Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، نضع بروتوكولا لتصور وتحليل مجمعات SMAD المتعددة في وقت واحد باستخدام مقايسة ربط القرب (PLA) في الخلايا البطانية المعرضة لظروف إجهاد القص المرضي والفسيولوجي.

Abstract

تحويل عامل النمو β (TGFа) / العظام Morphogenetic البروتين (BMP) الإشارات هو تنظيم محكم ومتوازنة أثناء تطوير وتوازن الأوعية الدموية النظام وبالتالي، إلغاء الضوابط التنظيمية في هذا المسار الإشارات يؤدي إلى أمراض الأوعية الدموية الحادة، مثل ارتفاع ضغط الدم الشريان الرئوي، وtelangiectasia النزفية الوراثية، وتصلب الشرايين. تتعرض الخلايا البطانية (ECs)، باعتبارها الطبقة الأعمق من الأوعية الدموية، باستمرار لإجهاد القص السائل (SS). وقد ثبت أنماط غير طبيعية من السائل SS لتعزيز إشارات TGFβ / BMP، والتي، جنبا إلى جنب مع غيرها من المحفزات، والحث على تكوين الشرايين. وفيما يتعلق بهذا, atheroprone, تم العثور على انخفاض صفح SS لتعزيز TGFβ/ BMP الإشارات في حين atheroprotective, ارتفاع صفح SS, يقلل من هذه الإشارات. لتحليل كفاءة تفعيل هذه المسارات، قمنا بتصميم سير العمل للتحقيق في تشكيل مجمعات عامل النسخ تحت SS صفح منخفضة وظروف SS صفح عالية باستخدام نظام مضخة هوائية متاحة تجاريا وقربها اختبار الربط (جيش التحرير الشعبى الصينى).

يتطلب إشارات TGFβ/BMP النشطة تكوين مجمعات SMAD ثلاثية الأطراف تتكون من اثنين من الأنظمة SMAD (R-SMAD)؛ SMAD2/3 و SMAD1/5/8 للإشارات TGFβ وBMP، على التوالي) مع وسيط مشترك SMAD (شارك SMAD؛ SMAD4). باستخدام PLA استهداف وحدات فرعية مختلفة من مجمع SMAD ثلاثية، أي R-SMAD/co-SMAD أو R-SMAD/R-SMAD، يمكن قياس تشكيل مجمعات عامل النسخ SMAD النشطة كميا ومكانيا باستخدام المجهر الفلوري.

استخدام الشرائح تدفق مع 6 قنوات متوازية صغيرة، التي يمكن توصيلها في سلسلة، ويسمح للتحقيق في تشكيل عامل النسخ المعقدة وإدراج الضوابط اللازمة.

يمكن تكييف سير العمل الموضح هنا بسهولة للدراسات التي تستهدف قرب SMADs من عوامل النسخ الأخرى أو مجمعات عوامل النسخ بخلاف SMADs ، في ظروف SS السوائل المختلفة. يظهر سير العمل المعروض هنا طريقة سريعة وفعالة لدراسة إشارات TGFβ/BMP المستحثة SS السائلة في ECs ، كميا ومكانيا.

