Un modelo de apoptosis neuronal inducida por la compresión de la médula espinal en ratas

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para generar un modelo de compresión de la médula espinal en ratas, evaluar su puntuación de comportamiento y observar la región de la médula espinal comprimida. Las evaluaciones conductuales mostraron una disminución de la discapacidad motora del monitor. La tinción e inmunotinción de hematoxilina y eosina reveló una apoptosis neuronal considerable en la región comprimida de la médula espinal.

Resumen

Como enfermedad degenerativa progresiva grave, la mielopatía espondilótica cervical (MSC) tiene un mal pronóstico y se asocia con dolor físico, rigidez, disfunción motora o sensorial y un alto riesgo de lesión de la médula espinal y acroparálisis. Por lo tanto, se necesitan con urgencia estrategias terapéuticas que promuevan la regeneración eficiente de la médula espinal en esta enfermedad crónica y progresiva. Se requieren modelos de compresión de la médula espinal animal efectivos y reproducibles para comprender el complejo mecanismo biológico subyacente a la CSM. La mayoría de los modelos de lesión medular reflejan condiciones agudas y estructurales destructivas, mientras que los modelos animales de MSC presentan una compresión crónica en la médula espinal. En este trabajo se presenta un protocolo para generar un modelo de compresión de la médula espinal en ratas, el cual se evaluó posteriormente mediante la evaluación de la puntuación conductual y la observación de la región de la médula espinal comprimida. Las evaluaciones conductuales mostraron una disminución de la discapacidad motora del monitor, incluidos los movimientos articulares, la capacidad de paso, la coordinación, la estabilidad del tronco y la fuerza muscular de las extremidades. La tinción e inmunotinción con hematoxilina y eosina (H&E) reveló una apoptosis neuronal considerable en la región comprimida de la médula espinal.

Introducción

Como enfermedad degenerativa progresiva común, la MSC representa el 5-10% de toda la espondilosis cervical¹. Si los pacientes que padecen MSC ignoran sus síntomas y no los tratan de manera oportuna y eficaz, esto podría conducir a complicaciones graves, como lesión de la médula espinal y parálisis de las extremidades, que se deteriorarían con el envejecimiento, lo que representaría una carga económica y mental sustancial para los pacientes y sus familias ^2,3. La patogenia de la MSC es compleja e involucra factores estáticos y dinámicos, la teoría de la hipoxia-isquemia, la lesión de las células endoteliales, la teoría de la destrucción de la barrera de la médula espinal sanguínea y la teoría de la inflamación y la apoptosis 4,5,6,7.

Los mecanismos estáticos y dinámicos de compresión sobre la médula espinal causan síntomas clínicos. Los discos vertebrales protuberantes, los cuerpos vertebrales deformes y los ligamentos calcificados pueden causar una compresión prolongada de la médula espinal, que afectará gradualmente la barrera hemato-medular y la microvasculatura local en la médula espinal ^4,8. A su vez, la isquemia, la inflamación y la apoptosis afectan a las neuronas, los axones y las células gliales ^6,9.

Los modelos animales experimentales de lesión de la médula espinal incluyen lesión contusiva, lesión por compresión, lesión por tracción, lesión inducida por fotoquímicos y lesión por isquemia-reperfusión. La mayoría de estos modelos también reflejan algunas condiciones destructivas agudas y estructurales (transección o toxicidad química). Sin embargo, estos modelos animales de MSC no pueden presentar apoptosis neuronal progresiva en la médula espinal.

En este artículo se describe un protocolo detallado para generar un modelo de compresión de la médula espinal en ratas, que se evaluó posteriormente mediante la evaluación de la puntuación conductual y la observación de la región comprimida de la médula espinal. Este modelo de compresión de la médula espinal de rata es un modelo animal fiable para la investigación posterior de los mecanismos implicados en la CSM.

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Protocolo

El siguiente procedimiento se realizó con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shanghai. Todas las cirugías de supervivencia se realizaron en condiciones estériles según lo descrito en las pautas de los NIH. El dolor y el riesgo de infecciones se trataron con analgésicos y antibióticos apropiados para garantizar un resultado exitoso. Este procedimiento quirúrgico está optimizado para ratas macho exogámicas Sprague-Dawley (SD) a las 12 semanas de edad y 400 g de peso.

1. Preparación de hidrogel de PVA-poliacrilamida

NOTA: Como se muestra en la Figura 1G, 1H, el hidrogel de PVA-poliacrilamida es una lámina de polímero que absorbe agua. En estado natural, el gel es extremadamente difícil de cortar en trozos pequeños. La preparación se describe a continuación.

1. Colocar un hidrogel de PVA-poliacrilamida en agua durante 24 h para facilitar el corte después de la hidratación.
2. Utilice una herramienta de corte de fabricación propia (Figura 1H) para dividir todo el hidrogel en trozos, de 2 mm x 2 mm x 2 mm.
3. Transfiera estas piezas de hidrogel a un horno a 60 °C durante 12 h para su deshidratación en trozos pequeños de 1 mm x 1 mm x 1 mm como materiales de implantación.

