التمايز الماكروفياج والاستقطاب إلى النمط الظاهري M2 مثل باستخدام الإنسان Monocyte مثل THP-1 خط خلايا سرطان الدم

Summary

ترتبط الضامة المرتبطة بالورم (TAM) الشبيهة ب M2 بتطور الورم وضعف التكهن في السرطان. يعمل هذا البروتوكول كدليل مفصل للتمييز والاستقطاب بشكل مستنسخ بين الخلايا الشبيهة بخلايا THP-1 الأحادية في الضامة الشبيهة ب M2 في غضون 14 يوما. هذا النموذج هو الأساس للتحقيق في الآثار المضادة للالتهابات من تام داخل البيئة الدقيقة الورم.

Abstract

الضامة المرتبطة بالورم (TAM) يمكن تبديل التعبير والسيتوكين الشخصي وفقا للمحفزات الخارجية. هذه اللدونة الرائعة تمكن TAM من التكيف مع التغيرات المستمرة داخل البيئة الدقيقة للورم. الضامة يمكن أن يكون إما في المقام الأول الموالية للالتهابات (M1 مثل) أو المضادة للالتهابات (M2 مثل) الصفات ويمكن التبديل باستمرار بين هاتين الولايتين الرئيسيتين. ترتبط الضامة الشبيهة ب M2 داخل بيئة الورم بتطور السرطان وضعف التكهن في عدة أنواع من السرطان. وتستخدم العديد من الطرق المختلفة لتحفيز التمايز والاستقطاب من الخلايا THP-1 للتحقيق في الآليات الخلوية وبين الخلايا وآثار تام داخل البيئة الدقيقة للأورام. حاليا، لا يوجد نموذج راسخ للاستقطاب الضامة M2 مثل باستخدام خط الخلية THP-1، ونتائج التعبير وملامح السيتوكين من الضامة بسبب بعض المحفزات في المختبر تختلف بين الدراسات. يعمل هذا البروتوكول كإرشادات مفصلة للتمييز بين الخلايا الشبيهة بالخلايا الأحادية THP-1 إلى الضامة M0 وزيادة استقطاب الخلايا إلى النمط الظاهري الشبيه ب M2 في غضون 14 يوما. نحن نظهر التغيرات المورفولوجية للخلايا الشبيهة بالخلايا الأحادية THP-1 ، الضامة المتمايزة ، والكوائش المستقطبة الشبيهة ب M2 باستخدام المجهر الخفيف. هذا النموذج هو الأساس لنماذج خط الخلية التحقيق في الآثار المضادة للالتهابات من TAM وتفاعلاتها مع مجموعات الخلايا الأخرى من البيئة الدقيقة الورم.

Introduction

الضامة المرتبطة بالورم (TAM) ودورها في الالتهاب المزمن ، وظهور السرطان ، وتطور الورم هي أهداف مهمة في الأبحاث الحديثة^1،2. الخلايا الأحادية الدم الطرفية التي يتم تجنيدها إلى البيئة الدقيقة الأنسجة من الورم النامية تفرق إلى الضامة ويمكن استقطابها إلى نوعين فرعيين رئيسيين من الضامة³. يمثل الماكروفاج المنشط كلاسيكيا النمط الظاهري المؤيد للالتهابات في المقام الأول M1 ، ويظهر النوع الفرعي المنشط بدلا من M2 خصائص مضادة للالتهابات في الغالب⁴. الضامة يمكن التبديل بشكل حيوي بين هذين النمطين الظاهريين الرئيسيين اعتمادا على التمثيل الغذائي الخلوي، مع الأنواع الفرعية المتوسطة وجود كل من الصفات الالتهابية والمضادة للالتهابات⁵. يمثل TAM مجموعة غير متجانسة من كلا النمطين الظاهريين. ومع ذلك ، فإن وظيفة تعزيز الورم وضعف التكهن في أنواع مختلفة من السرطانات ترتبط بشكل خاص بال الضامة الشبيهة ب M2^6و7و8.

