerek daha fazla değerlendirilen bir sıçan omurilik kompresyon modeli oluşturmak için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır. Bu sıçan omurilik kompresyon modeli, CSM'de yer alan mekanizmaların daha fazla araştırılması için güvenilir bir hayvan modelidir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Aşağıdaki prosedür, Şanghay Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin (IACUC) onayı ile gerçekleştirildi. Tüm sağkalım ameliyatları, NIH kılavuzlarında belirtildiği gibi steril koşullar altında gerçekleştirildi. Ağrı ve enfeksiyon riski, başarılı bir sonuç elde etmek için uygun analjezikler ve antibiyotiklerle yönetildi. Bu cerrahi prosedür, 12 haftalık ve 400 g ağırlığındaki Sprague-Dawley (SD) soylu erkek sıçanlar için optimize edilmiştir.

1. PVA-poliakrilamid hidrojel hazırlama

NOT: Şekil 1G, 1H'de gösterildiği gibi, PVA-poliakrilamid hidrojel su emici bir polimer levhadır. Doğal durumda, jelin küçük parçalara ayrılması son derece zordur. Hazırlık aşağıdaki gibi tarif edilmiştir.

1. Hidrasyondan sonra kesmeyi kolaylaştırmak için bir PVA-poliakrilamid hidrojeli 24 saat suya koyun.
2. Tüm hidrojeli 1 mm x 2 mm x 2 mm boyutlarında parçalara bölmek için kendi kendine yapılan bir kesme aleti (Şekil 2H) kullanın.
3. Bu hidrojel parçalarını, implantasyon malzemeleri olarak 1 mm x 1 mm x 1 mm'lik küçük parçalar halinde dehidrasyon için 12 saat boyunca 60 °C'de bir fırına aktarın.

2. Anestezi ve hazırlık

NOT: Steril cerrahi süreç boyunca cerrahi başlık, tek kullanımlık tıbbi maske ve steril cerrahi eldiven taktığınızdan emin olun.

1. Fareyi bir ısıtma yastığına yerleştirin ve anestezi sırasında rektal sıcaklığın 37±1 ° C'de tutulduğundan emin olun.
2. Fareyi 3 dakika boyunca% 3 izofluran ile doldurulmuş anestezi odasına yerleştirin.
3. Geri çekilme tepkisi kaybını test etmek için farenin uzuvlarını ve ayak parmaklarını cımbızla nazikçe sıkıştırın, bu da başarılı bir anestezi olduğunu gösterir.
4. Sıçanı ameliyat masasına yüzüstü pozisyonda sabitleyin, sıçanın uzuvlarının ve başının sıkıca sabitlendiğinden emin olun.
5. Anestezi maskesini farenin yüzüne sabitleyin. Spinal kompresyon ameliyatı boyunca fareyi uyuşturmak için standart bir sıçan burun maskesi aracılığıyla bir oksijen / hava karışımında% 2 izofluran uygulayın.
6. Ameliyat boyunca engelsiz bir hava yolu ve tamamen açıkta kalan cerrahi bölge sağlamak için sıçan ile ameliyat masası arasına silindirik bir gazlı bez (yaklaşık 30 mm x 20 mm x 60 mm boyutunda) yerleştirin (Şekil 1A).
7. Sıçanın boynunun cerrahi alanının etrafındaki kılları elektrikli bir tıraş makinesiyle tıraş edin.
8. Kalan tüyleri çıkarmak ve cildi açığa çıkarmak için tüy dökücü krem uygulayın.
9. Cerrahi bölgeyi iyodofor ile dezenfekte edin.
10. Dezenfekte edilmiş alanı, sıçanın boynunun sadece sırt tarafındaki cerrahi alanı açığa çıkaran bir delik bulunan steril bir havluyla örtün.