2. Anestesia y preparación

NOTA: Asegúrese de usar un gorro quirúrgico, mascarillas médicas desechables y guantes quirúrgicos estériles durante todo el proceso quirúrgico estéril.

1. Coloque la rata sobre una almohadilla térmica y asegúrese de que la temperatura rectal se mantenga a 37±1 °C durante la anestesia.
2. Coloque la rata en la cámara de anestesia llena de isoflurano al 3% durante 3 min.
3. Pellizca suavemente las extremidades y los dedos de los pies de la rata con pinzas para probar la pérdida de la respuesta de retirada, lo que indica que la anestesia ha sido exitosa.
4. Fije la rata en la mesa de operaciones en posición prona, asegurándose de que las extremidades y la cabeza de la rata estén firmemente fijadas.
5. Fije la máscara de anestesia a la cara de la rata. Administre isoflurano al 2% en una mezcla de oxígeno y aire a través de una máscara nasal estándar para anestesiar a la rata durante la cirugía de compresión espinal.
6. Coloque una gasa cilíndrica (del tamaño de aproximadamente 30 mm x 20 mm x 60 mm) entre la rata y la mesa de operaciones (Figura 1A) para garantizar una vía respiratoria sin obstrucciones y un sitio quirúrgico completamente expuesto durante toda la cirugía.
7. Afeita el vello alrededor del área quirúrgica del cuello de la rata con una afeitadora eléctrica.
8. Aplica crema depilatoria para eliminar el vello restante y exponer la piel.
9. Desinfectar la zona quirúrgica con yodóforo.
10. Cubra el área desinfectada con una toalla estéril con un orificio que exponga solo el área quirúrgica en el lado dorsal del cuello de la rata.

3. Abordaje quirúrgico

1. Realizar una incisión longitudinal en la línea media dorsal con un bisturí desde la segunda apófisis espinosa cervical hasta la segunda apófisis espinosa torácica, después de posicionar percutáneamente la segunda apófisis espinosa cervical y la segunda apófisis espinosa torácica.
2. Separar los músculos de ambos lados con pinzas hemostáticas para exponer la lámina C2-T2 después de cortar el tejido subcutáneo y la fascia capa por capa.
3. Taladre un orificio (1 mm x 1 mm) en la lámina cervical (Figura 1B).
   NOTA: Para evitar lesiones excesivas en la médula espinal, asegúrese de que el cuello de la rata se mantenga en un estado de arco dorsal, dejando suficiente espacio entre las láminas cervicales.
4. Con pinzas microquirúrgicas se agarra un trozo de hidrogel de PVA-poliacrilamida de 1 mm x 1 mm x 1 mm y se introduce en el orificio previamente perforado (Figura 1C, 1D).
   NOTA: El rendimiento de los espasmos transitorios indica que el modelo de compresión de la médula espinal se ha establecido correctamente.
5. Suturar el músculo, la fascia, los tejidos subcutáneos y de la piel, capa por capa, utilizando agujas triangulares y sutura 5-0.
6. Después de la desinfección, transfiera a los animales de regreso a la jaula y manténgalos calientes.
7. Inyecte por vía subcutánea clorhidrato de buprenorfina analgesia (0,03 mg/kg) cada 6 h durante 3 días después de la cirugía y según sea necesario después de eso.

4. Manejo postoperatorio

1. Inyectar un equivalente a 100.000 unidades de penicilina por vía intraperitoneal en las ratas una vez al día para prevenir la infección postoperatoria y aliviar el dolor.
2. Transfiera las ratas a jaulas nuevas que hayan sido calentadas continuamente con una lámpara infrarroja para asegurar una adecuada conservación del calor en el postoperatorio.
   NOTA: Retire la lámpara de calefacción después de que la rata recupere la conciencia
3. Mantenga la higiene y ventilación de la jaula de alimentación de la rata.
4. Ayude a las ratas a comer y beber dos veces al día. Si es necesario, administre un masaje de vejiga para ayudar a orinar hasta que se restablezca la función urinaria.

5. Evaluación conductual

1. Utilice la escala de calificación de Basso, Beattie y Bresnahan (BBB) para evaluar el comportamiento postoperatorio.
   NOTA: La escala de calificación BBB es un estándar de oro (Tabla 1) utilizado para evaluar la función relacionada con la médula espinal en ratas. Evalúa el movimiento de las ratas de acuerdo con puntuaciones que van desde 0 (no se observó ningún movimiento de las extremidades traseras) hasta 21 (coordinación de la marcha, consistencia del espacio de los dedos, posición de la garra principal paralela en toda la postura, estabilidad constante del tronco y elevación constante de la cola).

