Визуализация и количественная оценка сигнализации TGFβ/BMP/SMAD в различных условиях напряжения сдвига жидкости с использованием бесконтактного лигирования

Резюме

Здесь мы устанавливаем протокол для одновременной визуализации и анализа нескольких комплексов SMAD с использованием анализа бесконтактной перевязки (PLA) в эндотелиальных клетках, подверженных патологическим и физиологическим условиям сдвига жидкости.

Аннотация

Трансформирующий фактор роста β (TGFβ)/Костной морфогенетический белок (BMP) передачи сигналов жестко регулируется и сбалансирован во время развития и гомеостаза сосудистой системы Поэтому дерегуляция в этом сигнальном пути приводит к тяжелым сосудистым патологиям, таким как гипертония легочной артерии, наследственная геморрагическая телеангиэктазия и атеросклероз. Эндотелиальные клетки (ЭК), как самый внутренний слой кровеносных сосудов, постоянно подвергаются воздействию напряжения сдвига жидкости (SS). Было показано, что аномальные паттерны жидких SS усиливают передачу сигналов TGFβ / BMP, которые вместе с другими стимулами индуцируют атерогенез. В связи с этим было обнаружено, что атеропрон, низкий ламинарный SS усиливает передачу сигналов TGFβ / BMP, в то время как атеропротекторный, с высоким ламинарной SS уменьшает эту сигнализацию. Для эффективного анализа активации этих путей мы разработали рабочий процесс для исследования образования комплексов транскрипционного фактора в условиях низкого ламинарного SS и высокого ламинарного SS с использованием коммерчески доступной пневматической насосной системы и анализа бесконтактного лигирования (PLA).

Активная TGFβ/BMP-сигнализация требует формирования тримерных SMAD-комплексов, состоящих из двух регуляторных SMAD (R-SMAD); SMAD2/3 и SMAD1/5/8 для сигнализации TGFβ и BMP соответственно) с общим медиатором SMAD (co-SMAD; СМАД4). Используя PLA, нацеленную на различные субъединицы тримерного SMAD-комплекса, т.е. либо R-SMAD/co-SMAD, либо R-SMAD/R-SMAD, образование активных комплексов факторов транскрипции SMAD может быть измерено количественно и пространственно с помощью флуоресцентной микроскопии.

Использование проточных слайдов с 6 небольшими параллельными каналами, которые могут быть соединены последовательно, позволяет исследовать формирование комплекса транскрипционного фактора и включать необходимые элементы управления.

Рабочий процесс, описанный здесь, может быть легко адаптирован для исследований, направленных на близость SMAD к другим факторам транскрипции или к комплексам факторов транскрипции, отличным от SMAD, в различных условиях жидкого SS. Рабочий процесс, представленный здесь, показывает быстрый и эффективный способ изучения жидкостной SS-индуцированной сигнализации TGFβ /BMP в EC, как количественно, так и пространственно.

Введение

Белки трансформирующего фактора роста бета (TGFβ) суперсемейства являются плейотропными цитокинами с различными членами, включая TGFβs, костные морфогенетические белки (BMP) и ^{активины1,2}. Связывание лигандов индуцирует образование рецепторных олигомеров, приводящих к фосфорилированию и, тем самым, активации цитозольного регулятора SMAD (R-SMAD). В зависимости от подсемейства лигандов активируются различные R-SMAD1,2. В то время как TGFβs и активины в основном индуцируют фосфорилирование SMAD2/3, BMP индуцируют фосфорилирование SMAD1/5/8. Тем не менее, накапливаются доказательства того, что BMP и TGFβs/Activins также активируют R-SMAD соответствующих других подсемейств в процессе, называемом «боковой сигнализацией»^3,4,5,6,7,8, и что существуют смешанные комплексы SMAD, состоящие как из SMAD1/5, так и из SMAD2/3, ^{членов3,9} . Два активированных R-SMAD впоследствии образуют тримерные комплексы с общим медиатором SMAD4. Эти комплексы транскрипционных факторов затем способны транслоцироваться в ядро и регулировать транскрипцию генов-мишеней. SMAD могут взаимодействовать с различными транскрипционными коактиваторами и ко-репрессорами, что приводит к диверсификации возможностей регулирования генов-мишеней10. Дерегулирование передачи сигналов SMAD имеет серьезные последствия при различных заболеваниях. В соответствии с этим, несбалансированная передача сигналов TGFβ / BMP может привести к тяжелым сосудистым патологиям, таким как гипертония легочной артерии, наследственная геморрагическая телеангиэктазия или атеросклероз3,11,12,13,14.

