בידול מקרופאג' וקיטוב לפנוטיפ דמוי M2 באמצעות קו תאים דמוי THP-1 לוקמיה דמוי מונוציטים

Summary

מקרופאגים דמויי M2 הקשורים לגידול (TAM) קשורים להתקדמות הגידול ולאבחנה לקויה בסרטן. פרוטוקול זה משמש כמדריך מפורט להבחנה וקיטוב של תאים דמויי THP-1 למקרופאגים דמויי M2 תוך 14 יום. מודל זה הוא הבסיס לחקור את ההשפעות האנטי דלקתיות של TAM בתוך microenvironment הגידול.

Abstract

מקרופאגים הקשורים לגידול (TAM) יכולים להחליף את הביטוי שלהם ואת פרופיל הציטוקינים שלהם על פי גירויים חיצוניים. פלסטיות יוצאת דופן זו מאפשרת ל- TAM להסתגל לשינויים מתמשכים בתוך מיקרו-סביבה של הגידול. מקרופאגים יכולים להיות בעיקר תכונות פרו דלקתיות (דמויי M1) או אנטי דלקתיות (דמויי M2) ויכולים לעבור ללא הרף בין שתי המדינות העיקריות הללו. מקרופאגים דמויי M2 בסביבת הגידול קשורים להתקדמות הסרטן ופרוגנוזה ירודה במספר סוגים של סרטן. שיטות רבות ושונות לגרימת בידול וקיטוב של תאי THP-1 משמשות לחקירת מנגנונים תאיים ובין תאיים והשפעות TAM בתוך המיקרו-סביבה של גידולים. נכון לעכשיו, אין מודל מבוסס לקיטוב מקרופאגים דמוי M2 באמצעות קו התא THP-1, ותוצאות פרופילי הביטוי והציטוקינים של מקרופאגים בשל גירויים במבחנה מסוימים משתנות בין מחקרים. פרוטוקול זה משמש הדרכה מפורטת כדי להבדיל בין תאים דמויי THP-1 מונוציט למקרופאגים M0 ולקטב עוד יותר תאים לתוך פנוטיפ דמוי M2 בתוך 14 ימים. אנו מדגימים את השינויים המורפולוגיים של תאים דמויי THP-1, מקרופאגים מובחנים ומקרופאגים מקוטבים דמויי M2 באמצעות מיקרוסקופיה קלה. מודל זה הוא הבסיס למודלים של קו התאים החוקרים את ההשפעות האנטי דלקתיות של TAM ואת האינטראקציות שלהם עם אוכלוסיות תאים אחרות של microenvironment הגידול.

Introduction

מקרופאגים הקשורים לגידול (TAM) ותפקידם בדלקת כרונית, תחילת הסרטן והתפתחות הגידול הם מטרות חשובות במחקר האחרון^1,2. מונוציטים דם היקפיים המגויסים למיקרו-סביבה של הגידול המתפתח מבדילים למקרופאגים וניתן לקוטב לשני תתי סוגים עיקריים של מקרופאגים³. המקרופאג' המופעל קלאסית מייצג את הפנוטיפ דמוי M1 הפרו-דלקתי בעיקר ותת-סוג דמוי M2 המופעל לחילופין מראה מאפיינים אנטי דלקתיים בעיקר⁴. מקרופאגים יכולים לעבור באופן דינמי בין שני פנוטיפים עיקריים אלה בהתאם לחילוף החומרים התאי שלהם, עם תת-סוגים ביניים בעלי תכונות דלקתיות ואנטי דלקתיות⁵. TAM מייצג אוכלוסייה הטרוגנית של שני הפנוטיפים. פונקציה לקידום גידול ופרוגנוזה ירודה בסוגים שונים של סרטן קשורה במיוחד למקרופאגים דמויי M2^6,7,8.

