Un modèle d’apoptose neuronale induit par la compression de la moelle épinière chez le rat

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour générer un modèle de compression de la moelle épinière chez le rat, évaluer son score comportemental et observer la région de la moelle épinière comprimée. Les évaluations comportementales ont montré une diminution de l’incapacité motrice du moniteur. La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine et l’immunocoloration ont révélé une apoptose neuronale considérable dans la région comprimée de la moelle épinière.

Résumé

En tant que maladie dégénérative progressive sévère, la myélopathie spondylotique cervicale (MCS) a un mauvais pronostic et est associée à des douleurs physiques, à une raideur, à un dysfonctionnement moteur ou sensoriel et à un risque élevé de lésion de la moelle épinière et d’acroparalysie. Ainsi, il est urgent de mettre en place des stratégies thérapeutiques favorisant une régénération efficace de la moelle épinière dans cette maladie chronique et évolutive. Des modèles efficaces et reproductibles de compression de la moelle épinière animale sont nécessaires pour comprendre le mécanisme biologique complexe sous-jacent à la MCS. La plupart des modèles de lésions de la moelle épinière reflètent des conditions destructrices aiguës et structurelles, tandis que les modèles animaux de CSM présentent une compression chronique de la moelle épinière. Cet article présente un protocole pour générer un modèle de compression de la moelle épinière chez le rat, qui a été évalué en évaluant le score comportemental et en observant la région de la moelle épinière comprimée. Les évaluations comportementales ont montré une diminution de l’incapacité motrice du moniteur, y compris les mouvements articulaires, la capacité de marche, la coordination, la stabilité du tronc et la force musculaire des membres. La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) et l’immunocoloration ont révélé une apoptose neuronale considérable dans la région comprimée de la moelle épinière.

Introduction

En tant que maladie dégénérative progressive courante, la MCS représente 5 à 10 % de toutes les spondylose cervicales¹. Si les patients souffrant de MCS ignorent leurs symptômes et ne les traitent pas rapidement et efficacement, cela pourrait entraîner de graves complications, telles que des lésions de la moelle épinière et une paralysie des membres, qui se détérioreraient avec l’âge, ce qui constituerait un fardeau économique et mental substantiel pour les patients et leurs^familles2,3. La pathogenèse de la CSM est complexe, impliquant des facteurs statiques et dynamiques, la théorie de l’hypoxie-ischémie, les lésions des cellules endothéliales, la théorie de la destruction de la barrière vertébrale sanguine et la théorie de l’inflammation et de l’apoptose 4,5,6,7.

Les mécanismes statiques et dynamiques de compression sur la moelle épinière provoquent des symptômes cliniques. Des disques vertébraux saillants, des corps vertébraux déformés et des ligaments calcifiés peuvent provoquer une compression prolongée de la moelle épinière, qui affectera progressivement la barrière hémato-moépinière et la microvascularisation locale de la moelle épinière ^4,8. À leur tour, l’ischémie, l’inflammation et l’apoptose affectent les neurones, les axones et les cellules gliales ^6,9.

Les modèles animaux expérimentaux de lésions de la moelle épinière comprennent les lésions contusives, les lésions compressives, les lésions de traction, les lésions photochimiques et les lésions d’ischémie-reperfusion. La plupart de ces modèles reflètent également des conditions destructrices aiguës et structurelles (section ou toxicité chimique). Cependant, ces modèles animaux de CSM ne peuvent pas présenter d’apoptose neuronale progressive dans la moelle épinière.

Cet article décrit un protocole détaillé pour générer un modèle de compression de la moelle épinière du rat, qui a été évalué en évaluant le score comportemental et en observant la région compressée de la moelle épinière. Ce modèle de compression de la moelle épinière du rat est un modèle animal fiable pour une étude plus approfondie des mécanismes impliqués dans la MCS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

La procédure suivante a été réalisée avec l’approbation du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Shanghai. Toutes les chirurgies de survie ont été effectuées dans des conditions stériles telles que décrites par les directives du NIH. La douleur et le risque d’infections ont été gérés à l’aide d’analgésiques et d’antibiotiques appropriés pour assurer un résultat positif. Cette intervention chirurgicale est optimisée pour les rats mâles consanguins Sprague-Dawley (SD) à l’âge de 12 semaines et pesant 400 g.

1. Préparation de l’hydrogel PVA-polyacrylamide

REMARQUE : Comme le montre la figure 1G, 1H, l’hydrogel PVA-polyacrylamide est une feuille de polymère absorbant l’eau. À l’état naturel, le gel est extrêmement difficile à couper en petits morceaux. La préparation est décrite comme suit.

1. Placez un hydrogel de PVA-polyacrylamide dans l’eau pendant 24 h pour faciliter la coupe après hydratation.
2. À l’aide d’un outil de coupe fabriqué par vos soins (Figure 1H), vous divisez l’ensemble de l’hydrogel en morceaux de 2 mm x 2 mm x 2 mm.
3. Transférez ces morceaux d’hydrogel dans un four à 60 °C pendant 12 h pour les déshydrater en petits morceaux de 1 mm x 1 mm x 1 mm comme matériaux d’implantation.

