Visualizzazione e quantificazione della segnalazione TGFβ/BMP/SMAD in diverse condizioni di sforzo di taglio del fluido utilizzando il test di prossimità-legatura

Riepilogo

Qui, stabiliamo un protocollo per visualizzare e analizzare simultaneamente più complessi SMAD utilizzando il test di legatura di prossimità (PLA) in cellule endoteliali esposte a condizioni patologiche e fisiologiche di stress da taglio del fluido.

Abstract

La segnalazione del fattore di crescita trasformante β (TGFβ) / proteina morfogenetica ossea (BMP) è strettamente regolata ed equilibrata durante lo sviluppo e l'omeostasi del sistema vascolare Pertanto, la deregolazione in questa via di segnalazione provoca gravi patologie vascolari, come l'ipertensione dell'arteria polmonare, la teleangectasia emorragica ereditaria e l'aterosclerosi. Le cellule endoteliali (CE), come strato più interno dei vasi sanguigni, sono costantemente esposte allo stress da taglio fluido (SS). Modelli anormali di SS fluida hanno dimostrato di migliorare la segnalazione TGFβ / BMP, che, insieme ad altri stimoli, induce l'aterogenesi. In relazione a questo, l'ateroprone, SS a basso laminare è stato trovato per migliorare la segnalazione TGFβ / BMP mentre l'ateroprotettivo, SS laminare elevato, diminuisce questa segnalazione. Per analizzare in modo efficiente l'attivazione di questi percorsi, abbiamo progettato un flusso di lavoro per studiare la formazione di complessi di fattori di trascrizione in condizioni di SS a basso laminare e SS laminare elevato utilizzando un sistema di pompe pneumatiche disponibile in commercio e un test di legatura di prossimità (PLA).

La segnalazione attiva TGFβ/BMP richiede la formazione di complessi trimerici SMAD costituiti da due SMED regolatori (R-SMAD); SMAD2/3 e SMAD1/5/8 per la segnalazione TGFβ e BMP, rispettivamente) con un mediatore comune SMAD (co-SMAD; SMAD4). Utilizzando il PLA mirato a diverse subunità del complesso trimerico SMAD, cioè R-SMAD / co-SMAD o R-SMAD / R-SMAD, la formazione di complessi di fattori di trascrizione SMAD attivi può essere misurata quantitativamente e spazialmente utilizzando la microscopia a fluorescenza.

L'utilizzo di guide di flusso con 6 piccoli canali paralleli, collegabili in serie, consente di studiare la formazione complessa del fattore di trascrizione e di inserire i necessari controlli.

Il flusso di lavoro qui spiegato può essere facilmente adattato per studi mirati alla vicinanza degli SMED ad altri fattori di trascrizione o a complessi di fattori di trascrizione diversi dagli SMAD, in diverse condizioni di SS fluida. Il flusso di lavoro qui presentato mostra un modo rapido ed efficace per studiare la segnalazione TGFβ/BMP indotta da SS fluidi nelle CE, sia quantitativamente che spazialmente.

Introduzione

Le proteine della superfamiglia dei fattori di crescita trasformanti beta (TGFβ) sono citochine pleiotropiche con una varietà di membri, tra cui TGFβs, proteine morfogenetiche ossee (BMP) e ^Activins1,2. Il legame del ligando induce la formazione di oligomeri recettoriali che portano alla fosforilazione e, quindi, all'attivazione dello SMAD citosolico regolatorio (R-SMAD). A seconda della sottofamiglia di ligandi, vengono attivati diversi R-SED1,2. Mentre TGFβs e Activins inducono principalmente fosforilazione di SMAD2/3, BMP inducono fosforilazione SMAD1/5/8. Tuttavia, ci sono prove crescenti che BMP e TGFβs / Activins attivano anche R-SMAD della rispettiva altra sottofamiglia, in un processo definito come "segnalazione laterale" ^3,4,5,6,7,8 e che esistono complessi SMAD misti costituiti da entrambi, SMAD1/5 e SMAD2/3, ^members3,9 . Due R-SMAD attivati formano successivamente complessi trimerici con il mediatore comune SMAD4. Questi complessi di fattori di trascrizione sono quindi in grado di traslocare nel nucleo e regolare la trascrizione dei geni bersaglio. Gli SED possono interagire con una varietà di diversi co-attivatori e co-repressori trascrizionali, portando alla diversificazione delle possibilità di regolare i geni ^bersaglio10. La deregolamentazione della segnalazione SMAD ha gravi implicazioni in una varietà di malattie. In linea con questo, la segnalazione Squilibrata di TGFβ/BMP può portare a gravi patologie vascolari, come ipertensione dell'arteria polmonare, teleangectasia emorragica ereditaria o aterosclerosi3,11,12,13,14.