הפרופילים התפקודיים של מקרופאגים והאינטראקציה שלהם עם תאים אחרים בתוך המיקרו-סביבה של הגידול הם מורכבים ומאתגרים ללכידה בסביבה המשתנה ללא הרף במהלך התפתחות גידול מתמשכת. קווי תאים יכולים לספק לאוכלוסיית תאים הומוגנית יכולת כדאיות יציבה בתרבות, אשר יכולה להקל על תהליך הדגמת מנגנונים תאיים ובין תאיים מוגדרים. קו התאים דמוי מונוציט THP-1 הוא מערכת מודל לגיטימית למונוציטים אנושיים ראשוניים⁹. קו תאים מונצח באופן ספונטני זה הושג מדם היקפי של תינוק בן שנה עם לוקמיה מונוציטית^{חריפה 9,10}. הבידול והקיטוב של תאי THP-1 דווחו על ידי מספר מחקרים ובוצעו בדרכים שונות מרובות^11,12,13,14. הפעלה, ולכן, הקיטוב של מקרופאגים לתוך פנוטיפ דמוי M1 מלווה מנגנון ריבאונד אנטי דלקתי מפצה, קידום פנוטיפ דמוי M2 באמצעות ציטוקינים המיוצרים על ידי מקרופאגים דלקתיים, כגון אינטרלוקין 6 (IL-6) או itaconate^15,16. זה עשוי לשמש כמנגנון שבירה כדי להחלשות תגובה דלקתית overshooting לאחר הפעלת התא¹⁷. תהליך ההבחנה והקיטוב של מונוציטים ותאים דמויי THP-1 לפנוטיפ אנטי דלקתי דמוי M2 מלווה בעצמו גם בגירויים פרו דלקתיים שיש להתגבר עליהם. תגובת ציטוקינים דלקתית יכולה להיגרם על ידי מתח מכני¹⁸, כגון שינוי מדיה כדי להזין מחדש את התאים, או הוספת תרכובות כימיות כדי להבדיל בין תאי THP-1, כגון פורבול 12-myristate 13-אצטט (PMA), ולזירוז ייצור של גורם נמק הגידול α (TNFα), אינטרלוקין 1β (IL-1β) או IL-6¹⁹. פרופיל ביטוי ציטוקינים שונה זה כתגובה ל- PMA יכול להשפיע ולמנוע קיטוב מקרופאגים עוקב²⁰. תקופות מנוחה נאותות, כפי שדווח בעבר לאחר טיפול PMA, לאפשר תגובות דלקתיות אלה כדי להקטין ולהקל על קיטוב התא לתוך פנוטיפ M2-כמו ברור²¹.

פרוטוקול זה מדגים שיטה להבדיל ולקטב תאים דמויי THP-1 לתוך פנוטיפ דמוי M2 של מקרופאגים בתוך 14 ימים.

Protocol

הערה: מבט כולל על השלבים המתוארים בפרוטוקול זה מוצג באיור 1. קו תאי הלוקמיה דמוי המונוציט האנושי THP-1 נרכש. ניתוח חוזר טנדם קצר בוצע כדי לאמת את קו התא THP-1. בצע את כל השלבים בתנאים סטריליים. קו התא המונוציטי THP-1 גדל בהשעיה ואינו מתחבר למשטחי תרבית התא. דבקות יכולה להיגרם על ידי הבחנה מונוציטים לתאים דמויי מקרופאג 'באמצעות, למשל, מתח מכני או טיפול ספציפי עם PMA.

