Модель нейронального апоптоза, индуцированного компрессией спинного мозга у крыс

Резюме

В этой статье мы представляем протокол для создания модели компрессии спинного мозга крысы, оценки ее поведенческой оценки и наблюдения за сжатой областью спинного мозга. Поведенческие оценки показали снижение двигательной инвалидности монитора. Окрашивание гематоксилином и эозином и иммуноокрашивание выявили значительный апоптоз нейронов в сжатой области спинного мозга.

Аннотация

Будучи тяжелым прогрессирующим дегенеративным заболеванием, шейная спондилотическая миелопатия (РШМ) имеет плохой прогноз и связана с физической болью, скованностью, двигательной или сенсорной дисфункцией, а также высоким риском травмы спинного мозга и акропарализа. Таким образом, срочно необходимы терапевтические стратегии, способствующие эффективной регенерации спинного мозга при этом хроническом и прогрессирующем заболевании. Для понимания сложного биологического механизма, лежащего в основе ХСМ, необходимы эффективные и воспроизводимые модели компрессии спинного мозга животных. Большинство моделей травмы спинного мозга отражают острые и структурные деструктивные состояния, в то время как животные модели ХСМ демонстрируют хроническую компрессию в спинном мозге. В данной статье представлен протокол для создания модели компрессии спинного мозга крысы, которая была дополнительно оценена путем оценки поведенческой оценки и наблюдения за сжатой областью спинного мозга. Поведенческие оценки показали снижение двигательной инвалидности, включая движения суставов, способность шагать, координацию, стабильность туловища и силу мышц конечностей. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) и иммуноокрашивание выявили значительный апоптоз нейронов в сжатой области спинного мозга.

Введение

Являясь распространенным прогрессирующим дегенеративным заболеванием, на долю ХСМ приходится 5-10% всех шейных спондилелов¹. Если пациенты, страдающие ХСМ, игнорируют свои симптомы и не лечат их своевременно и эффективно, это может привести к серьезным осложнениям, таким как повреждение спинного мозга и паралич конечностей, которые будут ухудшаться с возрастом, создавая значительную экономическую и психическую нагрузку для пациентов и их семей ^2,3. Патогенез ХСМ сложен и включает в себя статические и динамические факторы, теорию гипоксии-ишемии, повреждение эндотелиальных клеток, теорию разрушения барьера кровеносного спинного мозга, а также теорию воспаления и апоптоза 4,5,6,7.

Статические и динамические механизмы компрессии спинного мозга вызывают клинические симптомы. Выступающие позвоночные диски, деформированные тела позвонков и кальцинированные связки могут вызвать длительную компрессию спинного мозга, которая будет постепенно влиять на гемато-спинной барьер и местную микроциркуляторную русло в спинном мозге ^4,8. В свою очередь, ишемия, воспаление и апоптоз поражают нейроны, аксоны и глиальные клетки ^6,9.

Экспериментальные модели травмы спинного мозга на животных включают контузионную травму, компрессионную травму, тракционную травму, фотохимическую травму и ишемическую реперфузионную травму. Большинство из этих моделей также отражают некоторые острые и структурные деструктивные условия (транссекция или химическая токсичность). Тем не менее, эти животные модели ХСМ не могут демонстрировать прогрессирующий апоптоз нейронов в спинном мозге.

В этой статье описан подробный протокол для создания модели компрессии спинного мозга крысы, которая была дополнительно оценена путем оценки поведенческой оценки и наблюдения за сжатой областью спинного мозга. Эта модель компрессии спинного мозга крысы является надежной моделью на животных для дальнейшего изучения механизмов, участвующих в ХСМ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Следующая процедура была выполнена с одобрения Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Шанхайского университета традиционной китайской медицины. Все операции по выживанию проводились в стерильных условиях, как указано в рекомендациях NIH. Боль и риск инфекций контролировались с помощью соответствующих анальгетиков и антибиотиков, чтобы обеспечить успешный исход. Эта хирургическая процедура оптимизирована для аутбредных самцов крыс породы Спрэг-Доули (SD) в возрасте 12 недель и весом 400 г.

1. ПВА-полиакриламидный гидрогелевый препарат

ПРИМЕЧАНИЕ: Как показано на рисунках 1G, 1H, гидрогель ПВА-полиакриламид представляет собой водопоглощающий полимерный лист. В естественном состоянии гель крайне сложно разрезать на мелкие кусочки. Приготовление описывается следующим образом.