Le cellule endoteliali (CE) formano lo strato più interno dei vasi sanguigni e sono, quindi, esposte allo stress da taglio (SS), una forza di attrito esercitata dal flusso viscoso del sangue. È interessante notare che le CE che risiedono nelle parti della vascolarizzazione, che sono esposte ad alti livelli di SS uniforme e laminare, sono mantenute in uno stato omeostatico e quiescente. Al contrario, le CE che sperimentano SS basse e non uniformi, ad esempio a biforcazioni o la minore curvatura dell'arco aortico, sono proliferative e attivano le vie ^{infiammatorie15}. A loro volta, i siti di EC disfunzionali sono inclini a sviluppare aterosclerosi. È interessante notare che gli EC in queste aree di ateropatrone mostrano livelli aberrantemente elevati di SMAD2/3 e SMAD1/516,17,18 attivati. In questo contesto, la segnalazione TGFβ/BMP potenziata è risultata essere un evento precoce nello sviluppo di lesioni aterosclerotiche19 e l'interferenza con la segnalazione BMP è risultata ridurre notevolmente l'infiammazione vascolare, la formazione di ateroma e la calcificazione ^associata20.

Proximity Ligation Assay (PLA) è una tecnica biochimica per studiare le interazioni proteina-proteina in ^situ21,22. Si basa sulla specificità di anticorpi di diverse specie che possono legare proteine bersaglio di interesse, consentendo il rilevamento altamente specifico di interazioni proteiche endogene a livello di singola cellula. Qui, gli anticorpi primari devono legarsi al loro epitopo bersaglio a una distanza inferiore a 40 nm per consentire il ^{rilevamento23}. Pertanto, il PLA è molto utile rispetto ai tradizionali approcci di co-immunoprecipitazione, in cui sono necessari diversi milioni di cellule per rilevare le interazioni proteiche endogene. Nel PLA, gli anticorpi secondari specie-specifici, legati covalentemente ai frammenti di DNA (chiamati sonde Plus e Minus), legano gli anticorpi primari e se le proteine di interesse interagiscono, le sonde Plus e Minus si avvicinano. Il DNA viene legato nella fase successiva e l'amplificazione del cerchio rotolante del DNA circolare è resa possibile. Durante l'amplificazione, oligonucleotidi complementari marcati fluorescenti si legano al DNA sintetizzato, consentendo a queste interazioni proteiche di essere visualizzate mediante microscopia a fluorescenza convenzionale.

Il protocollo qui descritto consente agli scienziati di confrontare quantitativamente il numero di complessi di trascrizione SMAD attivi in condizioni ateroprotettive e ateroprotroniche SS in vitro utilizzando PLA. SS è generato tramite un sistema di pompe pneumatiche programmabili che è in grado di generare flusso unidirezionale laminare di livelli definiti e consente aumenti graduali delle portate. Questo metodo consente il rilevamento di interazioni tra SMAD1/5 o SMAD2/3 con SMAD4, nonché complessi misti-R-SMAD. Può essere facilmente espanso per analizzare le interazioni degli SMAD con i co-regolatori trascrizionali o con complessi di fattori di trascrizione diversi dagli SMAD. La Figura 1 mostra i passaggi principali del protocollo presentati di seguito.