2. Anesthésie et préparation

REMARQUE : Assurez-vous de porter un bonnet chirurgical, des masques médicaux jetables et des gants chirurgicaux stériles tout au long du processus chirurgical stérile.

1. Placez le rat sur un coussin chauffant et assurez-vous que la température rectale est maintenue à 37±1 °C pendant l’anesthésie.
2. Placez le rat dans la chambre d’anesthésie remplie d’isoflurane à 3 % pendant 3 min.
3. Pincez doucement les membres et les orteils du rat avec une pince à épiler pour tester la perte de réponse de retrait, indiquant une anesthésie réussie.
4. Fixez le rat sur la table d’opération en position couchée, en vous assurant que les membres et la tête du rat sont fermement fixés.
5. Fixez le masque d’anesthésie sur le visage du rat. Administrer de l’isoflurane à 2 % dans un mélange d’oxygène et d’air à l’aide d’un masque nasal standard pour anesthésier le rat tout au long de la chirurgie de compression vertébrale.
6. Placez un tampon de gaze cylindrique (d’environ 30 mm x 20 mm x 60 mm) entre le rat et la table d’opération (Figure 1A) pour assurer que les voies respiratoires ne soient pas obstruées et que le site chirurgical soit entièrement exposé tout au long de la chirurgie.
7. Rasez les poils autour de la zone chirurgicale du cou du rat avec un rasoir électrique.
8. Appliquez une crème dépilante pour enlever les poils restants et exposer la peau.
9. Désinfectez la zone chirurgicale avec de l’iodophore.
10. Couvrez la zone désinfectée avec une serviette stérile avec un trou n’exposant que la zone chirurgicale sur la face dorsale du cou du rat.

3. Approche chirurgicale

1. Faites une incision longitudinale dans la ligne médiane dorsale avec un scalpel de la deuxième apophyse épineuse cervicale à la deuxième apophyse épineuse thoracique, après avoir positionné par voie percutanée la deuxième apophyse épineuse cervicale et la deuxième apophyse épineuse thoracique.
2. Blunt sépare les muscles des deux côtés avec une pince hémostatique pour exposer la lame C2-T2 après avoir coupé le tissu sous-cutané et le fascia couche par couche.
3. Percez un trou (1 mm x 1 mm) sur la lame cervicale (Figure 1B).
   REMARQUE : Pour éviter des blessures excessives sur la moelle épinière, assurez-vous que le cou du rat est maintenu dans un état d’arc dorsal, en laissant suffisamment d’espace entre les lames cervicales.
4. À l’aide d’une pince microchirurgicale, saisissez un morceau d’hydrogel PVA-polyacrylamide de 1 mm x 1 mm x 1 mm et insérez-le dans le trou précédemment percé (figures 1C, 1D).
   REMARQUE : Les performances de contraction transitoire indiquent que le modèle de compression de la moelle épinière a été établi avec succès.
5. Suturez les tissus musculaires, fasciales et cutanés, couche par couche, à l’aide d’aiguilles triangulaires et de sutures 5-0.
6. Après la désinfection, transférez les animaux dans la cage et gardez-les au chaud.
7. Injecter par voie sous-cutanée un analgésique au chlorhydrate de buprénorphine (0,03 mg/kg) toutes les 6 heures pendant 3 jours après la chirurgie et au besoin par la suite.

4. Prise en charge postopératoire

1. Injecter l’équivalent de 100 000 unités de pénicilline par voie intrapéritonéale chez les rats une fois par jour pour prévenir l’infection postopératoire et soulager la douleur.
2. Transférez les rats dans de nouvelles cages qui ont été chauffées en continu avec une lampe infrarouge pour assurer une conservation adéquate de la chaleur postopératoire.
   REMARQUE : Retirez la lampe chauffante une fois que le rat a repris conscience
3. Maintenir l’hygiène et la ventilation de la cage d’alimentation du rat.
4. Aidez les rats à manger et à boire deux fois par jour. Si nécessaire, administrez un massage de la vessie pour aider à la miction jusqu’à ce que la fonction urinaire soit rétablie.

5. Évaluation comportementale

1. Utilisez l’échelle d’évaluation Basso, Beattie et Bresnahan (BBB) pour évaluer le comportement postopératoire.
   REMARQUE : L’échelle d’évaluation de la BHE est un étalon-or (tableau 1) utilisé pour évaluer la fonction liée à la moelle épinière chez les rats. Il évalue le mouvement des rats en fonction de scores allant de 0 (aucun mouvement des membres postérieurs n’a été observé) à 21 (coordination de la marche, cohérence de l’espace des orteils, position des griffes principales parallèle dans toute la posture, stabilité constante du tronc et élévation constante de la queue).