Introduction

بروتينات عوامل النمو التحويلية بيتا (TGFа) superfamily هي السيتوكينات ذات الجليوتروبيك مع مجموعة متنوعة من الأعضاء، بما في ذلك TGFβs، والبروتينات مورفوجينية العظام (BMPs)، وActivins1،2. ملزمة ليغاند يحفز تشكيل أوليغومرات مستقبلات مما يؤدي إلى الفوسفور، وبالتالي، تفعيل SMAD التنظيمية الخلوية (R-SMAD). اعتمادا على العائلة الفرعية من ligands، يتم تنشيط R-SMADs مختلفة1،2. في حين أن TGFβs وActivins تحفز أساسا الفوسفور من SMAD2/3، BMPs حث SMAD1/5/8 الفوسفور. ومع ذلك، هناك أدلة متراكمة على أن BMPs و TGFβs/Activins ينشطون أيضا R-SMADs من الأسرة الفرعية الأخرى المعنية، في عملية تسمى "الإشارات الجانبية" 3،4،5،6،7،8 وأن هناك مجمعات SMAD مختلطة تتكون من كليهما، SMAD1/5 و SMAD2/3، Members3,9 . اثنين من تنشيط R-SMADs شكل مجمعات ثلاثية في وقت لاحق مع SMAD4 الوسيط المشترك. ثم تكون مجمعات عوامل النسخ هذه قادرة على الانتقال إلى النواة وتنظيم نسخ الجينات المستهدفة. يمكن أن تتفاعل SMADs مع مجموعة متنوعة من المنشطات المشاركة النسخية المختلفة والمقمعات المشتركة ، مما يؤدي إلى تنويع إمكانيات تنظيم الجينات المستهدفة10. ولإلغاء القيود التنظيمية على إشارات الأمراض التي تسببها الأمراض الحادة آثار خطيرة في مجموعة متنوعة من الأمراض. وتمشيا مع هذا، قد يؤدي إشارات TGFβ/BMP غير المتوازنة إلى أمراض الأوعية الدموية الحادة، مثل ارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي، أو التهاب الأوعية الدموية النزفي الوراثي، أو تصلب الشرايين3،11،12،13،14.

تشكل الخلايا البطانية (ECs) الطبقة الأعمق من الأوعية الدموية ، وبالتالي ، فهي معرضة لإجهاد القص (SS) ، وهي قوة احتكاك يمارسها التدفق اللزج للدم. ومن المثير للاهتمام، يتم الاحتفاظ ECs المقيمين في أجزاء من الأوعية الدموية، والتي تتعرض لمستويات عالية من موحدة، صفح SS، في حالة الهوستاتيكية والكئيب. وعلى النقيض من ذلك، فإن المركبات ECs التي تعاني من انخفاض مستوى SS غير الموحد، على سبيل المثال، عند التشعبات أو الانحناء الأقل للقوس الأبهري، تنتشر وتفعيل المسارات الالتهابية15. وفي المقابل، فإن مواقع المركبات الإلكترونية المختلة معرضة للإصابة بالتصلب الشرايين. ومن المثير للاهتمام، أن المركبات الإلكترونية في هذه المناطق من أثيروبرون تعرض مستويات عالية بشكل شاذ من SMAD2/3 المنشط وSMAD1/516,17,18. وفي هذا السياق، تبين أن الإشارات المعززة TGFβ/BMP حدث مبكر في تطور الآفات تصلب الشرايين19 ووجد أن التداخل مع إشارات BMP يقلل بشكل ملحوظ من التهاب الأوعية الدموية، وتكوين الورم الحراري، والتكلس المرتبط به20.

القرب ربط المقايسة (جيش التحرير الشعبى الصينى) هو تقنية بيوكيميائية لدراسة التفاعلات البروتين البروتين في الموقع21،22. وهو يعتمد على خصوصية الأجسام المضادة من مختلف الأنواع التي يمكن أن تربط البروتينات المستهدفة ذات الاهتمام، مما يسمح بالكشف بشكل محدد للغاية عن تفاعلات البروتين الذاتية على مستوى الخلية الواحدة. هنا ، يجب على الأجسام المضادة الأولية أن ترتبط ب epitope الهدف على مسافة أقل من 40 نانومتر للسماح بالكشف23. لذلك ، فإن جيش التحرير الشعبي مفيد إلى حد كبير على النهج التقليدية للمناعة المشتركة ، حيث هناك حاجة إلى عدة ملايين من الخلايا للكشف عن التفاعلات البروتينية الذاتية. في جيش التحرير الشعبي، تربط الأجسام المضادة الثانوية الخاصة بالأنواع، المرتبطة بشكل متناقض بشظايا الحمض النووي (التي يطلق عليها مسابير Plus و Minus)، الأجسام المضادة الأولية وإذا تفاعلت البروتينات ذات الاهتمام، فإن مسابير Plus و Minus تأتي على مقربة. يتم ربط الحمض النووي في الخطوة التالية ويتم تكبير الدائرة المتداول للحمض النووي الدائري. أثناء التضخيم ، ترتبط أوليغونوكليوتيدات الفلورسنتات التكميلية بالحمض النووي المركب ، مما يسمح بتصور هذه التفاعلات البروتينية عن طريق المجهر الفلوري التقليدي.