Figura 1: Rappresentazione schematica del protocollo descritto. (A) Le celle seminate in vetrini a 6 canali sono esposte a sollecitazioni di taglio con un sistema di pompe pneumatiche. (B) Le celle fisse sono utilizzate per esperimenti PLA o per condizioni di controllo. (C) Le immagini degli esperimenti PLA vengono acquisite con un microscopio a fluorescenza e vengono analizzate utilizzando il software di analisi ImageJ. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

1. Coltura cellulare ed esposizione allo stress da taglio dei fluidi

NOTA: le EC delle vene ombelicali umane (HUVEC) sono state utilizzate come esempio per studiare l'interazione indotta da SS di SMED. Il protocollo descritto di seguito può essere applicato a ogni tipo di cella reattiva SS.

1. Rivestire il vetrino a 6 canali con gelatina cutanea suina allo 0,1% in PBS per 30 minuti a 37 °C.
2. HUVEC di semi in vetrini preverniciati a 6 canali ad una densità di 2,5 x ¹⁰⁶ celle per mL in 30 μL di M199 full medium.
   NOTA: per ulteriori informazioni su come eseguire il seeding delle celle nella diapositiva di flusso, vedere ^reference24.
3. Lasciare che le cellule aderiscano per 1 ora a 37 °C in un incubatore umidificato.
4. Aggiungere 60 μL di M199 full medium preriscaldato a ciascuno dei serbatoi.
5. Coltura per 2 giorni, con un delicato scambio medio una volta al giorno, a 37 °C in un incubatore umidificato.
   1. Aspirare completamente i serbatoi, aggiungere 120 μL di mezzo completo M199 preriscaldato in uno dei serbatoi e aspirare dall'altro lato.
   2. Aggiungere 60 μL di M199 full medium preriscaldato a entrambi i serbatoi.
6. Assemblate e avviate la configurazione del flusso come descritto nel ^{riferimento25}.
   1. Montare tubi su unità fluidiche. Qui, i tubi in silicone con un diametro di 0,8 mm e 1,6 mm vengono utilizzati per applicare sollecitazioni di taglio rispettivamente di 1 dyn / ^cm2 e 30 dyn / ^cm2.
      NOTA: il materiale e la lunghezza del tubo devono rimanere costanti, poiché le modifiche potrebbero influenzare la tensione di taglio risultante. In generale, è possibile utilizzare altre combinazioni di sistemi di pompaggio e tubi, purché lo stress di taglio risultante sia noto e la pompa crei un flusso laminare costante.
   2. Riempire i serbatoi con una quantità appropriata di M199 full medium preriscaldato (minimo 10 ml).
   3. Collegare le unità fluidiche con il tubo al sistema di pompaggio ed eseguire una pre-corsa senza celle per equilibrare il mezzo e rimuovere l'eventuale aria ^rimanente25.
   4. Collegare in serie i singoli canali sulla diapositiva a 6 canali l'uno all'altro utilizzando tubi di connessione seriale. Il primo e l'ultimo canale della slitta saranno collegati al tubo assemblato in 1.6.1 (vedere la Figura 1A per uno schema). Fare attenzione a non introdurre aria nel sistema in quanto ciò potrebbe danneggiare gravemente le cellule. Ulteriori informazioni sulla connessione seriale sono disponibili in ^reference26.
   5. Per l'esposizione delle cellule ad alti livelli di sforzo di taglio (>20 dyn/^cm2), utilizzare una fase di rampa, ovvero aumentare lo sforzo di taglio gradualmente con fasi di adattamento. I passi possono essere impostati con incrementi di 5 dyn/^cm2 per 30 min.