Эндотелиальные клетки (ЭК) образуют самый внутренний слой кровеносных сосудов и, следовательно, подвергаются напряжению сдвига (SS), силе трения, оказываемой вязким потоком крови. Интересно, что ЭК, находящиеся в частях сосудистой системы, которые подвергаются воздействию высоких уровней однородных, ламинаров СС, содержатся в гомеостатическом и спокойном состоянии. Напротив, ЭК, которые испытывают низкий, неоднородный SS, например, при бифуркациях или меньшем искривлении дуги аорты, являются пролиферативными и активируют воспалительные ^пути15. В свою очередь, участки дисфункциональных ЭК склонны к развитию атеросклероза. Интересно, что EC в этих атеропроновых областях демонстрируют аберрантно высокие уровни активированных SMAD2/3 и SMAD1/516,17,18. В этом контексте было обнаружено, что усиленная передача сигналов TGFβ/BMP является ранним событием в развитии атеросклеротических ^{поражений19}, и было обнаружено, что интерференция передачи сигналов BMP заметно снижает воспаление сосудов, образование атеромы и связанное с этим кальцификацию20.

Анализ бесконтактного лигирования (PLA) является биохимическим методом для изучения белково-белковых взаимодействий in ^situ21,22. Он опирается на специфичность антител различных видов, которые могут связывать интересующие белки-мишени, что позволяет высокоспецифично обнаруживать эндогенные белковые взаимодействия на уровне одной клетки. Здесь первичные антитела должны связываться со своим целевым эпитопом на расстоянии менее 40 нм, чтобы обеспечить ^{обнаружение23}. Таким образом, PLA очень полезен по сравнению с традиционными подходами коиммунопреципитации, где для обнаружения эндогенных белковых взаимодействий требуется несколько миллионов клеток. В PLA видоспецифические вторичные антитела, ковалентно связанные с фрагментами ДНК (называемые зондами Plus и Minus), связывают первичные антитела, и если интересующие белки взаимодействуют, зонды Plus и Minus находятся в непосредственной близости. ДНК перевязывается на следующем этапе, и становится возможным амплификация круговой ДНК. Во время амплификации флуоресцентно меченые комплементарные олигонуклеотиды связываются с синтезированной ДНК, что позволяет визуализировать эти белковые взаимодействия с помощью обычной флуоресцентной микроскопии.

Описанный здесь протокол позволяет ученым количественно сравнивать количество активных транскрипционных комплексов SMAD в условиях атеропротектора и атеропрона SS in vitro с использованием PLA. SS генерируется с помощью программируемой пневматической насосной системы, которая способна генерировать ламинарный однонаправленный поток определенных уровней и позволяет поэтапно увеличивать скорость потока. Этот метод позволяет обнаруживать взаимодействия между SMAD1/5 или SMAD2/3 с SMAD4, а также смешанными R-SMAD комплексами. Он может быть легко расширен для анализа взаимодействий SMAD с транскрипционными сорегуляторами или для транскрипционных факторных комплексов, отличных от SMAD. На рисунке 1 показаны основные этапы протокола, представленные ниже.

Рисунок 1: Схематическое представление описанного протокола. (A) Ячейки, засеянные в 6-канальные слайды, подвергаются сдвиговому напряжению с помощью пневматической насосной системы. (B) Фиксированные ячейки используются для эксперимента PLA или для контрольных условий. (C) Изображения экспериментов PLA получаются с помощью флуоресцентного микроскопа и анализируются с помощью программного обеспечения для анализа ImageJ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

протокол

1. Воздействие клеточной культуры и напряжения сдвига жидкости

ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве примера для изучения взаимодействия SMAD, индуцированного SS, были использованы EC ВЕН человека (HUVECs). Протокол, описанный ниже, может быть применен к каждому типу ячеек, реагирующих на SS.