البروتوكول الموصوف هنا يمكن العلماء من مقارنة عدد مجمعات نسخ SMAD النشطة كميا في ظروف SS atheroprotective و atheroprone في المختبر باستخدام PLA. يتم إنشاء SS عن طريق نظام مضخة هوائية قابلة للبرمجة التي هي قادرة على توليد تدفق صفح أحادي الاتجاه من مستويات محددة ويسمح زيادات تدريجية من معدلات التدفق. تسمح هذه الطريقة للكشف عن التفاعلات بين SMAD1/5 أو SMAD2/3 مع SMAD4، وكذلك المجمعات المختلطة R-SMAD. يمكن توسيعه بسهولة لتحليل تفاعلات SMADs مع المنظمين المشاركين النسخي أو إلى مجمعات عوامل النسخ بخلاف SMADs. ويبين الشكل 1 الخطوات الرئيسية للبروتوكول المعروضة أدناه.

figure-introduction-4903
الشكل 1: التمثيل التخطيطي للبروتوكول الموصوف. (أ) تتعرض الخلايا المصنفة في شرائح من 6 قنوات لإجهاد القص باستخدام نظام مضخة هوائية. (ب) تستخدم الخلايا الثابتة لتجربة جيش التحرير الشعبي أو لظروف التحكم. (ج) يتم الحصول على صور لتجارب جيش التحرير الشعبي مع المجهر الفلوري ويتم تحليلها باستخدام برنامج تحليل ImageJ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Protocol

1. خلية الثقافة والتعرض الإجهاد القص السوائل

ملاحظة: استخدمت مركبات ECs الوريدية السرية البشرية (HUVECs) كمثال لدراسة التفاعل المستحث من SS لل SMADs. يمكن تطبيق البروتوكول الموضح أدناه على كل نوع خلية استجابة SS.

  1. معطف 6 قناة الشريحة مع 0.1٪ هلام الجلد porcine في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
  2. البذور HUVECs في الشرائح 6 قنوات المغلفة مسبقا في كثافة 2.5 × 106 خلايا لكل مل في 30 ميكرولتر من M199 المتوسطة الكاملة.
    ملاحظة: للحصول على مزيد من المعلومات حول كيفية seed الخلايا في الشريحة flow، راجع reference24.
  3. السماح للخلايا الانضمام ل 1 ساعة في 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب.
  4. إضافة 60 ميكرولتر من M199 قبل الحارة المتوسطة الكاملة إلى كل من الخزانات.
  5. الثقافة لمدة يومين، مع تبادل متوسط لطيف مرة واحدة في اليوم، في 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة.
    1. يستنشق الخزانات تماما، إضافة 120 ميكرولتر من M199 قبل الحارة المتوسطة الكاملة في أحد الخزانات، وتنشق من الجانب الآخر.
    2. أضف 60 ميكرولتر من M199 المدفأة مسبقا إلى كلا الخزانين.
  6. تجميع وبدء تدفق انشاء كما هو مفصل في reference25.
    1. جبل أنابيب على وحدات السوائل. هنا، يتم استخدام أنابيب السيليكون التي يبلغ قطرها 0.8 ملم و 1.6 ملم لتطبيق إجهاد القص من 1 dyn/cm2 و 30 dyn/cm2، على التوالي.
      ملاحظة: يجب أن تظل المادة وطول الأنبوب ثابتين، حيث يمكن أن تؤثر التغييرات على إجهاد القص الناتج. بشكل عام، يمكن استخدام تركيبات أخرى من أنظمة المضخة والأنابيب، طالما أن إجهاد القص الناتج معروف، وتخلق المضخة تدفقا ثابتا للجزم.
    2. ملء الخزانات مع كمية مناسبة من M199 مدفأة مسبقا المتوسطة الكاملة (الحد الأدنى 10 مل).
    3. قم بتوصيل وحدات سائلة مع الأنابيب بنظام المضخة وإجراء تشغيل مسبق بدون خلايا لتوازن الوسط وإزالة أي هواء متبقي25.
    4. قم بتوصيل القنوات المفردة على الشريحة 6 قنوات ببعضها البعض باستخدام أنابيب الاتصال التسلسلي. سيتم توصيل القناة الأولى والأخيرة على الشريحة بالأنابيب المجمعة في 1.6.1 (انظر الشكل 1A للحصول على مخطط). يجب الحرص على عدم إدخال أي هواء في النظام لأن هذا يمكن أن يضر بشدة الخلايا. يمكن العثور على مزيد من المعلومات حول الاتصال التسلسلي في reference26.
    5. بالنسبة لتعرض الخلايا لمستويات عالية من إجهاد القص (>20 dyn/cm2)، استخدم مرحلة منحدر، أي زيادة إجهاد القص تدريجيا مع مراحل التكيف. يمكن تعيين الخطوات بزيادات قدرها 5 دين/سم2 لكل 30 دقيقة.

