Un modello di apoptosi neuronale indotta dalla compressione del midollo spinale nel ratto

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per generare un modello di compressione del midollo spinale di ratto, valutare il suo punteggio comportamentale e osservare la regione del midollo spinale compressa. Le valutazioni comportamentali hanno mostrato una diminuzione della disabilità motoria del monitor. La colorazione e l'immunocolorazione con ematossilina ed eosina hanno rivelato una notevole apoptosi neuronale nella regione compressa del midollo spinale.

Abstract

Essendo una grave malattia degenerativa progressiva, la mielopatia spondilotica cervicale (CSM) ha una prognosi infausta ed è associata a dolore fisico, rigidità, disfunzione motoria o sensoriale e un alto rischio di lesioni del midollo spinale e acroparalisi. Pertanto, sono urgentemente necessarie strategie terapeutiche che promuovano un'efficiente rigenerazione del midollo spinale in questa malattia cronica e progressiva. Per comprendere il complesso meccanismo alla base del CSM sono necessari modelli di compressione del midollo spinale animale efficaci e riproducibili. La maggior parte dei modelli di lesione del midollo spinale riflette condizioni distruttive acute e strutturali, mentre i modelli animali di CSM presentano una compressione cronica nel midollo spinale. Questo articolo presenta un protocollo per generare un modello di compressione del midollo spinale di ratto, che è stato ulteriormente valutato valutando il punteggio comportamentale e osservando la regione del midollo spinale compressa. Le valutazioni comportamentali hanno mostrato una diminuzione della disabilità motoria del monitor, inclusi i movimenti articolari, la capacità di fare un passo, la coordinazione, la stabilità del tronco e la forza muscolare degli arti. La colorazione e l'immunocolorazione con ematossilina ed eosina (H&E) hanno rivelato una notevole apoptosi neuronale nella regione compressa del midollo spinale.

Introduzione

Essendo una comune malattia degenerativa progressiva, la CSM rappresenta il 5-10% di tutte le spondilosi cervicali¹. Se i pazienti affetti da CSM ignorano i loro sintomi e non riescono a trattarli in modo tempestivo ed efficace, ciò potrebbe portare a gravi complicanze, come lesioni del midollo spinale e paralisi degli arti, che si deteriorerebbero con l'invecchiamento, ponendo un notevole onere economico e mentale ai pazienti e alle^{loro famiglie.} La patogenesi del CSM è complessa e coinvolge fattori statici e dinamici, la teoria dell'ipossia-ischemia, il danno delle cellule endoteliali, la teoria della distruzione della barriera del midollo spinale e la teoria dell'infiammazione e dell'apoptosi 4,5,6,7.

I meccanismi statici e dinamici della compressione sul midollo spinale causano sintomi clinici. I dischi vertebrali sporgenti, i corpi vertebrali deformati e i legamenti calcificati possono causare una compressione prolungata del midollo spinale, che influenzerà gradualmente la barriera emato-spinale e la microvascolarizzazione locale nel midollo spinale ^4,8. A loro volta, l'ischemia, l'infiammazione e l'apoptosi colpiscono i neuroni, gli assoni e le cellule gliali ^6,9.

I modelli animali sperimentali di lesione del midollo spinale includono lesioni contusive, lesioni da compressione, lesioni da trazione, lesioni indotte da fotochimica e lesioni da ischemia-riperfusione. La maggior parte di questi modelli riflette anche alcune condizioni distruttive acute e strutturali (transezione o tossicità chimica). Tuttavia, questi modelli animali di CSM non possono presentare apoptosi neuronale progressiva nel midollo spinale.

Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per generare un modello di compressione del midollo spinale di ratto, che è stato ulteriormente valutato valutando il punteggio comportamentale e osservando la regione compressa del midollo spinale. Questo modello di compressione del midollo spinale di ratto è un modello animale affidabile per ulteriori indagini sui meccanismi coinvolti nel CSM.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

La seguente procedura è stata eseguita con l'approvazione del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC), Università di Medicina Tradizionale Cinese di Shanghai. Tutti gli interventi chirurgici di sopravvivenza sono stati eseguiti in condizioni sterili, come indicato dalle linee guida NIH. Il dolore e il rischio di infezioni sono stati gestiti con analgesici e antibiotici appropriati per garantire un esito positivo. Questa procedura chirurgica è ottimizzata per i ratti maschi di razza Sprague-Dawley (SD) di 12 settimane di età e 400 g di peso.

1. Preparazione di idrogel di poliacrilammide PVA

NOTA: Come mostrato nella Figura 1G, 1H, l'idrogel di PVA-poliacrilammide è un foglio polimerico che assorbe l'acqua. Allo stato naturale, il gel è estremamente difficile da tagliare in piccoli pezzi. La preparazione è descritta come segue.

1. Mettere un idrogel di PVA-poliacrilammide in acqua per 24 ore per facilitarne il taglio dopo l'idratazione.
2. Utilizzare un utensile da taglio autocostruito (Figura 1H) per dividere l'intero idrogel in pezzi, di dimensioni 2 mm x 2 mm x 2 mm.
3. Trasferire questi pezzi di idrogel in forno a 60 °C per 12 ore per la disidratazione in piccoli pezzi di 1 mm x 1 mm x 1 mm come materiali da impianto.