1. Покрыть 6-канальный слайд 0,1% желатином свиной кожи в PBS в течение 30 мин при 37 °C.
2. Семена HUVECs в предварительно покрытых 6-канальных слайдах при плотности 2,5 x ¹⁰⁶ клеток на мл в 30 мкл полной среды M199.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения дополнительной информации о том, как засеять ячейки на слайде потока, см. ^{ссылку24}.
3. Дайте клеткам прилипнуть в течение 1 ч при 37 °C в увлажненном инкубаторе.
4. Добавьте 60 мкл предварительно нагретой полной среды M199 в каждый из резервуаров.
5. Культивировать в течение 2 дней, с мягким средним обменом один раз в день, при 37 °C в увлажненном инкубаторе.
   1. Аспирировать резервуары полностью, добавить 120 мкл предварительно нагретой полной среды M199 в один из резервуаров и аспирировать с другой стороны.
   2. Добавьте 60 мкл предварительно нагретой полной среды M199 в оба резервуара.
6. Соберите и запустите настройку потока, как описано в ссылке ²⁵.
   1. Монтаж НКТ на жидкостных агрегатах. Здесь силиконовые трубки диаметром 0,8 мм и 1,6 мм используются для применения напряжения сдвига 1 дин/^см2 и 30 дин/^см2 соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Материал и длина трубки должны оставаться постоянными, так как изменения могут влиять на возникающее напряжение сдвига. В общем, можно использовать другие комбинации насосных систем и трубок, если известно результирующее напряжение сдвига, и насос создает устойчивый ламинарный поток.
   2. Заполните резервуары соответствующим количеством предварительно нагретой полной среды M199 (минимум 10 мл).
   3. Подключите жидкостные блоки с трубкой к насосной системе и выполните предварительный запуск без ячеек, чтобы уравновесить среду и удалить оставшийся ^{воздух25}.
   4. Последовательно соединяйте одиночные каналы на 6-канальном затворе друг с другом с помощью трубки последовательного подключения. Первый и последний канал на слайде будут соединены с трубкой, собранной в 1.6.1 (схему см. на рисунке 1А ). Будьте осторожны, чтобы не вводить воздух в систему, так как это может серьезно повредить клетки. Дополнительную информацию о последовательном соединении можно найти в ^{ссылке26}.
   5. Для воздействия на клетки высоких уровней напряжения сдвига (>20 дин/^см2) используют фазу рампы, т. е. увеличивают напряжение сдвига поэтапно с фазами адаптации. Ступени могут быть установлены с шагом 5 дин/^см2 в течение 30 мин.

2. Фиксация

1. Отсоедините слайды от насосов после воздействия жидкости SS. Используйте зажимы на трубке при отсоединении, чтобы избежать разлива среды в инкубаторе.
2. Сразу же передача потока скользит по льду, в то время как оставшаяся трубка отсоединяется последовательно. При извлечении трубки из резервуаров резервуар с другой стороны следует держать закрытым пальцем, чтобы избежать улавливания пузырьков воздуха в канале. Это может помешать шагам фиксации.
3. Удерживая клетки на льду, тщательно аспирируйте среду из резервуаров, но не из канала, где находятся клетки. Впоследствии промывку образцов холодной стерильной ПБС (4 °C) с трехкратным увеличением объема канала (90 мкл). Добавьте PBS в один резервуар и осторожно аспирируйте из другого резервуара. Повторите этот шаг в каждом из 6 каналов на слайд.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех этапов промывки и инкубации соответствующий раствор добавляют в один из резервуаров, что приводит к обмену растворами в канале. Чтобы обеспечить полную замену растворов в канале, избыточный раствор затем аспирируется из другого резервуара. Раствор сверху клеток в канале не удаляется. Клетки не должны высыхать в любое время. Поэтому важно тщательно мыть без введения пузырьков воздуха в слайды.
4. Зафиксируйте клетки, добавив 90 мкл буферного 4% раствора PFA в тот же резервуар, куда PBS был добавлен предварительно, и аналогичным образом аспирируйте жидкость из другого резервуара. Повторите этот шаг на каждом канале каждого слайда. После добавления раствора PFA перенесите образцы изо льда до комнатной температуры (RT) и инкубируйте в течение 20 мин.
   ВНИМАНИЕ: PFA токсичен и должен обрабатываться осторожно. Используйте перчатки и работайте под вытяжным капюшоном.
5. Промывайте ячейки 3x pBS (RT), добавляя их в один резервуар и осторожно аспирируя из другого резервуара. Опустошите только водоемы, следя за тем, чтобы канал не пересыхал. Повторите этот шаг для каждого из 6 каналов на слайд.
6. Погасить фиксацию ПФА путем добавления 90 мкл 50 мМ хлорида аммония в ПБС в одном из резервуаров. Аспирировать избыточный раствор из другого резервуара. Повторите для каждого канала на слайде. Инкубируйте образцы в течение 10 минут на RT.
7. Промывайте, как описано в шаге 2.5.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе образцы могут храниться при температуре 4 °C в течение ночи, или протокол может быть немедленно продолжен с блокированием и первичной инкубацией антител (см. этап 3).