1. פולחן ותחזוקה של תאים דמויי THP-1 דמויי מונוציט

1. הגדר שעון זמן ל- 150 s. הסר את הנקינה הקפואה המכילה את קו התא THP-1(שולחן החומרים)מהחנקן הנוזלי והפשירו אותו מיד באמבט מים נקי (37 מעלות צלזיוס). התחל את שעון השעון ברגע שהנק ויכניסו את הוויאל לאמבטיית המים. לשחרר את המכסה כדי לשחרר את הלחץ כי הוא בונה בשל תהליך ההפשרה אבל להבטיח כי פתיחת הצינור לא ליצור קשר עם המים, כדי למנוע זיהום. פרק הזמן האופטימלי להפשרת התאים נע בין 120-150 s. המשך להפשיר את השעיית התא עד שבב קרח בגודל של כ 4 מ"מ נשאר בתוך המשחקון; לאחר מכן, המשך לשלב הבא באופן מיידי.
2. העבר את השלב הנוזלי של השעיית התא לצינור 15 מ"ל המכיל 9 מ"ל של מדיה צמיחה חמה (37 °C)(שולחן החומרים). לאחר מכן, להעביר 1 מ"ל של ההשעיה החמה של תא בינוני לתוך פקיעת THP-1 ובחזרה לתוך צינור 15 mL כדי להמיס את שבב הקרח הנותר לשטוף את הקרבון כדי להבטיח כי אין תאים נשארים מאחור.
3. מערבבים את המתלים בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה עם פיפטה 1000 μL. הסר מדגם קטן (כ 10 μL) כדי לספור את התאים עבור הכדאיות (באמצעות טריפן כחול עבור אי הכללה) בזמן שהם הסתובבו. ספין את השעיית התא החם ב 200 x g במשך 7 דקות ב 37 °C (50 °F).
4. הסר את supernatant לחלוטין resuspend עם נפח מסוים של מדיום צמיחה חמה כדי להשיג צפיפות תא של 5 x 10⁵/mL. מערבבים את המתלים בעדינות ומעבירים 22 מ"ל של נפח לתוך T-75 תאי תרבית צלוחיות(שולחן החומרים). יש לאחסן צלוחיות זקופות באינקובטור של 37 °C (5%), עם ריכוז של 5% פחמן דו-חמצני (CO_2). החלף את מדיה הצמיחה כל 3-4 ימים.

2. זריעת תאי THP-1 ובידול למקרופאגים M0

1. הכן את התא המכיל מדיום גדילה עם צפיפות התא המתאימה לתאי זרע בצפיפות של 3 x 10⁵/ mL / גם לתוך לוחות תרבית תאים 24-well (שולחן החומרים). מערבבים את המדיום בעדינות ומכינים עליקוטים של 26 מ"ל, כל אחד לשים לתוך צינור 50 מ"ל. השתמש בכל 26 mL aliquot עבור זריעת התאים לתוך צלחת בהתאמה.
2. מעבירים 1 מ"ל של המדיום המכיל תאים לכל באר של צלחת 24-well. מערבבים את המדיה בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה בין העברות.
3. הכן פתרון מלאי של PMA (להמיס 1 מ"ג של PMA ב 100 μL של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) = ~ 16 mM פתרון של PMA ב- DMSO) ולדלל אותו עם תמיסת מלח חוצץ פוספט קר (PBS) לריכוז עבודה סופי של 10 ננוגרם / μL ממש לפני טיפול בתא(טבלה של חומרים). שמור את הפתרון על קרח ולהשתמש בו מיד. אל תפשיר מחדש. הוסף 100 ננוגרם של PMA לבאר. תן לכל צלחת תא לשבת באינקובטור ללא כל טיפול נוסף במשך 72 שעות.
4. לאחר 72 שעות, להסיר את מדיום הצמיחה ולהחליף אותו עם 1 מ"ל של מדיום צמיחה טרי. אין לגעת בתחתית הבארות עם טיפים פיפטה. תן לתאים לנוח עוד 96 שעות באינקובטור.
5. לאחר 96 שעות, חזור על שלב 2.4 (שינוי מדיה) ותן לתאים לנוח למשך 24 שעות נוספות.
   הערה: המקרופאגים M0 מוכנים כעת לשימוש לניסויים(איור 2). מיד לפני הטיפול בתאים כחלק מניסויים נוספים, שקול שינוי מדיה עם RPMI בלבד (טבלה של חומרים) מאז תוספי מדיה צמיחה יכול לגרום להפרעה עם ריאגנטים המתווספים לטיפול בתא. במקרה שיש צורך במקרו-אג'ים דמויי M2, המשך בסעיף 3.