2. Fissazione

1. Staccare le diapositive dalle pompe dopo l'esposizione al fluido SS. Utilizzare morsetti sul tubo durante il distacco, per evitare la fuoriuscita media nell'incubatore.
2. Il flusso di trasferimento istantaneo scorre sul ghiaccio, mentre il tubo rimanente viene staccato sequenzialmente. Quando si rimuove il tubo dai serbatoi, il serbatoio sull'altro lato deve essere tenuto chiuso con un dito per evitare di intrappolare bolle d'aria nel canale. Ciò potrebbe interferire con i passaggi di fissazione.
3. Mantenendo le cellule sul ghiaccio, aspirare accuratamente il mezzo dai serbatoi ma non dal canale in cui risiedono le cellule. Successivamente, lavare i campioni con PBS sterile freddo (4 °C) con tre volte il volume del canale (90 μL). Aggiungere PBS in un serbatoio e aspirare con attenzione dall'altro serbatoio. Ripetere questo passaggio in ciascuno dei 6 canali per diapositiva.
   NOTA: Per tutte le fasi di lavaggio e incubazione la rispettiva soluzione viene aggiunta in uno dei serbatoi che porta ad uno scambio di soluzioni nel canale. Per consentire la sostituzione completa delle soluzioni nel canale, la soluzione in eccesso viene quindi aspirata dall'altro serbatoio. La soluzione sulla parte superiore delle celle nel canale non viene rimossa. Le cellule non dovrebbero asciugarsi in nessun momento. Pertanto, è importante lavare accuratamente senza alcun inserimento di bolle d'aria nelle diapositive.
4. Fissare le celle aggiungendo 90 μL di soluzione tamponata al 4% di PFA nello stesso serbatoio in cui è stato aggiunto il PBS in anticipo e allo stesso modo aspirare il liquido dall'altro serbatoio. Ripetere questo passaggio in ogni canale di ogni diapositiva. Dopo l'aggiunta della soluzione di PFA, trasferire i campioni dal ghiaccio alla temperatura ambiente (RT) e incubare per 20 minuti.
   ATTENZIONE: il PFA è tossico e deve essere maneggiato con attenzione. Usa i guanti e lavora sotto un cappuccio di fumo.
5. Lavare le celle 3x con PBS (RT) aggiungendolo in un serbatoio e aspirando con attenzione dall'altro serbatoio. Svuotare solo i serbatoi, assicurandosi di non asciugare il canale. Ripetere questo passaggio per ciascuno dei 6 canali per diapositiva.
6. Estinguere la fissazione del PFA aggiungendo 90 μL di cloruro di ammonio ambiente da 50 mM in PBS in uno dei serbatoi. Aspirare la soluzione in eccesso dall'altro serbatoio. Ripetere l'operazione per ogni canale della diapositiva. Incubare i campioni per 10 minuti a RT.
7. Lavare come descritto nel passaggio 2.5.
   NOTA: A questo punto, i campioni possono essere conservati a 4 °C durante la notte, oppure il protocollo può essere immediatamente continuato con il blocco e l'incubazione di anticorpi primari (vedere fase 3).

3. Blocco e incubazione di anticorpi primari

1. Per permeabilizzare le celle, aggiungere 90 μL di Triton-X-100 allo 0,3% in PBS in un serbatoio svuotato e aspirare dall'altro serbatoio per ciascun canale. Incubare per 10 minuti a RT.
2. Lavare come descritto nel passaggio 2.5.
3. Aggiungere 90 μL di soluzione bloccante pla sterile in un serbatoio di un canale e aspirare dall'altro lato. Ripetere questo passaggio per ogni canale. Blocco per 1 ora a 37 °C in camera umidificata.
   1. Per realizzare una camera umidificata, utilizzare un piatto di 10 cm con tessuto bagnato sigillato con pellicola di cera e posizionare il piatto nell'incubatrice. In alternativa, è possibile utilizzare altri formati di camera di umidità che forniscono un'atmosfera umida.
      NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare una soluzione di blocco autoprodotta (ad esempio, 3% (p / v) BSA in PBS, filtrato sterile).
4. Preparare gli anticorpi primari (1:100) nel diluente anticorpale PLA. Preparare 30 μL della soluzione per canale. Aggiungere entrambi gli anticorpi primari contemporaneamente e vortice.
   NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare un diluente anticorpale autoprodotto (ad esempio, 1% (p/v) BSA in PBS). Gli anticorpi utilizzati qui sono combinazioni di SMAD1-SMAD2/3, SMAD2/3-SMAD4 e fosfo-SMAD1/5-SMAD4. Informazioni dettagliate sono disponibili nella Tabella dei materiali.
5. Prima dell'applicazione di anticorpi primari, aspirare la soluzione bloccante dai serbatoi e, anche, con attenzione dal canale. Pipettare 30 μL della soluzione anticorpale primaria immediatamente nel canale vuoto inclinando il canale mentre si aggiunge la soluzione.
   NOTA: Eseguire la rimozione della soluzione bloccante e l'aggiunta della soluzione anticorpale canale per canale per garantire che le cellule non si secchino nel mezzo.
6. Incubare campioni con gli anticorpi primari durante la notte in camere umidificate a 4 °C.
   NOTA: L'incubazione può essere eseguita anche per 1 ora a temperatura ambiente, se interessati a continuare con i seguenti passaggi nello stesso giorno.