3. Cerrahi yaklaşım

1. İkinci servikal spinöz süreci ve ikinci torasik spinöz süreci perkütan olarak konumlandırdıktan sonra, ikinci servikal spinöz süreçten ikinci torasik spinöz sürece bir neşter ile dorsal orta hatta uzunlamasına bir kesi yapın.
2. Deri altı dokusunu ve fasyayı katman katman kestikten sonra C2-T2 laminasını ortaya çıkarmak için her iki tarafın kaslarını hemostatik forseps ile künt olarak ayırın.
3. Servikal laminer üzerine bir delik (1 mm x 1 mm) açın (Şekil 1B).
   NOT: Omurilikte aşırı yaralanmayı önlemek için, sıçanın boynunun servikal laminalar arasında yeterli boşluk bırakarak dorsal kemer durumunda tutulduğundan emin olun.
4. 1 mm x 1 mm x 1 mm boyutunda bir PVA-poliakrilamid hidrojel parçasını kavramak için mikrocerrahi forseps kullanın ve önceden delinmiş deliğe yerleştirin (Şekil 1C, 1D).
   NOT: Geçici seğirme performansı, omurilik kompresyon modelinin başarıyla kurulduğunu gösterir.
5. Kas, fasya, deri altı ve cilt dokularını üçgen iğneler ve 5-0 sütür kullanarak katman katman dikin.
6. Dezenfeksiyondan sonra hayvanları tekrar kafese aktarın ve sıcak tutun.
7. Ameliyattan sonraki 3 gün boyunca her 6 saatte bir ve daha sonra gerektiği gibi deri altına buprenorfin hidroklorür analjezi (0.03 mg / kg) enjekte edin.

4. Ameliyat sonrası yönetim

1. Postoperatif enfeksiyonu önlemek ve ağrıyı hafifletmek için sıçanlara günde bir kez intraperitoneal olarak 100.000 ünite penisilin eşdeğeri enjekte edin.
2. Ameliyat sonrası yeterli ısı korumasını sağlamak için fareleri kızılötesi lamba ile sürekli ısıtılan yeni kafeslere aktarın.
   NOT: Farenin bilinci yerine geldikten sonra ısıtma lambasını çıkarın
3. Sıçanın besleme kafesinin hijyenini ve havalandırmasını sağlayın.
4. Farelere günde iki kez yemek yeme ve içme konusunda yardımcı olun. Gerekirse, idrar fonksiyonu eski haline gelene kadar idrara çıkmaya yardımcı olmak için bir mesane masajı uygulayın.

5. Davranışsal değerlendirme

1. Ameliyat sonrası davranışı değerlendirmek için Basso, Beattie ve Bresnahan (BBB) derecelendirme ölçeğini kullanın.
   NOT: BBB derecelendirme ölçeği, sıçanlarda omurilik ile ilgili işlevi değerlendirmek için kullanılan altın bir standarttır (Tablo 1). Sıçanların hareketini 0 (arka bacak hareketi gözlenmedi) ile 21 (yürüyüş koordinasyonu, ayak boşluğu tutarlılığı, tüm duruşa paralel ana pençe pozisyonu, tutarlı gövde stabilitesi ve tutarlı kuyruk yüksekliği) arasında değişen skorlara göre değerlendirir.

6. Kavrama gücü testi

1. Kavrama gücünü ölçmek için elektronik bir kavrama gücü ölçer kullanın.
2. Fareyi askıya almak için farenin alt yarısını tutun ve ön kavrama ölçerin metal çubuğunu tutmasına izin verin.
3. Sıçan metal çubuğu kavradığında, onu çekin ve kavrama gücünü kaydedin.
4. Her sıçan için kavrama gücünü üç kez ölçün ve en yüksek puanı kaydedin.

7. Eğimli plaka testi

1. Fareyi ayarlanabilir bir açıya sahip lastik bir plaka üzerine yerleştirin.
2. Sıçan dengede kalmayı ve 5 saniye boyunca sağlam durmayı başarana kadar eğimli plaka açısını her seferinde 5° kademeli olarak yükseltin.
3. Sıçanın eğimli plaka üzerinde kendini dengeleyebileceği maksimum açıyı kaydedin.
4. Her sıçan için maksimum açıyı üç kez ölçün ve en yüksek puanı kaydedin.

8. Ötenazi, omurilik ayrılması ve donmuş gömme

NOT: Gözleri, yüzü ve solunum yollarını paraformaldehit ve formaldehit gazından korumak için uygun gözlük ve yüz siperi/maskesinin takıldığından emin olun.