2. Anestesia e preparazione

NOTA: Assicurarsi di indossare un berretto chirurgico, maschere mediche monouso e guanti chirurgici sterili durante tutto il processo chirurgico sterile.

1. Posizionare il ratto su un termoforo e assicurarsi che la temperatura rettale sia mantenuta a 37±1 °C durante l'anestesia.
2. Posizionare il ratto nella camera di anestesia riempita con isoflurano al 3% per 3 minuti.
3. Pizzicare delicatamente gli arti e le dita dei piedi del ratto con una pinzetta per verificare la perdita della risposta di astinenza, indicando l'avvenuta anestesia.
4. Fissare il ratto sul tavolo operatorio in posizione prona, assicurandosi che gli arti e la testa del ratto siano fissati saldamente.
5. Fissare la maschera per anestesia al viso del ratto. Somministrare isoflurano al 2% in una miscela di ossigeno/aria tramite una maschera nasale standard per ratti per anestetizzare il ratto durante l'intervento chirurgico di compressione spinale.
6. Posizionare una garza cilindrica (dimensioni di circa 30 mm x 20 mm x 60 mm) tra il ratto e il tavolo operatorio (Figura 1A) per garantire vie aeree libere e un sito chirurgico completamente esposto durante l'intervento.
7. Radere i peli intorno all'area chirurgica del collo del topo con un rasoio elettrico.
8. Applicare la crema depilante per rimuovere i peli rimanenti ed esporre la pelle.
9. Disinfettare l'area chirurgica con iodoforo.
10. Coprire l'area disinfettata con un asciugamano sterile con un foro che espone solo l'area chirurgica sul lato dorsale del collo del ratto.

3. Approccio chirurgico

1. Praticare un'incisione longitudinale nella linea mediana dorsale con un bisturi dal secondo processo spinoso cervicale al secondo processo spinoso toracico, dopo aver posizionato percutaneamente il secondo processo spinoso cervicale e il secondo processo spinoso toracico.
2. Separare smussate i muscoli di entrambi i lati con una pinza emostatica per esporre la lamina C2-T2 dopo aver tagliato il tessuto sottocutaneo e la fascia strato per strato.
3. Praticare un foro (1 mm x 1 mm) sulla lamina cervicale (Figura 1B).
   NOTA: Per evitare lesioni eccessive al midollo spinale, assicurarsi che il collo del ratto sia mantenuto in uno stato di arco dorsale, lasciando uno spazio sufficiente tra le lamine cervicali.
4. Utilizzare una pinza microchirurgica per afferrare un pezzo di idrogel di PVA-poliacrilammide delle dimensioni di 1 mm x 1 mm x 1 mm e inserirlo nel foro precedentemente praticato (Figura 1C, 1D).
   NOTA: Le prestazioni di contrazioni transitorie indicano che il modello di compressione del midollo spinale è stato stabilito con successo.
5. Sutura i tessuti muscolari, della fascia, del sottocute e della pelle, strato per strato, utilizzando aghi triangolari e sutura 5-0.
6. Dopo la disinfezione, trasferire gli animali nella gabbia e tenerli al caldo.
7. Iniettare per via sottocutanea analgesia con buprenorfina cloridrato (0,03 mg/kg) ogni 6 ore per 3 giorni dopo l'intervento chirurgico e dopo le necessità.

4. Gestione postoperatoria

1. Iniettare un equivalente di 100.000 unità di penicillina per via intraperitoneale nei ratti una volta al giorno per prevenire l'infezione postoperatoria e alleviare il dolore.
2. Trasferire i ratti in nuove gabbie che sono state continuamente riscaldate con una lampada a infrarossi per garantire un'adeguata conservazione del calore dopo l'intervento.
   NOTA: Rimuovere la lampada riscaldante dopo che la coscienza del ratto è stata ripristinata
3. Mantenere l'igiene e la ventilazione della gabbia di alimentazione del ratto.
4. Aiuta i ratti a mangiare e bere due volte al giorno. Se necessario, somministrare un massaggio alla vescica per facilitare la minzione fino al ripristino della funzione urinaria.

5. Valutazione comportamentale

1. Usa la scala di valutazione Basso, Beattie e Bresnahan (BBB) per valutare il comportamento postoperatorio.
   NOTA: La scala di valutazione BBB è un gold standard (Tabella 1) utilizzato per valutare la funzione correlata al midollo spinale nei ratti. Valuta il movimento dei ratti in base a punteggi che vanno da 0 (non è stato osservato alcun movimento degli arti posteriori) a 21 (coordinazione dell'andatura, coerenza dello spazio delle dita, posizione dell'artiglio principale parallela nell'intera postura, stabilità costante del tronco ed elevazione costante della coda).