الملامح الوظيفية لل الضامة وتفاعلها مع الخلايا الأخرى داخل البيئة الدقيقة الورم معقدة وصعبة لالتقاط في بيئة متغيرة باستمرار خلال تطور الورم المستمر. يمكن أن توفر خطوط الخلية مجموعة خلايا متجانسة مع قابلية مستقرة للحياة في الثقافة ، والتي يمكن أن تسهل عملية إظهار آليات خلوية وبين الخلايا المحددة. خط الخلية THP-1 الشبيه بالخلايا الأحادية هو نظام نموذج مشروع للخلايا الأحادية البشرية الأولية⁹. وقد تم الحصول على هذا الخط الخلية خلدت تلقائيا من الدم المحيطي لطفل رضيع يبلغ من العمر سنة واحدة مع سرطان الدم الأحادي الحاد^9,10. تم الإبلاغ عن التمايز والاستقطاب من خلايا THP-1 من قبل العديد من الدراسات وتم تنفيذها بطرق مختلفة متعددة^{11،12،13،14}. التنشيط ، وبالتالي ، فإن استقطاب الضامة إلى النمط الظاهري الشبيه ب M1 يتبعه آلية ارتداد تعويضية مضادة للالتهابات ، وتعزيز النمط الظاهري الشبيه ب M2 من خلال السيتوكينات التي تنتجها الضامة الالتهابية ، مثل interleukin 6 (IL-6) أو^15،16. قد يكون هذا بمثابة آلية كسر لتوهين استجابة التهابية زائدة بعد تنشيط الخلية¹⁷. عملية التفريق والاستقطاب monocytes و THP-1 الخلايا الأحادية مثل في النمط الظاهري المضادة للالتهابات M2 مثل هو في حد ذاته يرافقه أيضا المحفزات الموالية للالتهابات التي يجب التغلب عليها. يمكن أن يكون سبب استجابة السيتوكين الالتهابي الإجهاد الميكانيكي¹⁸، مثل تغيير الوسائط لإعادة تغذية الخلايا ، أو إضافة مركبات كيميائية للتمييز بين خلايا THP-1 ، مثل phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) ، والحث على إنتاج عامل نخر الورم α (TNFα) ، إنترلوكين 1β (IL-1β) أو IL-6¹⁹. هذا تغيير التشكيل الجانبي التعبير السيتوكين كاستجابة لPMA يمكن أن تؤثر على ومنع الاستقطاب الضامة اللاحقة²⁰. فترات الراحة الكافية، كما ذكرت من قبل بعد العلاج PMA، تسمح لهذه الاستجابات الالتهابية لتقليل وتسهيل استقطاب الخلايا إلى النمط الظاهري M2 مثل^{متميزة 21}.

يوضح هذا البروتوكول طريقة لتمييز واستقطاب الخلايا الشبيهة بالخلايا الأحادية THP-1 إلى نمط الظاهري الشبيه ب M2 من الضامة في غضون 14 يوما.

Protocol

ملاحظة: يتم عرض نظرة عامة على الخطوات الموضحة في هذا البروتوكول في الشكل 1. تم شراء خط خلايا سرطان الدم البشري الشبيه بالخلايا الأحادية THP-1. تم إجراء تحليل تكرار ترادفي قصير لمصادقة خط الخلية THP-1. تنفيذ جميع الخطوات في ظل ظروف معقمة. ينمو خط الخلية أحادية الكيسة THP-1 في التعليق ولا يلتصق بأسطح زراعة الخلايا. يمكن أن يحدث الالتزام عن طريق التمييز بين الخلايا الأحادية في خلايا تشبه الضامة من خلال ، على سبيل المثال ، الإجهاد الميكانيكي أو علاج محدد مع PMA.