2. التثبيت

  1. فصل الشرائح من المضخات بعد التعرض SS السوائل. استخدام المشابك على الأنابيب عند فصل، لتجنب تسرب المتوسطة في الحاضنة.
  2. نقل الشرائح تدفق على الجليد على الفور، في حين يتم فصل الأنابيب المتبقية بشكل تسلسلي. عند إزالة الأنابيب من الخزانات، يجب أن يبقى الخزان على الجانب الآخر مغلقا بإصبع لتجنب محاصرة فقاعات الهواء في القناة. قد يتعارض ذلك مع خطوات التثبيت.
  3. الحفاظ على الخلايا على الجليد، يستنشق المتوسط بعناية من الخزانات ولكن ليس من القناة التي تتواجد فيها الخلايا. بعد ذلك، غسل العينات مع برنامج تلفزيوني معقم الباردة (4 درجة مئوية) مع ثلاثة أضعاف حجم القناة (90 ميكرولتر). إضافة برنامج تلفزيوني في خزان واحد و يستنشق بعناية من الخزان الآخر. كرر هذه الخطوة في كل قناة من القنوات ال 6 لكل شريحة.
    ملاحظة: لجميع خطوات الغسيل والحضانة تتم إضافة الحل المعني في أحد الخزانات مما يؤدي إلى تبادل الحلول في القناة. للسماح باستبدال الحلول بالكامل في القناة ، يتم بعد ذلك يستنشق الحل الزائد من الخزان الآخر. لا تتم إزالة الحل في الجزء العلوي من الخلايا في القناة. يجب أن لا تجف الخلايا في أي وقت. لذلك، من المهم أن تغسل بعناية دون أي إدراج فقاعة الهواء في الشرائح.
  4. إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 90 ميكرولتر من محلول PFA 4٪ المخزنة مؤقتا في نفس الخزان حيث تمت إضافة برنامج تلفزيوني مسبقا وبالمثل يستنشق السائل من الخزان الآخر. كرر هذه الخطوة في كل قناة في كل شريحة. بعد إضافة محلول PFA، نقل العينات من الجليد إلى درجة حرارة الغرفة (RT) واحتضان لمدة 20 دقيقة.
    تنبيه: PFA سامة وينبغي التعامل معها بعناية. استخدام قفازات والعمل تحت غطاء الدخان.
  5. غسل الخلايا 3x مع برنامج تلفزيوني (RT) عن طريق إضافته في خزان واحد و سبيريتينغ بعناية من الخزان الآخر. إفراغ الخزانات فقط، وضمان عدم تجفيف القناة. كرر هذه الخطوة لكل قناة من القنوات ال 6 لكل شريحة.
  6. إخماد تثبيت PFA بإضافة 90 ميكرولتر من كلوريد الأمونيوم المحيط 50 mM في برنامج تلفزيوني في أحد الخزانات. يستنشق الحل الزائد من الخزان الآخر. كرر لكل قناة في الشريحة. احتضان العينات لمدة 10 دقائق في RT.
  7. غسل كما هو موضح في الخطوة 2.5.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، قد يتم تخزين العينات عند درجة حرارة 4 مئوية بين عشية وضحاها، أو يمكن مواصلة البروتوكول فورا مع حظر واحتضان الأجسام المضادة الأولية (انظر الخطوة 3).