4. Incubazione della sonda PLA

NOTA: per tutte le fasi di cui al punto 4.1-7.3, i tamponi di lavaggio A e B sono conservati a 4 °C e devono essere riscaldati a RT prima dell'uso.

1. Diluire le sonde PLA (+)-mouse e (-)-coniglio a 1:5 in soluzione di diluente anticorpale PLA (o BSA all'1%). Preparare 30 μL per canale.
2. Lavare i campioni 2 volte per 5 minuti utilizzando 90 μL del tampone di lavaggio A a RT aggiungendolo in uno dei serbatoi e aspirando attentamente dall'altro serbatoio. Ripetere questo passaggio per ciascuno dei 6 canali per diapositiva.
3. Aspirare accuratamente il tampone di lavaggio A e aggiungere 30 μL di soluzione di sonda PLA (preparata nella fase 4.1), simile all'aggiunta di anticorpi primari nella fase 3.5.
4. Incubare i campioni per 1 ora a 37 °C in una camera umidificata.

5. Legatura

1. Lavare i campioni 2 volte per 5 minuti utilizzando 90 μL del tampone di lavaggio A a RT, come descritto al punto 4.2.
2. Preparare una diluizione 1:5 del tampone di legatura in acqua deionizzata. Utilizzare questo tampone per diluire l'enzima ligasi a 1:40 (su ghiaccio). Utilizzare 30 μL per canale.
3. Aspirare completamente il tampone di lavaggio A e aggiungere la soluzione di legatura come descritto al punto 3.5.
4. Incubare i campioni per 30 minuti a 37 °C in una camera umidificata.

6. Amplificazione

1. Lavare i campioni 2 volte per 2 minuti utilizzando 90 μL di tampone di lavaggio A a RT, come descritto al punto 4.2.
2. Preparare il tampone di amplificazione diluendolo 1:5 in acqua deionizzata e utilizzarlo per diluire l'enzima polimerasi a 1:80 (su ghiaccio). Proteggere dalla luce. Preparare 30 μL per canale.
3. Aspirare completamente il tampone di lavaggio A e aggiungere immediatamente la soluzione di amplificazione preparata nel canale vuoto, come descritto al punto 3.5. Incubare i campioni per 100 minuti a 37 °C in una camera umidificata.

7. Montaggio

1. Lavare i campioni 2 volte per 10 minuti utilizzando 90 μL di wash buffer B a RT come descritto al punto 4.2. Aggiungere DAPI (1:500) da 1 mg/mL di soluzione madre (in acqua deionizzata) al primo lavaggio per colorare i nuclei. Non asciugare il canale.
2. Diluire il tampone di lavaggio B in acqua deionizzata (1:10) e lavare 1x con 90 μL di soluzione tampone B 0,1x come descritto al punto 4.2.
3. Aspirare completamente il tampone di lavaggio B e aggiungere immediatamente 2-3 gocce del mezzo di montaggio del liquido in un serbatoio. Distribuiscilo nel canale inclinando la diapositiva. Conservare i campioni a 4 °C in un ambiente umidificato fino all'imaging.

8. Acquisizione di immagini

1. Acquisire immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza. Assicurarsi che i rispettivi filtri che si adattano alle sonde fluorescenti pla siano disponibili.
   NOTA: È utile utilizzare un microscopio confocale, se possibile, poiché le macchie di PLA ottenute sono più definite. Ciò supporta anche un'ulteriore elaborazione delle immagini e l'analisi dei dati.

9. Analisi e quantificazione delle immagini utilizzando ImageJ/FIJI

1. Elaborare le immagini esportate (.tiff) con un programma di elaborazione delle immagini, ad esempio ^ImageJ27.
   NOTA: tutti gli script utilizzati in questo studio e necessari per il conteggio automatico di eventi cellulari, nucleari e tutti gli eventi PLA (per cella) sono disponibili in un repository GitHub: https://github.com/Habacef/Proximity-Ligation-Assay-analysis. Eseguire analisi statistiche utilizzando qualsiasi programma o strumento adatto.