6. Test di forza di presa

1. Utilizzare un misuratore elettronico della forza di presa per misurare la forza di presa.
2. Afferra la metà inferiore del ratto per sospendere il ratto e permettergli di afferrare l'asta di metallo del misuratore di presa anteriore.
3. Quando il topo afferra l'asta di metallo, tirarla via e registrare la forza di presa.
4. Misura la forza di presa tre volte per ogni ratto e registra il punteggio più alto.

7. Prova della piastra inclinata

1. Posiziona il topo su una piastra di gomma con un angolo regolabile.
2. Aumentare gradualmente l'angolo della piastra inclinata di 5° ogni volta fino a quando il ratto riesce a bilanciarsi e a rimanere fermo per 5 s.
3. Registrare l'angolo massimo al quale il ratto può bilanciarsi sulla piastra inclinata.
4. Misura l'angolo massimo tre volte per ogni ratto e registra il punteggio più alto.

8. Eutanasia, separazione del midollo spinale e incorporazione congelata

NOTA: Assicurarsi che siano indossati occhiali protettivi e visiera/maschera appropriati per proteggere gli occhi, il viso e le vie respiratorie dalla paraformaldeide e dal gas formaldeide.

1. Iniettare un equivalente del 10% di idrato di cloralio per via intraperitoneale per anestetizzare i ratti prima di aprire lo sterno per esporre il cuore.
2. Inserire un ago da perfusione nell'apice del cuore, fissarlo con una pinza emostatica e infondere lentamente con soluzione fisiologica.
3. Praticare un foro sull'appendice atriale destra fino a quando la soluzione fisiologica normale e pulita non fuoriesce dall'atrio destro, indicando un successo dell'infusione.
4. Arrestare la normale perfusione salina dopo che il fegato diventa bianco.
5. Infondere con un equivalente del 10% di paraformaldeide fino a quando il corpo del ratto non diventa rigido.
6. Dopo la perfusione di paraformaldeide, rimuovere la pelle, i muscoli e i tessuti molli intorno alla colonna vertebrale; separare il segmento C2-C7 del rachide cervicale; e immergerlo in paraformaldeide al 10% per fissarlo durante la notte.
7. Separare il midollo spinale cervicale dalla colonna vertebrale e posizionarlo in un gradiente di concentrazione del 10%, 20% e 30% di soluzioni di saccarosio per una disidratazione graduale.
8. Trasferire il midollo spinale compresso di 2 mm di altezza insieme a un agente incorporante OCT in un congelatore a -80 °C.
9. Dopo il sezionamento in fette spesse 7 μm e la colorazione (colorazione H&E e marcatura dUTP nick end (TUNEL)/nuclei neuronali (NeuN), vedere paragrafo 9), osservare l'istopatologia del midollo spinale e l'apoptosi neuronale, rispettivamente.

9. Immunocolorazione TUNEL/NeuN

1. Immergere le sezioni del midollo spinale in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi bloccare con una soluzione di PBS contenente lo 0,3% di Triton X-100 e il 5% di albumina sierica bovina (BSA) per 1 ora.
2. Incubare le sezioni del midollo spinale con un anticorpo policlonale anti-NeuN di coniglio (diluito 1:200;) per una notte a 4 °C.
3. Sciacquare le sezioni del midollo spinale tre volte in PBS. Successivamente incubare con anticorpi secondari coniugati Alexa Fluor 594 per 2 ore a temperatura ambiente.
4. Eseguire il kit del test dell'apoptosi TUNEL in un'unica fase (fluorescenza verde) per colorare i nuclei apoptotici delle sezioni del midollo spinale.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

La lesione compressiva del midollo spinale può portare a disabilità neuromuscolare degli arti
Man mano che il pezzo di idrogel si espande gradualmente, comprime in modo persistente la regione del midollo spinale per un periodo prolungato, simulando le disabilità degli arti anteriori indotte dalle malattie del midollo spinale cervicale ^8,10. Nel modello attuale, è stata osservata una notevole contrattura om...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

L'obiettivo di questa procedura chirurgica era quello di generare un'apoptosi neurale riproducibile e prolungata nel midollo spinale del ratto. Un vantaggio chiave di questo modello è che gli impianti di idrogel espandibili forniscono una compressione prolungata sul midollo spinale, portando così a una risposta apoptotica neurale progressiva (Figura 2C), che è coerente con il processo patologico del CSM. Nel presente studio, la mortalità per lesioni del ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic ointment			Prevent wound infection
Buprenorphine-SR			Pain relief
Isoflurane	Veteasy		Anesthesia
Inhalant anesthesia equipment			Anesthesia
Micro ophthalmic forceps	Mingren medical equipment	Length: 11 cm, Head diameter: 0.3 mm	Clip the muscle
Ophthalmic forceps	Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory	JD1050	Clip the skin
Ophthalmic scissors (10 cm)	Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory	Y00030	Skin incision
SD male rats	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd	SCXK2018-0004	Animal model
Sterile surgical blades (22#)	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	35T0707	Muscle incision
Small animal trimmer			Hair removal
Veet hair removal cream	RECKITT BENCKISER (India) Ltd		Hair removal
Venus shears	Mingren medical equipment	Length: 12.5 cm	Muscle incision