1. Поместите гидрогель ПВА-полиакриламид в воду на 24 часа, чтобы его было легче резать после увлажнения.
2. С помощью самодельного режущего инструмента (рисунок 1H) разделите весь гидрогель на кусочки размером 2 мм х 2 мм х 2 мм.
3. Перенесите эти кусочки гидрогеля в печь при температуре 60 °C на 12 часов для дегидратации на мелкие кусочки размером 1 мм x 1 мм x 1 мм в качестве материала для имплантации.

2. Анестезия и подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно надевайте хирургическую шапочку, одноразовые медицинские маски и стерильные хирургические перчатки на протяжении всего стерильного хирургического процесса.

1. Поместите крысу на грелку и убедитесь, что ректальная температура поддерживается на уровне 37±1 °C во время анестезии.
2. Поместите крысу в анестезиологическую камеру, заполненную 3% изофлураном, на 3 минуты.
3. Осторожно ущипните конечности и пальцы ног крысы пинцетом, чтобы проверить потерю абсорбционной реакции, что указывает на успешную анестезию.
4. Зафиксируйте крысу на операционном столе в положении лежа, следя за тем, чтобы конечности и голова крысы были надежно зафиксированы.
5. Закрепите маску для анестезии на морде крысы. Введите 2% изофлуран в кислородно-воздушной смеси через стандартную маску для носа крысы для обезболивания на протяжении всей операции по компрессии позвоночника.
6. Поместите цилиндрическую марлевую салфетку (размером около 30 мм x 20 мм x 60 мм) между крысой и операционным столом (рис. 1A), чтобы обеспечить беспрепятственное проходимость дыхательных путей и полностью открытое хирургическое место на протяжении всей операции.
7. Сбрейте шерсть вокруг хирургической области шеи крысы с помощью электробритвы.
8. Нанесите крем для депиляции, чтобы удалить оставшиеся волосы и обнажить кожу.
9. Продезинфицируйте операционную область йодофором.
10. Накройте продезинфицированный участок стерильным полотенцем с отверстием, обнажающим только операционный участок на тыльной стороне шеи крысы.

3. Хирургический подход

1. Сделайте продольный разрез по дорсальной средней линии скальпелем от второго шейного остистого отростка до второго грудного остистого отростка, предварительно чрескожно расположив второй шейный остистый отросток и второй грудной остистый отросток.
2. Тупым путем разделите мышцы обеих сторон с помощью кровоостанавливающих щипцов, чтобы обнажить пластинку С2-Т2 после разрезания подкожной клетчатки и фасции слой за слоем.
3. Просверлите отверстие (1 мм х 1 мм) на шейной пластинке (рисунок 1В).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать чрезмерной травмы спинного мозга, убедитесь, что шея крысы находится в состоянии дорсальной дуги, обеспечивая достаточное пространство между шейными пластинками.
4. С помощью микрохирургических щипцов захватите кусочек гидрогеля ПВА-полиакриламида размером 1 мм х 1 мм х 1 мм и введите его в ранее просверленное отверстие (рисунок 1С, 1Д).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Преходящее подергивание указывает на то, что модель компрессии спинного мозга была успешно создана.
5. Сшивайте мышцы, фасции, подкожные и кожные ткани, слой за слоем, используя треугольные иглы и шов 5-0.
6. После дезинфекции переведите животных обратно в клетку и держите их в тепле.
7. Подкожно вводить анальгезию бупренорфина гидрохлорида (0,03 мг/кг) каждые 6 ч в течение 3 дней после операции и по мере необходимости после нее.

4. Послеоперационное ведение

1. Вводите эквивалент 100 000 единиц пенициллина внутрибрюшинно крысам один раз в день, чтобы предотвратить послеоперационную инфекцию и облегчить боль.
2. Переведите крыс в новые клетки, которые постоянно нагревались инфракрасной лампой, чтобы обеспечить адекватное сохранение тепла после операции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Снимите нагревательную лампу после того, как сознание крысы восстановится.
3. Поддерживайте гигиену и вентиляцию клетки для кормления крыс.
4. Помогайте крысам есть и пить два раза в день. При необходимости проведите массаж мочевого пузыря для облегчения мочеиспускания до тех пор, пока функция мочеиспускания не восстановится.

5. Поведенческая оценка

1. Используйте шкалу оценки Бассо, Битти и Бреснахана (BBB) для оценки послеоперационного поведения.
   Шкала оценки BBB является золотым стандартом (Таблица 1), используемым для оценки функции, связанной со спинным мозгом, у крыс. Он оценивает движения крыс в соответствии с баллами от 0 (движение задних конечностей не наблюдалось) до 21 (координация походки, равномерность пространства между пальцами ног, параллельность основного когтя во всей осанке, постоянная стабильность туловища и постоянное поднятие хвоста).