1. زراعة وصيانة الخلايا التي تشبه الخلايا الأحادية THP-1

1. تعيين مؤقت لمدة 150 ثانية. إزالة القارورة المجمدة التي تحتوي على خط الخلية THP-1(جدول المواد)من النيتروجين السائل وتذوب على الفور في حمام مياه نظيفة (37 درجة مئوية). بدء تشغيل جهاز ضبط الوقت بمجرد وضع القارورة في حمام الماء. تخفيف الغطاء للافراج عن الضغط الذي يتراكم بسبب عملية ذوبان ولكن تأكد من أن فتح أنبوب لا يتصل بالماء، لتجنب التلوث. الفترة الزمنية المثلى لإذابة الخلايا تقع بين 120-150 s. مواصلة ذوبان تعليق الخلية حتى يتم ترك رقاقة الجليد من حجم حوالي 4 ملم داخل القارورة. ثم انتقل إلى الخطوة التالية فورا.
2. نقل المرحلة السائلة من تعليق الخلية إلى أنبوب 15 مل يحتوي على 9 مل من وسائل الإعلام الدافئة (37 درجة مئوية) النمو(جدول المواد). ثم، نقل 1 مل من تعليق الخلايا المتوسطة الدافئة في قارورة THP-1 والعودة إلى أنبوب 15 مل لإذابة رقاقة الثلج المتبقية وتدفق القارورة لضمان عدم ترك أي خلايا وراءها.
3. اخلط التعليق برفق عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا مع ماصة 1000 ميكرولتر. إزالة عينة صغيرة (حوالي 10 ميكرولتر) لحساب الخلايا من أجل البقاء (باستخدام تريبان الأزرق للاستبعاد) في حين أنها نسج. قم بتدفير تعليق الخلية الدافئ عند 200 × ز لمدة 7 دقائق عند 37 درجة مئوية.
4. إزالة supernatant تماما وإعادة الإنفاق مع حجم معين من المتوسطة النمو الدافئ لتحقيق كثافة الخلية من 5 × 10⁵/ مل. مزيج تعليق بلطف ونقل 22 مل من حجم في قوارير T-75 ثقافة الخلية (جدول المواد). تخزين قوارير تستقيم في حاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO₂₎تركيز. تبادل وسائل الإعلام النمو كل 3-4 أيام.

2. البذر من THP-1 الخلايا والتمايز في الضامة M0

1. إعداد الخلية التي تحتوي على متوسط النمو مع كثافة الخلية المعنية لخلايا البذور في كثافة 3 × 10⁵/ مل / جيدا في لوحات ثقافة الخلية 24 جيدا (جدول المواد). مزيج المتوسطة بلطف وإعداد aliquots من 26 مل، وضعت كل في أنبوب 50 مل. استخدام كل 26 مل aliquot لزرع الخلايا في لوحة كل منها.
2. نقل 1 مل من الوسط المحتوي على الخلية إلى كل بئر من لوحة 24 جيدا. امزج الوسائط برفق عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا بين عمليات النقل.
3. إعداد حل المخزون من PMA (حل 1 ملغ من PMA في 100 ميكرولتر من ديميثيل سلفوإكسيد (DMSO) = ~ 16 ملم حل PMA في DMSO) وتمييعه مع الفوسفات البارد العازلة المالحة (PBS) إلى تركيز العمل النهائي من 10 نانوغرام / ميكرول الحق قبل علاج الخلية(جدول المواد). الحفاظ على الحل على الجليد واستخدامه على الفور. لا تقم بإعادة التجميد. إضافة 100 نانوغرام من PMA لكل بئر. دع كل لوحة خلوية تجلس في الحاضنة دون أي علاج آخر لمدة 72 ساعة.
4. بعد 72 ساعة، وإزالة المتوسطة النمو واستبداله مع 1 مل من متوسط النمو الطازج. لا تلمس الجزء السفلي من الآبار مع نصائح ماصة. دع الخلايا ترتاح لمدة 96 ساعة أخرى في الحاضنة.
5. بعد 96 ساعة، كرر الخطوة 2.4 (تغيير الوسائط) والسماح للخلايا بقية لمدة 24 ساعة أخرى.
   ملاحظة: الضامة M0 جاهزة الآن لاستخدامها في التجارب (الشكل 2). مباشرة قبل علاج الخلايا كجزء من مزيد من التجارب, النظر في تغيير وسائل الإعلام مع RPMI فقط (جدول المواد) منذ نمو وسائل الإعلام ملاحق يمكن أن يسبب التدخل مع الكواشف التي تضاف لعلاج الخلايا. في حالة الحاجة إلى الضامة M2-like، انتقل إلى القسم 3.