3. קיטוב מקרופאגים M0 למקרופאגים דמויי M2

1. הכן פתרון מלאי של IL-4 ו- IL-13 (להמיס 20 מיקרוגרם של IL-4 או IL-13 ב 200 μL של מים ללא גרעין) ולדלל אותו לריכוז עבודה סופי של 2 ננוגרם / μL עם PBS מיד לפני הטיפול בתא. שמור את הפתרון על קרח ולהשתמש בו מיד. אל תפשיר מחדש.
2. הסר את מדיום הצמיחה ולהחליף אותו עם 1 מ"ל של מדיום צמיחה טרי. הוסיפו 20 ננוגרם של אינטרלוקין 4 (IL-4) ו-20 ננוגרם של אינטרלוקין 13 (IL-13) לבאר. תן לתאים לנוח 48 שעות באינקובטור.
3. לאחר 48 שעות, חזור על שלב 3.2. תן לתאים לנוח עוד 48 שעות באינקובטור.
4. הסר את מדיום הצמיחה ולהחליף אותו עם 1 מ"ל של מדיום צמיחה טרי. תן לתאים לנוח 48 שעות באינקובטור.
   הערה: מקרופאגים דמויי M2 מוכנים כעת לשימוש לניסויים (איור 2). מיד לפני הטיפול בתאים כחלק מניסויים נוספים, שקול שינוי מדיה עם RPMI בלבד (טבלה של חומרים) מאז תוספי מדיה צמיחה יכול לגרום להפרעה.

4. ניתוק וקצירת מקרופאגים לציטומטריית זרימה

הערה: השתמש בשיטה מכנית המשלבת הלם קר ושריטת תאים כדי לנתק ולקצור את המקרופאגים המקוטבים מלוחות לציטומטריית זרימה.

1. הסר את התא החם בינוני ולהחליף אותו עם תערובת של PBS קר כקרח (ללא סידן ומגנזיום) ו 5% סרום בקר עוברי (FBS), 1 מ"ל לבאר. מיד לאחר מכן, מניחים את צלחת התא על קרח במשך 45 דקות. אין להניח את צלחת התא על קרח לפני המדיום התא החם מוסר, שכן זה יקטין את הכדאיות התא באופן משמעותי. שמור את התאים על קרח רק לאחר גרימת הלם קר עם תערובת PBS קר כקרח / 5% FBS.
2. לאחר 45 דקות על קרח, לגרד את התאים באמצעות מגרדי תאים מיני(שולחן החומרים). מעבירים בעדינות את המקרופאגים המנותקים ב-PBS/5% FBS קרים לצינור 15 מ"ל. שמור את הצינור על קרח בכל עת עד שהתאים מוכתמים.
   הערה: מאגר שמונה בארות של תאים כדי להגיע ספירת תאים נאותה עבור כתמים.

תוצאות

מקרופאגים דמויי M2 אופיינו, וקיטוב M2 אומת באמצעות ציטומטריית זרימה עבור אשכול של סמני בידול (CD) CD14, CD11b, CD80 (סמן דמוי M1) ו- CD206 (סמן דמוי M2). כתמי ציטומטריה זרימה בוצעו על פי הוראות היצרן. מקרופאגים נשטפו עם PBS / 5% FBS ודגרו עם בלוק קולטן Fcγ כדי למנוע כריכה לא מוגדרת. התאים הוכתמו אז בנוגדנים נגד CD14 ו-C...

Discussion

פרוטוקול זה על הבחנה וקיטוב תאים דמויי THP-1 בתוך 14 ימים מספק שיטה להשיג מקרופאגים עם פנוטיפ דמוי M2 נפרד עקב דגירה טיפול ארוכה של תאים עם תקופות מנוחה נאותה בין שלבים.