3. منع واحتضان الأجسام المضادة الأولية

  1. ل permeabilize الخلايا، إضافة 90 ميكرولتر من 0.3٪ تريتون-X-100 في برنامج تلفزيوني في خزان أفرغت، واستبخاء من الخزان الآخر لكل قناة. احتضان لمدة 10 دقائق في RT.
  2. غسل كما هو موضح في الخطوة 2.5.
  3. إضافة 90 ميكرولتر من محلول منع PLA العقيم في خزان واحد من قناة و أسبيرات من الجانب الآخر. كرر هذه الخطوة لكل قناة. كتلة لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية في غرفة رطبة.
    1. لجعل غرفة رطبة، استخدم طبق 10 سم مع الأنسجة الرطبة مختومة مع فيلم الشمع ووضع الطبق في الحاضنة. بدلا من ذلك، يمكن استخدام صيغ غرفة الرطوبة الأخرى التي توفر جو رطب.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن استخدام حل الحظر الذاتي الصنع (على سبيل المثال، 3٪ (ث / v) BSA في PBS، معقمة تصفيتها).
  4. إعداد الأجسام المضادة الأولية (1:100) في الأجسام المضادة جيش التحرير الشعبي العزلة. إعداد 30 ميكرولتر من الحل لكل قناة. إضافة كل من الأجسام المضادة الأولية في وقت واحد ودوامة.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن استخدام ثنائي الأجسام المضادة الذاتي الصنع (على سبيل المثال، 1٪ (ث / 5) BSA في PBS). الأجسام المضادة المستخدمة هنا هي مجموعات من SMAD1-SMAD2/3، SMAD2/3-SMAD4 وفوسفو-SMAD1/5-SMAD4. يمكن الاطلاع على معلومات مفصلة في جدول المواد.
  5. قبل تطبيق الأجسام المضادة الأولية ، يستنشق محلول الحجب من الخزانات ، وكذلك ، بعناية من القناة. ماصة 30 ميكرولتر من الحل الأساسي للأجسام المضادة فورا في قناة فارغة عن طريق إمالة القناة مع إضافة الحل.
    ملاحظة: تنفيذ إزالة الحل حظر وإضافة الأجسام المضادة حل قناة قناة قناة لضمان عدم جفاف الخلايا في ما بين.
  6. احتضان العينات مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في الغرف الرطبة في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن أيضا إجراء الحضانة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، إذا كنت ترغب في الاستمرار في الخطوات التالية في نفس اليوم.

4. PLA التحقيق الحضانة

ملاحظة: بالنسبة لكافة الخطوات في القسم 4.1-7.3، يتم تخزين المخزنين المؤقتين للغسيل A وB عند درجة حرارة 4 درجات مئوية ويجب تسخينهما إلى RT قبل الاستخدام.

  1. تمييع PLA-تحقيقات (+)-الماوس و (-)-أرنب إلى 1:5 في PLA الأجسام المضادة مخفف (أو 1٪ BSA) الحل. إعداد 30 ميكرولتر لكل قناة.
  2. غسل عينات 2x لمدة 5 دقائق باستخدام 90 ميكرولتر من العازلة غسل A في RT عن طريق إضافته في أحد الخزانات و سبيراتينغ بعناية من الخزان الآخر. كرر هذه الخطوة لكل قناة من القنوات ال 6 لكل شريحة.
  3. يستنشق المخزن المؤقت للغسيل A بعناية وإضافة 30 ميكرولتر من محلول مسبار PLA (تم إعداده في الخطوة 4.1) ، على غرار إضافة الأجسام المضادة الأولية في الخطوة 3.5.
  4. احتضان عينات لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في غرفة رطبة.