6. Prueba de fuerza de agarre

1. Utilice un medidor electrónico de fuerza de agarre para medir la fuerza de agarre.
2. Agarre la mitad inferior de la rata para suspenderla y permita que agarre la varilla de metal del medidor de agarre frontal.
3. Cuando la rata agarre la varilla de metal, retírela y registre la fuerza de agarre.
4. Mida la fuerza de agarre tres veces para cada rata y registre la puntuación más alta.

7. Prueba de placa inclinada

1. Coloque la rata en una placa de goma con un ángulo ajustable.
2. Aumente gradualmente el ángulo inclinado de la placa en 5° cada vez hasta que la rata logre mantener el equilibrio y mantenerse firme durante 5 s.
3. Registre el ángulo máximo en el que la rata puede equilibrarse en la placa inclinada.
4. Mida el ángulo máximo tres veces para cada rata y registre la puntuación más alta.

8. Eutanasia, separación de la médula espinal e inclusión congelada

NOTA: Asegúrese de usar gafas protectoras y protector/mascarilla adecuados para proteger los ojos, la cara y las vías respiratorias del paraformaldehído y el gas formaldehído.

1. Inyectar un equivalente al 10% de hidrato de cloral por vía intraperitoneal para anestesiar a las ratas antes de abrir el esternón para exponer el corazón.
2. Inserte una aguja de perfusión en el ápice del corazón, fíjela con pinzas hemostáticas y administre lentamente una infusión con solución salina normal.
3. Taladre un orificio en la orejuela auricular derecha hasta que salga solución salina normal y limpia de la aurícula derecha, lo que indica una infusión exitosa.
4. Detener la perfusión normal de solución salina después de que el hígado se vuelva blanco.
5. Infundir con un equivalente al 10% de paraformaldehído hasta que el cuerpo de la rata se vuelva rígido.
6. Después de la perfusión de paraformaldehído, retire la piel, los músculos y los tejidos blandos alrededor de la columna vertebral; separar el segmento C2-C7 de la columna cervical; y sumérjalo en paraformaldehído al 10% para su fijación durante la noche.
7. Separe la médula espinal cervical de la columna vertebral y colóquela en un gradiente de concentración de soluciones de sacarosa del 10%, 20% y 30% para una deshidratación gradual.
8. Transfiera la médula espinal comprimida de 2 mm de altura junto con un agente incrustante OCT a un congelador a -80 °C.
9. Después de la sección en cortes de 7 μm de grosor y la tinción (tinción H&E y marcaje de punta de corte dUTP (TUNEL)/núcleos neuronales (NeuN), ver sección 9), observar la histopatología de la médula espinal y la apoptosis neuronal, respectivamente.

9. Inmunotinción TUNEL/NeuN

1. Sumerja las secciones de la médula espinal en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 10 minutos a temperatura ambiente, luego bloquee con una solución de PBS que contenga 0,3% de Triton X-100 y 5% de albúmina sérica bovina (BSA) durante 1 h.
2. Incubar las secciones de la médula espinal con un anticuerpo policlonal anti-NeuN de conejo (diluido 1:200;) durante la noche a 4 °C.
3. Enjuague las secciones de la médula espinal tres veces en PBS. Posteriormente, incubar con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 594 durante 2 h a temperatura ambiente.
4. Realice el kit de ensayo de apoptosis TUNEL de un solo paso (fluorescencia verde) para teñir los núcleos apoptóticos de las secciones de la médula espinal.

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Resultados

La lesión compresiva de la médula espinal puede provocar discapacidad neuromuscular en las extremidades
A medida que la pieza de hidrogel se expande gradualmente, comprime persistentemente la región de la médula espinal durante un período prolongado, lo que simula las discapacidades de las extremidades anteriores inducidas por las enfermedades de la médula espinal cervical ^8,10. En el modelo actual, se o...

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Discusión

El objetivo de este procedimiento quirúrgico fue generar una apoptosis neural reproducible y prolongada en la médula espinal de rata. Una ventaja clave de este modelo es que los implantes de hidrogel expandible proporcionan una compresión prolongada en la médula espinal, lo que conduce a una respuesta apoptótica neural progresiva (Figura 2C), que es consistente con el proceso patológico de la MSC. En el estudio actual, la mortalidad por lesión de la m...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic ointment			Prevent wound infection
Buprenorphine-SR			Pain relief
Isoflurane	Veteasy		Anesthesia
Inhalant anesthesia equipment			Anesthesia
Micro ophthalmic forceps	Mingren medical equipment	Length: 11 cm, Head diameter: 0.3 mm	Clip the muscle
Ophthalmic forceps	Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory	JD1050	Clip the skin
Ophthalmic scissors (10 cm)	Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory	Y00030	Skin incision
SD male rats	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd	SCXK2018-0004	Animal model
Sterile surgical blades (22#)	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	35T0707	Muscle incision
Small animal trimmer			Hair removal
Veet hair removal cream	RECKITT BENCKISER (India) Ltd		Hair removal
Venus shears	Mingren medical equipment	Length: 12.5 cm	Muscle incision