6. Test de force de préhension

1. Utilisez un indicateur électronique de la force de préhension pour mesurer la force de préhension.
2. Saisissez la moitié inférieure du rat pour suspendre le rat et lui permettre d’attraper la tige métallique du compteur de poignée avant.
3. Lorsque le rat saisit la tige métallique, retirez-la et notez la force de préhension.
4. Mesurez la force de préhension trois fois pour chaque rat et notez le score le plus élevé.

7. Test de plaque inclinée

1. Placez le rat sur une plaque en caoutchouc avec un angle réglable.
2. Augmentez progressivement l’angle de la plaque inclinée de 5° à chaque fois jusqu’à ce que le rat parvienne à s’équilibrer et à rester ferme pendant 5 s.
3. Notez l’angle maximum auquel le rat peut se tenir en équilibre sur la plaque inclinée.
4. Mesurez l’angle maximum trois fois pour chaque rat et notez le score le plus élevé.

8. Euthanasie, séparation de la moelle épinière et intégration congelée

REMARQUE : Assurez-vous de porter des lunettes de protection et un écran facial/masque appropriés pour protéger les yeux, le visage et les voies respiratoires du paraformaldéhyde et du gaz formaldéhyde.

1. Injectez l’équivalent de 10 % d’hydrate de chloral par voie intrapéritonéale pour anesthésier les rats avant d’ouvrir le sternum pour exposer le cœur.
2. Insérez une aiguille de perfusion dans l’apex du cœur, fixez-la avec une pince hémostatique et perférez lentement avec une solution saline normale.
3. Percez un trou sur l’appendice auriculaire droit jusqu’à ce qu’une solution saline normale et propre s’écoule de l’oreillette droite, indiquant une perfusion réussie.
4. Arrêtez la perfusion saline normale après que le foie devienne blanc.
5. Infuser avec l’équivalent de 10 % de paraformaldéhyde jusqu’à ce que le corps du rat devienne ferme.
6. Après la perfusion de paraformaldéhyde, retirez la peau, les muscles et les tissus mous autour de la colonne vertébrale ; séparer le segment C2-C7 de la colonne cervicale ; et immergez-le dans 10 % de paraformaldéhyde pour la fixation pendant la nuit.
7. Séparez la moelle épinière cervicale de la colonne vertébrale et placez-la dans un gradient de concentration de 10 %, 20 % et 30 % de solutions de saccharose pour une déshydratation progressive.
8. Transférez la moelle épinière comprimée de 2 mm de hauteur avec un agent d’enrobage OCT dans un congélateur à -80 °C.
9. Après coupe en tranches de 7 m d’épaisseur et coloration (coloration H&E et marquage dUTP nick end (TUNEL)/noyaux neuronaux (NeuN), voir rubrique 9), observez l’histopathologie de la moelle épinière et l’apoptose neuronale, respectivement.

9. Immunomarquage TUNEL/NeuN

1. Immerger les sections de la moelle épinière dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 10 min à température ambiante, puis bloquer avec une solution de PBS contenant 0,3 % de Triton X-100 et 5 % d’albumine sérique bovine (BSA) pendant 1 h.
2. Incuber les sections de la moelle épinière avec un anticorps polyclonal anti-NeuN de lapin (dilué 1:200 ;) pendant la nuit à 4 °C.
3. Rincez les sections de la moelle épinière trois fois dans PBS. Ensuite, incuber avec des anticorps secondaires conjugués à Alexa Fluor 594 pendant 2 h à température ambiante.
4. Effectuez le kit de test d’apoptose TUNEL en une étape (fluorescence verte) pour colorer les noyaux apoptotiques des sections de la moelle épinière.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Une lésion compressive de la moelle épinière peut entraîner une invalidité neuromusculaire dans les membres
Au fur et à mesure que la pièce d’hydrogel se dilate progressivement, elle comprime de manière persistante la région de la moelle épinière pendant une période prolongée, ce qui simule les handicaps des membres antérieurs induits par les maladies de la moelle épinière cervicale ^8,10. Dan...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Le but de cette intervention chirurgicale était de générer une apoptose neurale reproductible et prolongée dans la moelle épinière du rat. L’un des principaux avantages de ce modèle est que les implants d’hydrogel expansibles assurent une compression prolongée sur la moelle épinière, conduisant ainsi à une réponse apoptotique neurale progressive (Figure 2C), ce qui est cohérent avec le processus pathologique de la MCS. Dans l’étude actuel...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic ointment			Prevent wound infection
Buprenorphine-SR			Pain relief
Isoflurane	Veteasy		Anesthesia
Inhalant anesthesia equipment			Anesthesia
Micro ophthalmic forceps	Mingren medical equipment	Length: 11 cm, Head diameter: 0.3 mm	Clip the muscle
Ophthalmic forceps	Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory	JD1050	Clip the skin
Ophthalmic scissors (10 cm)	Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory	Y00030	Skin incision
SD male rats	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd	SCXK2018-0004	Animal model
Sterile surgical blades (22#)	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	35T0707	Muscle incision
Small animal trimmer			Hair removal
Veet hair removal cream	RECKITT BENCKISER (India) Ltd		Hair removal
Venus shears	Mingren medical equipment	Length: 12.5 cm	Muscle incision