שלבים מסוימים הם קריטיים לפרוטוקול זה. זמן ההכפלה של מונוציטים THP-1 הוא כ 26 שעות. תאים יכולים להיות מפוצלים בצפי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% trypan blue	VWR, Radnor, USA	152-5061
1.5 mL microcentrifuge tube	USA Scientific, Ocala, USA	1615-5510
10 mL serological pipet	VWR, Radnor, USA	89130-898
1000 μL TipOne pipet tips	USA Scientific, Ocala, USA	1111-2821
15 mL  Centrifuge tube	VWR, Radnor, USA	89039-664
20 μL TipOne pipet tips	USA Scientific, Ocala, USA	1120-1810
200 μL TipOne pipet tips	USA Scientific, Ocala, USA	1120-8810
25 mL serological pipet	VWR, Radnor, USA	89130-900
5 mL serological pipet	VWR, Radnor, USA	89130-896
50 mL Centrifuge tube	VWR, Radnor, USA	89039-662
Accutase solution 500 mL	Sigma, St. Louis, USA	A6964
Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized	Sigma, St. Louis, USA	A5955-100 mL	with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Binder CO2 Incubator	VWR, Radnor, USA	C170-ULE3
CytoOne T-75cm flask with filter cap	USA Scientific, Ocala, USA	CC7682-4875
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma, St. Louis, USA	D8537-500 mL	PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization
Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated)	Eppendorf, Enfield, USA	-
Ethyl alcohol (70%)	-	-
FACSCalibur flow cytometer	BD Biosciences, San Diego, USA	-	The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences)
Falcon 24-well plate	VWR, Radnor, USA	353504
Fetal Bovine Serum (FBS)	ATCC, Manassas, USA	30-2020
FITC Mouse Anti-Human CD14	BD Biosciences, San Diego, USA	555397	Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)
FITC Mouse Anti-Human CD80	BD Pharmingen, San Diego, USA	557226	Flow cytometry, M1 marker (100 tests)
FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD Pharmingen, San Diego, USA	555748	Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests)
FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control	BD Biosciences, San Diego, USA	553456	Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests)
Human BD Fc Block	BD Biosciences, San Diego, USA	564220	Flow cytometry, Fc block (0.25 mg)
Human interleukin 13 (IL-13)	R&D, Minneapolis, USA	IL-771-10 μg
Human interleukin 4 (IL-4)	R&D, Minneapolis, USA	SRP3093-20 μg
Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213)	Labconco, Kansas City, USA	-
L-Glutamine Solution, 200 mM	ATCC, Manassas, USA	30-2214
Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4	Sigma, St. Louis, USA	L2630-100 mg
Mini Cell Scrapers	Biotium, Fremont, USA	22003
Neubauer hemocytometer	Fisher Scientific, Waltham, USA	02-671-5
Nikon Eclipse inverted microscope TS100	Nikon, Melville, USA	-
Nuclease-free water	Invitrogen, Carlsbad, USA	AM9937
Olympus Light Microscope RH-2	Microscope Central, Feasterville, USA	40888
P10 variable pipet- Gilson	VWR, Radnor, USA	76180-014
P1000 variable pipet-Gilson	VWR, Radnor, USA	76177-990
P200 variable pipet- Gilson	VWR, Radnor, USA	76177-988
PE Mouse Anti-Human CD11b	BD Biosciences, San Diego, USA	555388	Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences, San Diego, USA	555749	Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests)
PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206	BD Pharmingen, San Diego, USA	551136	Flow cytometry, M2 marker (100 tests)
PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD Pharmingen, San Diego, USA	555750	Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests)
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, St. Louis, USA	P8139
Powerpette Plus pipettor	VWR, Radnor, USA	75856-448
Precision Water bath (model 183)	Precision Scientific, Chicago, USA	66551
RPMI-1640 Medium	ATCC, Manassas, USA	30-2001
THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC, Manassas, USA	TIB-202