Risultati

In precedenza abbiamo utilizzato il PLA per rilevare le interazioni di diverse proteine ^SMAD3 e analizzato i cambiamenti indotti dallo stress di taglio nella fosforilazione ^SMAD28.

Qui, entrambi i metodi sono stati combinati con il protocollo sopra descritto. Gli HUVEC sono stati sottoposti a stress di taglio di 1 dyn/^cm2 e 30 dyn/^cm2 e analizzati per le interazioni dei fattori di trascrizione SMAD. Mostriamo che, rispetto a...

Discussione

Il protocollo basato sul PLA qui descritto offre un modo efficiente per determinare la stretta vicinanza di due proteine (ad esempio, la loro interazione diretta) nelle CE esposte allo stress di taglio con risoluzione quantitativa e spaziale. Utilizzando diapositive di flusso con più canali paralleli, diverse interazioni proteiche possono essere esaminate contemporaneamente in cellule in condizioni meccaniche identiche. Al contrario, i sistemi di camere di flusso costruiti su misura spesso utilizzano un singolo canale c...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide VI 0.4	ibidi	80606	6-channel slide
Ammonium Chloride	Carl Roth	K298.1	Quenching
Bovine Serum Albumin	Carl Roth	8076.4	Blocking
DAPI	Sigma Aldrich/ Merck	D9542	Stain DNA/Nuclei
DPBS	PAN Biotech	P04-53500	PBS
Duolink In Situ Detection Reagents Green	Sigma Aldrich/ Merck	DUO92014	PLA kit containing Ligase, ligation buffer, polymerase and amplification buffer (with green labeled oligonucleotides)
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS	Sigma Aldrich/ Merck	DUO92004	MINUS probe
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS	Sigma Aldrich/ Merck	DUO92002	PLUS probe
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence	Sigma Aldrich/ Merck	DUO82049	PLA wash buffers A and B
Endothelial Cell Growth Supplement	Corning		supplement for medium (ECGS)
Fetal calf Serum			supplement for medium
FIJI			Image Analysis software
Formaldehyde solution 4% buffered	KLINIPATH/VWR	VWRK4186.BO1	PFA
Full medium			M199 basal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +  25 µg/mL Hep +   50 µg/mL ECGS
Gelatin from porcine skin, Type A	Sigma Aldrich	G2500	Use 0.1% in PBS for coating of flow channels
GraphPad Prism v.7	GarphPad		Statistical Program used for the Plots and statistical calculations
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma Aldrich	H4784-250MG	supplement for medium (Hep)
HUVECs
ibidi Mounting Medium	ibidi	50001	Liquid mounting medium
ibidi Pump System	ibidi	10902	pneumatic pump
Leica TCS SP8	Leica		confocal microscope
L-Glutamin 200mM	PAN Biotech	P04-80100	supplement for medium (L-Glu)
Medium 199	Sigma Aldrich	M2154	Base medium
mouse anti- SMAD1 Antibody	Abcam	ab53745	Suited for PLA
mouse anti- SMAD2/3 Antibody	BD Bioscience	610843	Not suited for PLA in combination with CST 9515
mousee anti- SMAD4 Antibody	Sanata Cruz Biotechnology	sc-7966	Suited for PLA
Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml	PAN Biotech	P06-07100	supplement for medium (P/S)
Perfusion Set WHITE	ibidi	10963	Tubings used for 1 dyn/cm2
Perfusion Set YELLOW and GREEN	ibidi	10964	Tubings used for 30 dyn/cm2
rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody	Cell Signaling Technologies	9516	Suited for PLA
rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody	Cell Signaling Technologies	8685	Suited for PLA
rabbit anti- SMAD4 Antibody	Cell Signaling Technologies	9515	Not suited for PLA in combination with BD 610843
Serial Connector for µ-Slides	ibidi	10830	serial connection tubes
Triton X-100	Carl Roth	6683.1	Permeabilization