1. Kalbi açığa çıkarmak için sternumu açmadan önce sıçanları uyuşturmak için intraperitoneal olarak% 10 kloral hidrat eşdeğeri enjekte edin.
2. Kalbin tepesine bir perfüzyon iğnesi yerleştirin, hemostatik forseps ile sabitleyin ve yavaşça normal salin ile demleyin.
3. Sağ atriyumdan temiz normal salin akana kadar sağ atriyal apendiks üzerinde bir delik açın, bu da başarılı bir infüzyonu gösterir.
4. Karaciğer beyaza döndükten sonra normal salin perfüzyonunu durdurun.
5. Sıçanın vücudu sertleşene kadar% 10 eşdeğeri paraformaldehit ile demleyin.
6. Paraformaldehit perfüzyonundan sonra omurga çevresindeki cildi, kasları ve yumuşak dokuları çıkarın; servikal omurganın C2-C7 segmentini ayırın; ve gece boyunca sabitlemek için% 10 paraformaldehite daldırın.
7. Servikal omuriliği omurgadan ayırın ve kademeli dehidrasyon için %10, %20 ve %30 sükroz çözeltileri konsantrasyon gradyanına yerleştirin.
8. 2 mm yüksekliğindeki sıkıştırılmış omuriliği bir OCT gömme maddesi ile birlikte -80 ° C'lik bir dondurucuya aktarın.
9. 7 μm kalınlığında dilimlere ayrıldıktan ve boyandıktan sonra (H&E boyama ve dUTP çentik ucu etiketleme (TUNEL)/nöronal çekirdekler (NeuN), bkz. bölüm 9), sırasıyla omurilik histopatolojisini ve nöronal apoptozu gözlemleyin.

9. TUNEL/NeuN immün boyama

1. Omurilik bölümlerini oda sıcaklığında 10 dakika boyunca fosfat tamponlu salin (PBS) içine daldırın, ardından 1 saat boyunca% 0.3 Triton X-100 ve% 5 sığır serum albümini (BSA) içeren PBS çözeltisi ile bloke edin.
2. Omurilik bölümlerini bir tavşan poliklonal anti-NeuN antikoru (1:200 seyreltilmiş) ile gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
3. Omurilik bölümlerini PBS'de üç kez durulayın. Daha sonra, oda sıcaklığında 2 saat boyunca Alexa Fluor 594-konjuge ikincil antikorlarla inkübe edin.
4. Omurilik bölümlerinin apoptotik çekirdeklerini boyamak için tek adımlı TUNEL apoptoz test kitini (yeşil floresan) gerçekleştirin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Omurilik basınç yaralanması uzuvlarda nöromüsküler sakatlığa yol açabilir
Hidrojel parçası kademeli olarak genişledikçe, omurilik bölgesini uzun süre kalıcı olarak sıkıştırır, bu da servikal omurilik hastalıklarının neden olduğu ön ayak sakatlıklarını simüle eder ^8,10. Mevcut modelde, model grubundaki sıçanların çoğunda (9/10) önemli ipsilateral ön pençe kontraktürü gö...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu cerrahi prosedürün amacı, sıçan omuriliğinde tekrarlanabilir, uzun süreli, nöral apoptoz oluşturmaktı. Bu modelin önemli bir avantajı, genişletilebilir hidrojel implantların omurilik üzerinde uzun süreli bir kompresyon sağlaması ve böylece CSM'nin patolojik süreci ile tutarlı olan ilerleyici bir nöral apoptotik yanıta yol açmasıdır (Şekil 2C). Mevcut çalışmada, omurilik yaralanmasından kaynaklanan mortalite son derece düş?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic ointment			Prevent wound infection
Buprenorphine-SR			Pain relief
Isoflurane	Veteasy		Anesthesia
Inhalant anesthesia equipment			Anesthesia
Micro ophthalmic forceps	Mingren medical equipment	Length: 11 cm, Head diameter: 0.3 mm	Clip the muscle
Ophthalmic forceps	Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory	JD1050	Clip the skin
Ophthalmic scissors (10 cm)	Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory	Y00030	Skin incision
SD male rats	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd	SCXK2018-0004	Animal model
Sterile surgical blades (22#)	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	35T0707	Muscle incision
Small animal trimmer			Hair removal
Veet hair removal cream	RECKITT BENCKISER (India) Ltd		Hair removal
Venus shears	Mingren medical equipment	Length: 12.5 cm	Muscle incision