5. الربط

  1. غسل عينات 2x لمدة 5 دقائق باستخدام 90 ميكرولتر من العازلة غسل A في RT، كما هو موضح في 4.2.
  2. إعداد تخفيف 1:5 من العازلة ربط في الماء deionized. استخدم هذا العازل لتمييع إنزيم الليغاز إلى 1:40 (على الجليد). استخدم 30 ميكرولتر لكل قناة.
  3. يستنشق المخزن المؤقت غسل A تماما وإضافة محلول الربط كما هو موضح في 3.5.
  4. احتضان عينات لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية في غرفة رطبة.

6. التضخيم

  1. غسل عينات 2x لمدة 2 دقيقة باستخدام 90 ميكرولتر من العازلة غسل A في RT، كما هو موضح في 4.2.
  2. إعداد العازلة تضخيم عن طريق تخفيفه 1:5 في الماء deionized واستخدامه لتمييع انزيم البوليميراز إلى 1:80 (على الجليد). حماية من الضوء. إعداد 30 ميكرولتر لكل قناة.
  3. أسبيرات المخزن المؤقت غسل A تماما وعلى الفور إضافة حل تضخيم المعدة في القناة الفارغة، كما هو موضح في 3.5. احتضان عينات لمدة 100 دقيقة في 37 درجة مئوية في غرفة رطبة.

7. تصاعد

  1. غسل عينات 2x لمدة 10 دقيقة باستخدام 90 ميكرولتر من غسل العازلة B في RT كما هو موضح في 4.2. إضافة DAPI (1:500) من محلول مخزون 1 ملغم /مل (في الماء المتأين) في أول غسل للنوى وصمة عار. لا تجف القناة.
  2. تمييع العازلة غسل B في الماء deionized (1:10) وغسل 1x مع 90 ميكرولتر من 0.1x العازلة B الحل كما هو موضح في 4.2.
  3. يستنشق العازلة غسل B تماما وعلى الفور إضافة 2-3 قطرات من السائل تصاعد المتوسطة في خزان واحد. توزيعه في القناة عن طريق إمالة الشريحة. تخزين العينات عند درجة حرارة 4 درجات مئوية في بيئة رطبة حتى التصوير.

8. الحصول على صورة

  1. الحصول على الصور باستخدام المجهر الفلوري. تأكد من توفر المرشحات المعنية التي تناسب مسابير PLA الفلورية.
    ملاحظة: من المفيد الاستفادة من المجهر confocal، إذا كان ذلك ممكنا، كما تم الحصول على بقع جيش التحرير الشعبي هي أكثر تحديدا. وهذا يدعم أيضا المزيد من معالجة الصور وتحليل البيانات.

9. تحليل الصورة وتحديد كميتها باستخدام ImageJ / فيجي

  1. معالجة الصور المصدرة (.tiff) باستخدام برنامج معالجة الصور، مثل ImageJ27.
    ملاحظة: يمكن العثور على جميع البرامج النصية المستخدمة في هذه الدراسة واللازمة للعد التلقائي للأحداث الخلوية والنووية وجميع أحداث جيش التحرير الشعبي (لكل خلية) في مستودع GitHub: https://github.com/Habacef/Proximity-Ligation-Assay-analysis. إجراء التحليل الإحصائي باستخدام أي برنامج مناسب أو أداة مناسبة.

النتائج

لقد استخدمنا سابقا جيش التحرير الشعبي للكشف عن التفاعلات من البروتينات SMAD مختلفة3 وتحليل الإجهاد القص الناجمة عن التغيرات في SMAD الفوسفور28.

هنا، تم دمج كلا الأسلوبين مع البروتوكول المذكور أعلاه. تعرضت HUVECs لإجهاد القص من 1 dyn/cm2 و 30 dyn/cm2 وت?...