3. استقطاب الضامة M0 إلى الضامة M2 مثل

1. إعداد محلول المخزون من IL-4 و IL-13 (حل 20 ميكروغرام من IL-4 أو IL-13 في 200 ميكرولتر من المياه الخالية من النيوكليز) وتمييعه إلى تركيز عمل نهائي من 2 نانوغرام / ميكرولتر مع برنامج تلفزيوني مباشرة قبل علاج الخلية. الحفاظ على الحل على الجليد واستخدامه على الفور. لا تقم بإعادة التجميد.
2. إزالة متوسط النمو واستبداله مع 1 مل من متوسط النمو الطازج. إضافة 20 نانوغرام من إنترلوكين 4 (IL-4) و 20 نانوغرام من إنترلوكين 13 (IL-13) لكل بئر. دع الخلايا ترتاح لمدة 48 ساعة في الحاضنة.
3. بعد 48 ساعة، كرر الخطوة 3.2. دع الخلايا ترتاح لمدة 48 ساعة أخرى في الحاضنة.
4. إزالة متوسط النمو واستبداله مع 1 مل من متوسط النمو الطازج. دع الخلايا ترتاح لمدة 48 ساعة في الحاضنة.
   ملاحظة: الضامة M2 تشبه الآن جاهزة للاستخدام للتجارب (الشكل 2). مباشرة قبل التعامل مع الخلايا كجزء من مزيد من التجارب, النظر في تغيير وسائل الإعلام مع RPMI فقط (جدول المواد) منذ نمو وسائل الإعلام ملاحق يمكن أن يسبب التدخل.

4. فصل وحصاد الضامة لتدفق قياس الخلايا

ملاحظة: استخدم طريقة ميكانيكية تجمع بين الصدمة الباردة وكشط الخلايا لفصل وحصاد الضامة المستقطبة من لوحات لقياس التدفق الخلوي.

1. إزالة المتوسطة الخلية الدافئة واستبداله بمزيج من الجليد الباردة PBS (دون الكالسيوم والمغنيسيوم) و 5٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، 1 مل لكل بئر. مباشرة بعد هذا، ضع لوحة الخلية على الجليد لمدة 45 دقيقة. لا تضع لوحة الخلية على الجليد قبل إزالة وسط الخلية الدافئة ، لأن هذا سيقلن من صلاحية الخلية بشكل كبير. إبقاء الخلايا على الجليد فقط بعد إحداث صدمة باردة مع الجليد الباردة PBS/5٪ خليط FBS.
2. بعد 45 دقيقة على الجليد، كشط قبالة الخلايا باستخدام كاشطات الخلاياالمصغرة( جدول المواد ). نقل بلطف الضامة منفصلة في برنامج تلفزيوني الباردة / 5٪ FBS في أنبوب 15 مل. إبقاء الأنبوب على الجليد في جميع الأوقات حتى يتم تلطيخ الخلايا.
   ملاحظة: تجمع ثمانية آبار من الخلايا للوصول إلى عدد الخلايا الكافية للتلطيخ.

النتائج

تم توصيف الضامة الشبيهة ب M2 ، وتم التحقق من صحة M2-الاستقطاب باستخدام قياس التدفق الخلوي لعلامات مجموعة التمايز (CD) CD14 و CD11b و CD80 (علامة تشبه M1) و CD206 (علامة تشبه M2). تم إجراء تلطيخ قياس التدفق الخلوي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تم غسل الضامة مع PBS /5٪ FBS واحتضانها مع كتلة مستقبلات Fcγ لتجنب الربط ...