6. Тест на прочность хвата

1. Используйте электронный измеритель прочности хвата для измерения прочности хвата.
2. Возьмитесь за нижнюю половину крысы, чтобы подвешивать крысу, и позвольте ей схватиться за металлический стержень измерителя передней рукоятки.
3. Когда крыса возьмет металлический стержень, оттяните его и запишите силу хвата.
4. Измерьте силу хвата три раза для каждой крысы и запишите наибольшее количество очков.

7. Испытание наклонной плиты

1. Поместите крысу на резиновую пластину с регулируемым углом наклона.
2. Каждый раз постепенно увеличивайте угол наклона пластины на 5°, пока крыса не сможет уравновеситься и твердо стоять в течение 5 секунд.
3. Запишите максимальный угол, под которым крыса может балансировать на наклонной пластине.
4. Измерьте максимальный угол три раза для каждой крысы и запишите наибольшее количество очков.

8. Эвтаназия, отделение спинного мозга и замораживание

ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что на вас надеты соответствующие очки для глаз и лицевой щиток/маска для защиты глаз, лица и дыхательных путей от параформальдегида и газа формальдегида.

1. Введите эквивалент 10% хлораллгидрата внутрибрюшинно, чтобы обезболить крыс, прежде чем открыть грудину, чтобы обнажить сердце.
2. Введите перфузионную иглу в верхушку сердца, зафиксируйте ее гемостатическими щипцами и медленно влите обычный физиологический раствор.
3. Просверлите отверстие в правом придатке предсердия до тех пор, пока из правого предсердия не вытечет чистый нормальный физиологический раствор, свидетельствующий об успешной инфузии.
4. Прекратите нормальную перфузию физиологическим раствором после того, как печень побелеет.
5. Вводите эквивалент 10% параформальдегида до тех пор, пока тело крысы не станет жестким.
6. После перфузии параформальдегида удалить кожу, мышцы и мягкие ткани вокруг позвоночника; отделить сегмент С2-С7 шейного отдела позвоночника; и погрузите его в 10% параформальдегид для фиксации на ночь.
7. Отделите шейный отдел спинного мозга от позвоночника и поместите его в градиент концентрации 10%, 20% и 30% растворов сахарозы для постепенного обезвоживания.
8. Перенесите сжатый спинной мозг высотой 2 мм вместе с агентом для встраивания ОКТ в морозильную камеру при температуре -80 °C.
9. После срезов на срезы толщиной 7 мкм и окрашивания (окрашивание H&E и мечение dUTP nick end labeling (TUNEL)/ядра нейронов (NeuN), см. раздел 9) наблюдайте за гистопатологией спинного мозга и апоптоза нейронов соответственно.

9. Иммуноокрашивание TUNEL/NeuN

1. Погрузите участки спинного мозга в фосфатно-солевой буфер (PBS) на 10 мин при комнатной температуре, затем заблокируйте раствором PBS, содержащим 0,3% Triton X-100 и 5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) на 1 ч.
2. Инкубируйте отделы спинного мозга с кроличьим поликлональным антителом против NeuN (разбавленным 1:200;) в течение ночи при 4 °C.
3. Трижды промыть участки спинного мозга в PBS. Затем инкубировать с конъюгированными с Alexa Fluor 594-конъюгированными вторичными антителами в течение 2 ч при комнатной температуре.
4. Выполните одноэтапный набор для анализа апоптоза TUNEL (зеленая флуоресценция) для окрашивания апоптотических ядер отделов спинного мозга.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Компрессионная травма спинного мозга может привести к нервно-мышечной инвалидности конечностей
По мере того, как гидрогелевая деталь постепенно расширяется, она настойчиво сжимает область спинного мозга в течение длительного периода времени, что имитиру...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Целью этой хирургической процедуры было создание воспроизводимого, пролонгированного нейронного апоптоза в спинном мозге крысы. Ключевым преимуществом данной модели является то, что расширяемые гидрогелевые имплантаты обеспечивают длительную компрессию спинного...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic ointment			Prevent wound infection
Buprenorphine-SR			Pain relief
Isoflurane	Veteasy		Anesthesia
Inhalant anesthesia equipment			Anesthesia
Micro ophthalmic forceps	Mingren medical equipment	Length: 11 cm, Head diameter: 0.3 mm	Clip the muscle
Ophthalmic forceps	Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory	JD1050	Clip the skin
Ophthalmic scissors (10 cm)	Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory	Y00030	Skin incision
SD male rats	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd	SCXK2018-0004	Animal model
Sterile surgical blades (22#)	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	35T0707	Muscle incision
Small animal trimmer			Hair removal
Veet hair removal cream	RECKITT BENCKISER (India) Ltd		Hair removal
Venus shears	Mingren medical equipment	Length: 12.5 cm	Muscle incision