Discussion

يوفر البروتوكول القائم على جيش التحرير الشعبي الموصوف هنا طريقة فعالة لتحديد القرب من بروتينين (على سبيل المثال، تفاعلهما المباشر) في البلدان النامية المعرضة لضغوط القص بدقة كمية ومكانية. باستخدام الشرائح تدفق مع قنوات متوازية متعددة، يمكن فحص العديد من التفاعلات البروتين مختلفة في نفس ...

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نشكر الدكتورة ماريا رايشنباخ والدكتور كريستيان هيبن على دعمهما لنظام التدفق، وإليانور فوكس ويونيون شياو على قراءة المخطوطة بشكل نقدي. تم تمويل P-L.M من قبل مدرسة ماكس بلانك الدولية للأبحاث IMPRS-البيولوجيا والحساب (IMPRS-BAC). تلقى PK التمويل من قبل DFG-SFB1444. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
µ-Slide VI 0.4ibidi806066-channel slide
Ammonium ChlorideCarl RothK298.1Quenching
Bovine Serum AlbuminCarl Roth8076.4Blocking
DAPISigma Aldrich/ MerckD9542Stain DNA/Nuclei
DPBSPAN BiotechP04-53500PBS
Duolink In Situ Detection Reagents GreenSigma Aldrich/ MerckDUO92014PLA kit containing Ligase, ligation buffer, polymerase and amplification buffer (with green labeled oligonucleotides)
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUSSigma Aldrich/ MerckDUO92004MINUS probe
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUSSigma Aldrich/ MerckDUO92002PLUS probe
Duolink In Situ Wash Buffers, FluorescenceSigma Aldrich/ MerckDUO82049PLA wash buffers A and B
Endothelial Cell Growth SupplementCorningsupplement for medium (ECGS)
Fetal calf Serumsupplement for medium
FIJIImage Analysis software
Formaldehyde solution 4% bufferedKLINIPATH/VWRVWRK4186.BO1PFA
Full mediumM199 basal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +  25 µg/mL Hep +   50 µg/mL ECGS
Gelatin from porcine skin, Type ASigma AldrichG2500Use 0.1% in PBS for coating of flow channels
GraphPad Prism v.7GarphPadStatistical Program used for the Plots and statistical calculations
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosaSigma AldrichH4784-250MGsupplement for medium (Hep)
HUVECs
ibidi Mounting Mediumibidi50001Liquid mounting medium
ibidi Pump Systemibidi10902pneumatic pump
Leica TCS SP8Leicaconfocal microscope
L-Glutamin 200mMPAN BiotechP04-80100supplement for medium (L-Glu)
Medium 199Sigma AldrichM2154Base medium
mouse anti- SMAD1 AntibodyAbcamab53745Suited for PLA
mouse anti- SMAD2/3 AntibodyBD Bioscience610843Not suited for PLA in combination with CST 9515
mousee anti- SMAD4 AntibodySanata Cruz Biotechnologysc-7966Suited for PLA
Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/mlPAN BiotechP06-07100supplement for medium (P/S)
Perfusion Set WHITEibidi10963Tubings used for 1 dyn/cm2
Perfusion Set YELLOW and GREENibidi10964Tubings used for 30 dyn/cm2
rabbit anti- phospho SMAD1/5 AntibodyCell Signaling Technologies9516Suited for PLA
rabbit anti- SMAD2/3 XP AntibodyCell Signaling Technologies8685Suited for PLA
rabbit anti- SMAD4 AntibodyCell Signaling Technologies9515Not suited for PLA in combination with BD 610843
Serial Connector for µ-Slidesibidi10830serial connection tubes
Triton X-100Carl Roth6683.1Permeabilization