Discussion

يوفر هذا البروتوكول الخاص بتمايز واستقطاب الخلايا الشبيهة بالخلايا الأحادية THP-1 في غضون 14 يوما طريقة للحصول على الضامة ذات النمط الظاهري المتميز الشبيه ب M2 بسبب حضانة العلاج الطويلة للخلايا ذات فترات الراحة الكافية بين الخطوات.

بعض الخطوات هامة لهذا البروتوكول. مضاعفة الو...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% trypan blue	VWR, Radnor, USA	152-5061
1.5 mL microcentrifuge tube	USA Scientific, Ocala, USA	1615-5510
10 mL serological pipet	VWR, Radnor, USA	89130-898
1000 μL TipOne pipet tips	USA Scientific, Ocala, USA	1111-2821
15 mL  Centrifuge tube	VWR, Radnor, USA	89039-664
20 μL TipOne pipet tips	USA Scientific, Ocala, USA	1120-1810
200 μL TipOne pipet tips	USA Scientific, Ocala, USA	1120-8810
25 mL serological pipet	VWR, Radnor, USA	89130-900
5 mL serological pipet	VWR, Radnor, USA	89130-896
50 mL Centrifuge tube	VWR, Radnor, USA	89039-662
Accutase solution 500 mL	Sigma, St. Louis, USA	A6964
Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized	Sigma, St. Louis, USA	A5955-100 mL	with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Binder CO2 Incubator	VWR, Radnor, USA	C170-ULE3
CytoOne T-75cm flask with filter cap	USA Scientific, Ocala, USA	CC7682-4875
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma, St. Louis, USA	D8537-500 mL	PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization
Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated)	Eppendorf, Enfield, USA	-
Ethyl alcohol (70%)	-	-
FACSCalibur flow cytometer	BD Biosciences, San Diego, USA	-	The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences)
Falcon 24-well plate	VWR, Radnor, USA	353504
Fetal Bovine Serum (FBS)	ATCC, Manassas, USA	30-2020
FITC Mouse Anti-Human CD14	BD Biosciences, San Diego, USA	555397	Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)
FITC Mouse Anti-Human CD80	BD Pharmingen, San Diego, USA	557226	Flow cytometry, M1 marker (100 tests)
FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD Pharmingen, San Diego, USA	555748	Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests)
FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control	BD Biosciences, San Diego, USA	553456	Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests)
Human BD Fc Block	BD Biosciences, San Diego, USA	564220	Flow cytometry, Fc block (0.25 mg)
Human interleukin 13 (IL-13)	R&D, Minneapolis, USA	IL-771-10 μg
Human interleukin 4 (IL-4)	R&D, Minneapolis, USA	SRP3093-20 μg
Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213)	Labconco, Kansas City, USA	-
L-Glutamine Solution, 200 mM	ATCC, Manassas, USA	30-2214
Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4	Sigma, St. Louis, USA	L2630-100 mg
Mini Cell Scrapers	Biotium, Fremont, USA	22003
Neubauer hemocytometer	Fisher Scientific, Waltham, USA	02-671-5
Nikon Eclipse inverted microscope TS100	Nikon, Melville, USA	-
Nuclease-free water	Invitrogen, Carlsbad, USA	AM9937
Olympus Light Microscope RH-2	Microscope Central, Feasterville, USA	40888
P10 variable pipet- Gilson	VWR, Radnor, USA	76180-014
P1000 variable pipet-Gilson	VWR, Radnor, USA	76177-990
P200 variable pipet- Gilson	VWR, Radnor, USA	76177-988
PE Mouse Anti-Human CD11b	BD Biosciences, San Diego, USA	555388	Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences, San Diego, USA	555749	Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests)
PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206	BD Pharmingen, San Diego, USA	551136	Flow cytometry, M2 marker (100 tests)
PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD Pharmingen, San Diego, USA	555750	Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests)
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, St. Louis, USA	P8139
Powerpette Plus pipettor	VWR, Radnor, USA	75856-448
Precision Water bath (model 183)	Precision Scientific, Chicago, USA	66551
RPMI-1640 Medium	ATCC, Manassas, USA	30-2001
THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC, Manassas, USA	TIB-202