3. Блокирование и первичная инкубация антител

1. Чтобы пропитать клетки, добавьте 90 мкл 0,3% Тритона-Х-100 в PBS в опорожненном резервуаре и аспират из другого резервуара для каждого канала. Инкубировать в течение 10 мин на РТ.
2. Промывайте, как описано в шаге 2.5.
3. Добавить 90 мкл стерильного блокирующего раствора PLA в один резервуар канала и аспирировать с другой стороны. Повторите этот шаг для каждого канала. Блок на 1 ч при 37 °С в увлажненной камере.
   1. Чтобы сделать увлажненную камеру, используйте 10-сантиметровую посуду с влажной тканью, запечатанную восковой пленкой, и поместите посуду в инкубатор. В качестве альтернативы могут использоваться другие форматы камер влажности, которые обеспечивают влажную атмосферу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, можно использовать самодельный блокирующий раствор (например, 3% (мас./об.) BSA в PBS, стерильный фильтрованный).
4. Получают первичные антитела (1:100) в разбавителе антител PLA. Приготовьте 30 мкл раствора на канал. Добавьте оба первичных антитела одновременно и вихревые.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно может быть использован самодельный разбавитель антител (например, 1% (мас./об.) BSA в PBS). Антитела, используемые здесь, представляют собой комбинации SMAD1-SMAD2/3, SMAD2/3-SMAD4 и фосфо-SMAD1/5-SMAD4. Подробную информацию можно найти в Таблице материалов.
5. Перед применением первичных антител аспирируют блокирующий раствор из резервуаров, а также, осторожно, из русла. Пипетка 30 мкл раствора первичного антитела сразу же попадает в пустой канал путем наклона канала при добавлении раствора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняют удаление блокирующего раствора и добавление раствора антитела канал за каналом, чтобы клетки не пересыхали между ними.
6. Инкубировать образцы с первичными антителами в течение ночи в увлажненных камерах при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация также может быть выполнена в течение 1 ч при комнатной температуре, если вы заинтересованы в продолжении следующих шагов в тот же день.

4. Инкубация зонда PLA

ПРИМЕЧАНИЕ: На всех этапах, указанных в разделах 4.1-7.3, моющие буферы А и В хранятся при температуре 4°С и должны быть нагреты до РТ перед использованием.

1. Разбавляют PLA-зонды (+)-мыши и (-)-кролика до 1:5 в растворе разбавителя антител PLA (или 1% BSA). Приготовьте 30 мкл на канал.
2. Промывайте образцы 2x в течение 5 мин, используя 90 мкл промывочного буфера A на RT, добавляя его в один из резервуаров и осторожно аспирируя из другого резервуара. Повторите этот шаг для каждого из 6 каналов на слайд.
3. Тщательно аспирируйте промывочный буфер А и добавьте 30 мкл зондового раствора PLA (приготовленного на стадии 4.1), аналогично добавлению первичных антител на стадии 3.5.
4. Инкубировать образцы в течение 1 ч при 37 °C в увлажненной камере.

5. Перевязка

1. Промывайте образцы 2x в течение 5 мин, используя 90 мкл промывочного буфера A при RT, как описано в 4.2.
2. Приготовьте разбавление лигационного буфера в 1:5 в деионизированной воде. Используйте этот буфер для разбавления фермента лигазы до 1:40 (на льду). Используйте 30 мкл на канал.
3. Полностью аспирировать промывочный буфер А и добавить раствор для лигирования, как описано в 3.5.
4. Инкубировать образцы в течение 30 мин при 37 °C в увлажненной камере.

6. Усиление

1. Промывайте образцы 2x в течение 2 мин, используя 90 мкл промывочного буфера A при RT, как описано в 4.2.
2. Подготовьте буфер амплификации, разбавив его 1:5 в деионизированной воде и используйте его для разбавления фермента полимеразы до 1:80 (на льду). Защита от света. Приготовьте 30 мкл на канал.
3. Аспирировать промывочный буфер А полностью и сразу же добавить приготовленный амплификационный раствор в пустой канал, как описано в 3.5. Инкубировать образцы в течение 100 мин при 37 °C в увлажненной камере.

7. Монтаж

1. Промывайте образцы 2x в течение 10 мин, используя 90 мкл wash Buffer B на RT, как описано в 4.2. Добавьте DAPI (1:500) из 1 мг/мл исходного раствора (в деионизированной воде) при первой промывке, чтобы окрасить ядра. Не сушите канал.
2. Разбавьте промывочный буфер B в деионизированной воде (1:10) и промыть 1x 90 мкл 0,1x буферного раствора B, как описано в 4.2.
3. Аспирировать промывочный буфер В полностью и сразу же добавить 2-3 капли жидкой монтажной среды в один резервуар. Распределите его по каналу, наклонив слайд. Храните образцы при температуре 4 °C во увлажненной среде до получения изображения.

8. Получение изображений

1. Получение изображений с помощью флуоресцентного микроскопа. Убедитесь, что соответствующие фильтры, устанавливающие флуоресцентные датчики PLA, доступны.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Полезно использовать конфокальный микроскоп, если это возможно, так как полученные пятна PLA более определены. Это также поддерживает дальнейшую обработку изображений и анализ данных.

9. Анализ и количественная оценка изображений с использованием ImageJ/FIJI

1. Обрабатывайте экспортированные изображения (.tiff) с помощью программы обработки изображений, такой как ^ImageJ27.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все скрипты, используемые в этом исследовании и необходимые для автоматического подсчета клеточных, ядерных и всех событий PLA (на ячейку), можно найти в репозитории GitHub: https://github.com/Habacef/Proximity-Ligation-Assay-analysis. Выполняйте статистический анализ с помощью любой подходящей программы или инструмента.

Результаты

Ранее мы использовали PLA для обнаружения взаимодействий различных белков ^SMAD3 и анализировали изменения фосфорилирования ^SMAD28, вызванные напряжением сдвига28.

Здесь оба способа были объединены с протоколом, описанным выше. HUVEC подвергали сдвигово...

Обсуждение

Протокол на основе PLA, описанный здесь, предлагает эффективный способ определения непосредственной близости двух белков (например, их прямого взаимодействия) в ЭК, подверженных сдвиговому напряжению с количественным и пространственным разрешением. Используя проточные слайды с нескол...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide VI 0.4	ibidi	80606	6-channel slide
Ammonium Chloride	Carl Roth	K298.1	Quenching
Bovine Serum Albumin	Carl Roth	8076.4	Blocking
DAPI	Sigma Aldrich/ Merck	D9542	Stain DNA/Nuclei
DPBS	PAN Biotech	P04-53500	PBS
Duolink In Situ Detection Reagents Green	Sigma Aldrich/ Merck	DUO92014	PLA kit containing Ligase, ligation buffer, polymerase and amplification buffer (with green labeled oligonucleotides)
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS	Sigma Aldrich/ Merck	DUO92004	MINUS probe
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS	Sigma Aldrich/ Merck	DUO92002	PLUS probe
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence	Sigma Aldrich/ Merck	DUO82049	PLA wash buffers A and B
Endothelial Cell Growth Supplement	Corning		supplement for medium (ECGS)
Fetal calf Serum			supplement for medium
FIJI			Image Analysis software
Formaldehyde solution 4% buffered	KLINIPATH/VWR	VWRK4186.BO1	PFA
Full medium			M199 basal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +  25 µg/mL Hep +   50 µg/mL ECGS
Gelatin from porcine skin, Type A	Sigma Aldrich	G2500	Use 0.1% in PBS for coating of flow channels
GraphPad Prism v.7	GarphPad		Statistical Program used for the Plots and statistical calculations
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma Aldrich	H4784-250MG	supplement for medium (Hep)
HUVECs
ibidi Mounting Medium	ibidi	50001	Liquid mounting medium
ibidi Pump System	ibidi	10902	pneumatic pump
Leica TCS SP8	Leica		confocal microscope
L-Glutamin 200mM	PAN Biotech	P04-80100	supplement for medium (L-Glu)
Medium 199	Sigma Aldrich	M2154	Base medium
mouse anti- SMAD1 Antibody	Abcam	ab53745	Suited for PLA
mouse anti- SMAD2/3 Antibody	BD Bioscience	610843	Not suited for PLA in combination with CST 9515
mousee anti- SMAD4 Antibody	Sanata Cruz Biotechnology	sc-7966	Suited for PLA
Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml	PAN Biotech	P06-07100	supplement for medium (P/S)
Perfusion Set WHITE	ibidi	10963	Tubings used for 1 dyn/cm2
Perfusion Set YELLOW and GREEN	ibidi	10964	Tubings used for 30 dyn/cm2
rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody	Cell Signaling Technologies	9516	Suited for PLA
rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody	Cell Signaling Technologies	8685	Suited for PLA
rabbit anti- SMAD4 Antibody	Cell Signaling Technologies	9515	Not suited for PLA in combination with BD 610843
Serial Connector for µ-Slides	ibidi	10830	serial connection tubes
Triton X-100	Carl Roth	6683.1	Permeabilization