References

  1. Yadin, D., Knaus, P., Mueller, T. D. Structural insights into BMP receptors: Specificity, activation and inhibition. Cytokine and Growth Factor Reviews. 27, 13-34 (2016).
  2. Sieber, C., Kopf, J., Hiepen, C., Knaus, P. Recent advances in BMP receptor signaling. Cytokine and Growth Factor Reviews. 20 (5-6), 343-355 (2009).
  3. Hiepen, C., et al. BMPR2 acts as a gatekeeper to protect endothelial cells from increased TGFβ responses and altered cell mechanics. PLoS Biology. 17 (12), 3000557 (2019).
  4. Hildebrandt, S., et al. ActivinA induced SMAD1/5 Signaling in an iPSC derived EC model of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP) can be rescued by the drug candidate saracatinib. Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).
  5. Goumans, M. J., et al. Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-beta type I receptors. The EMBO Journal. 21 (7), 1743-1753 (2002).
  6. Goumans, M. J., et al. Activin receptor-like kinase (ALK)1 is an antagonistic mediator of lateral TGFbeta/ALK5 signaling. Molecular Cell. 12 (4), 817-828 (2003).
  7. Daly, A. C., Randall, R. A., Hill, C. S. Transforming growth factor beta-induced Smad1/5 phosphorylation in epithelial cells is mediated by novel receptor complexes and is essential for anchorage-independent growth. Molecular and Cellular Biology. 28 (22), 6889-6902 (2008).
  8. Ramachandran, A., et al. TGF-β uses a novel mode of receptor activation to phosphorylate SMAD1/5 and induce epithelial-to-mesenchymal transition. eLife. 7, 31756 (2018).
  9. Flanders, K. C., et al. Brightfield proximity ligation assay reveals both canonical and mixed transforming growth factor-β/bone morphogenetic protein Smad signaling complexes in tissue sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : The Official Journal of The Histochemistry Society. 62 (12), 846-863 (2014).
  10. Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T., Dijke, P. T., Heldin, C. -. H. . Smad Signal Transduction: Smads in Proliferation, Differentiation and Disease. , 277-293 (2006).
  11. Goumans, M. J., Zwijsen, A., Ten Dijke, P., Bailly, S. Bone morphogenetic proteins in vascular homeostasis and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (2), 031989 (2018).
  12. Cai, J., Pardali, E., Sánchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. BMP signaling in vascular diseases. FEBS Letters. 586 (14), 1993-2002 (2012).
  13. Cunha, S. I., Magnusson, P. U., Dejana, E., Lampugnani, M. G. Deregulated TGF-β/BMP signaling in vascular malformations. Circulation research. 121 (8), 981-999 (2017).
  14. MacCarrick, G., et al. Loeys-Dietz syndrome: a primer for diagnosis and management. Genetics in Medicine : An Official Journal of the American College of Medical Genetics. 16 (8), 576-587 (2014).
  15. Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
  16. Min, E., et al. Activation of Smad 2/3 signaling by low shear stress mediates artery inward remodeling. bioRxiv. , 691980 (2019).
  17. Zhou, J., et al. BMP receptor-integrin interaction mediates responses of vascular endothelial Smad1/5 and proliferation to disturbed flow. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 741-755 (2013).
  18. Zhou, J., et al. Force-specific activation of Smad1/5 regulates vascular endothelial cell cycle progression in response to disturbed flow. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (20), 7770-7775 (2012).
  19. van Dijk, R. A., et al. Visualizing TGF-β and BMP signaling in human atherosclerosis: A histological evaluation based on Smad activation. Histology and Histopathology. 27 (3), 387-396 (2012).
  20. Derwall, M., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 613-622 (2012).
  21. Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
  22. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  23. Alam, M. S. Proximity Ligation Assay (PLA). Current Protocols in Immunology. 123 (1), 58 (2018).
  24. Application Note 03: Growing Cells in µ-Channels. ibidi Available from: https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf (2012)
  25. Application Note 13: HUVECs under perfusion. ibidi Available from: https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf (2019)
  26. ibidi. Application Note 31: Instructions µ-Slide VI 0.4. ibidi. , (2013).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Reichenbach, M., et al. Differential impact of fluid shear stress and YAP/TAZ on BMP/TGF-β induced osteogenic target genes. Advanced Biology. 5 (2), 2000051 (2021).
  29. Hiepen, C., Mendez, P. L., Knaus, P. It takes two to tango: Endothelial TGFβ/BMP signaling crosstalk with mechanobiology. Cells. 9 (9), 1965 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

175 SMADs BMP TGF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved