Différenciation et polarisation des macrophages en un phénotype de type M2 à l’aide d’une lignée cellulaire de leucémie THP-1 semblable à un monocyte humain

Résumé

Les macrophages associés aux tumeurs de type M2 (TAM) sont associés à la progression tumorale et à un mauvais pronostic dans le cancer. Ce protocole sert de guide détaillé pour différencier et polariser de manière reproductible les cellules monocytaires THP-1 en macrophages de type M2 dans les 14 jours. Ce modèle est la base pour étudier les effets anti-inflammatoires du TAM dans le microenvironnement tumoral.

Résumé

Les macrophages associés aux tumeurs (TAM) peuvent changer leur expression et leur profil de cytokines en fonction de stimuli externes. Cette plasticité remarquable permet à TAM de s’adapter aux changements en cours dans le microenvironnement tumoral. Les macrophages peuvent avoir des attributs principalement pro-inflammatoires (de type M1) ou anti-inflammatoires (de type M2) et peuvent basculer continuellement entre ces deux états principaux. Les macrophages de type M2 dans l’environnement tumoral sont associés à la progression du cancer et à un mauvais pronostic dans plusieurs types de cancer. De nombreuses méthodes différentes pour induire la différenciation et la polarisation des cellules THP-1 sont utilisées pour étudier les mécanismes cellulaires et intercellulaires et les effets du TAM dans le microenvironnement des tumeurs. À l’heure actuelle, il n’existe aucun modèle établi pour la polarisation des macrophages de type M2 utilisant la lignée cellulaire THP-1, et les résultats de l’expression et des profils de cytokines des macrophages dus à certains stimuli in vitro varient d’une étude à l’autre. Ce protocole sert de guide détaillé pour différencier les cellules de type monocyte THP-1 en macrophages M0 et pour polariser davantage les cellules en un phénotype de type M2 dans les 14 jours. Nous démontrons les changements morphologiques des cellules de type monocytaire THP-1, des macrophages différenciés et des macrophages polarisés de type M2 à l’aide de la microscopie optique. Ce modèle est à la base de modèles de lignées cellulaires étudiant les effets anti-inflammatoires du TAM et leurs interactions avec d’autres populations cellulaires du microenvironnement tumoral.

Introduction

Les macrophages associés aux tumeurs (TAM) et leur rôle dans l’inflammation chronique, l’apparition du cancer et le développement de tumeurs sont des cibles importantes dans les recherches récentes^1,2. Les monocytes du sang périphérique qui sont recrutés dans le microenvironnement tissulaire de la tumeur en développement se différencient en macrophages et peuvent être polarisés en deux sous-types principaux de macrophages³. Le macrophage activé classiquement représente le phénotype de type M1 principalement pro-inflammatoire et le sous-type de type M2 activé alternativement présente principalement des caractéristiques anti-inflammatoires⁴. Les macrophages peuvent basculer dynamiquement entre ces deux phénotypes principaux en fonction de leur métabolisme cellulaire, les sous-types intermédiaires ayant à la fois des attributs inflammatoires et anti-inflammatoires⁵. TAM représente une population hétérogène des deux phénotypes. Une fonction favorisant la tumeur et un mauvais pronostic dans différents types de cancers sont cependant particulièrement associés aux macrophages de type M2^6,7,8.

Les profils fonctionnels des macrophages et leur interaction avec d’autres cellules dans le microenvironnement tumoral sont complexes et difficiles à capturer dans un environnement en constante évolution pendant le développement continu de la tumeur. Les lignées cellulaires peuvent fournir une population cellulaire homogène avec une viabilité stable en culture, ce qui peut faciliter le processus de démonstration de mécanismes cellulaires et intercellulaires définis. La lignée cellulaire THP-1 de type monocyte est un système modèle légitime pour les monocytes humains primaires⁹. Cette lignée cellulaire spontanément immortalisée a été obtenue à partir du sang périphérique d’un nourrisson d’un an atteint de leucémie monocytaire aiguë^9,10. La différenciation et la polarisation des cellules THP-1 ont été rapportées par plusieurs études et ont été réalisées de multiples manières différentes^11,12,13,14. L’activation et, par conséquent, la polarisation des macrophages en un phénotype de type M1 est suivie d’un mécanisme de rebond anti-inflammatoire compensatoire, favorisant un phénotype de type M2 à travers des cytokines produites par des macrophages inflammatoires, tels que l’interleukine 6 (IL-6) ou l’itaconate^15,16. Cela pourrait servir de mécanisme de rupture pour atténuer une réponse inflammatoire de dépassement après l’activation cellulaire¹⁷. Le processus de différenciation et de polarisation des monocytes et des cellules de type monocyte THP-1 en un phénotype anti-inflammatoire de type M2 s’accompagne lui-même de stimuli pro-inflammatoires qui doivent être surmontés. Une réponse inflammatoire aux cytokines peut être causée par un stress mécanique¹⁸, tel que le changement de milieu pour réalimenter les cellules, ou l’ajout de composés chimiques pour différencier les cellules THP-1, tels que le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA), et induire la production de facteur de nécrose tumorale α (TNFα), interleukine 1β (IL-1β) ou IL-6¹⁹. Cette altération du profil d’expression des cytokines en réponse à la PMA peut affecter et prévenir la polarisation ultérieure des macrophages²⁰. Des périodes de repos adéquates, comme indiqué précédemment après le traitement par PMA, permettent à ces réponses inflammatoires de diminuer et facilitent la polarisation cellulaire en un phénotype 21 distinct de type^M2.

Ce protocole démontre une méthode pour différencier et polariser les cellules de type monocytaire THP-1 en un phénotype de macrophages de type M2 dans les 14 jours.

Protocole

Remarque : Une vue d’ensemble des étapes décrites dans ce protocole est illustrée à la figure 1. La lignée cellulaire de leucémie monocytaire humaine THP-1 a été achetée. Une courte analyse de répétition en tandem a été effectuée pour authentifier la lignée cellulaire THP-1. Effectuez toutes les étapes dans des conditions stériles. La lignée cellulaire monocytaire THP-1 se développe en suspension et ne se fixe pas aux surfaces de culture cellulaire. L’adhérence peut être induite en différenciant les monocytes en cellules de type macrophage par, par exemple, un stress mécanique ou un traitement spécifique avecPMA.

1. Culture et entretien des cellules de type monocytaire THP-1

1. Réglez une minuterie sur 150 s. Retirer le flacon congelé contenant la lignée cellulaire THP-1 (Table des matières) de l’azote liquide et le décongeler immédiatement dans un bain-marie propre (37 °C). Démarrez la minuterie dès que le flacon est mis au bain-marie. Desserrer le bouchon pour libérer la pression qui s’accumule en raison du processus de décongélation, mais assurez-vous que l’ouverture du tube n’entre pas en contact avec l’eau, afin d’éviter toute contamination. La période optimale pour la décongélation des cellules se situe entre 120 et 150 s. Continuer à décongeler la suspension cellulaire jusqu’à ce qu’un éclat de glace de la taille d’environ 4 mm soit laissé dans le flacon; ensuite, passez immédiatement à l’étape suivante.
2. Transférer la phase liquide de la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL contenant 9 mL de milieux de croissance chauds (37 °C) (Table des matériaux). Ensuite, transférez 1 mL de la suspension chaude à cellules moyennes dans le flacon THP-1 et retournez dans le tube de 15 mL pour faire fondre la puce de glace restante et rincer le flacon pour vous assurer qu’aucune cellule n’est laissée derrière.
3. Mélanger doucement la suspension en pipetant de haut en bas avec une pipette de 1000 μL. Retirer un petit échantillon (environ 10 μL) pour compter la viabilité des cellules (en utilisant le bleu de trypan pour l’exclusion) pendant qu’elles sont filées. Faire tourner la suspension de la cellule chaude à 200 x g pendant 7 min à 37 °C.
4. Retirez complètement le surnageant et ressuspendez avec un certain volume de milieu de croissance chaud pour obtenir une densité cellulaire de 5 x 10⁵/ mL. Mélanger doucement la suspension et transférer 22 mL de volume dans des flacons de culture cellulaire T-75 (Table des matériaux). Conserver les flacons à la verticale dans un incubateur à 37 °C avec une concentration de dioxyde de carbone (CO₂₎de 5 %. Échangez le support de croissance tous les 3-4 jours.

2. Ensemencement de cellules THP-1 et différenciation en macrophages M0

1. Préparer la cellule contenant le milieu de croissance avec la densité cellulaire respective pour ensemencer les cellules à une densité de 3 x 10⁵/ mL / puits dans des plaques de culture cellulaire à 24 puits (Table des matériaux). Mélanger doucement le milieu et préparer des aliquotes de 26 mL, chacune placée dans un tube de 50 mL. Utilisez chaque aliquote de 26 mL pour ensemencer les cellules dans une plaque respective.
2. Transférer 1 mL du milieu contenant la cellule dans chaque puits d’une plaque de 24 puits. Mélangez doucement le média en pipetant de haut en bas entre les transferts.
3. Préparer une solution mère de PMA (dissoudre 1 mg de PMA dans 100 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO) = ~16 mM de solution de PMA dans du DMSO) et la diluer avec de la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à froid jusqu’à une concentration finale de 10 ng/μL juste avant le traitement cellulaire (Table des matériaux). Gardez la solution sur la glace et utilisez-la immédiatement. Ne pas recongeler. Ajouter 100 ng de PMA par puits. Laissez chaque plaque cellulaire reposer dans l’incubateur sans autre traitement pendant 72 h.
4. Après 72 h, retirez le milieu de croissance et remplacez-le par 1 mL de milieu de croissance frais. Ne touchez pas le fond des puits avec des pointes de pipette. Laissez les cellules reposer pendant encore 96 heures dans l’incubateur.
5. Après 96 h, répétez l’étape 2.4 (changement de support) et laissez les cellules reposer pendant encore 24 h.
   REMARQUE: Les macrophages M0 sont maintenant prêts à être utilisés pour des expériences (Figure 2). Immédiatement avant de traiter les cellules dans le cadre d’autres expériences, envisagez un changement de milieu avec RPMI uniquement(Table des matériaux),car les suppléments de milieu de croissance peuvent provoquer des interférences avec les réactifs ajoutés pour le traitement cellulaire. Dans le cas où des macrophages de type M2 sont nécessaires, passez à la section 3.

3. Polarisation des macrophages M0 en macrophages de type M2

1. Préparer une solution type d’IL-4 et d’IL-13 (dissoudre 20 μg d’IL-4 ou d’IL-13 dans 200 μL d’eau sans nucléase) et la diluer à une concentration de travail finale de 2 ng/μL avec du PBS immédiatement avant le traitement cellulaire. Gardez la solution sur la glace et utilisez-la immédiatement. Ne pas recongeler.
2. Retirez le milieu de croissance et remplacez-le par 1 mL de milieu de croissance frais. Ajouter 20 ng d’interleukine 4 (IL-4) et 20 ng d’interleukine 13 (IL-13) par puits. Laissez les cellules reposer pendant 48 h dans l’incubateur.
3. Après 48 h, répétez l’étape 3.2. Laissez les cellules reposer pendant encore 48 heures dans l’incubateur.
4. Retirez le milieu de croissance et remplacez-le par 1 mL de milieu de croissance frais. Laissez les cellules reposer pendant 48 h dans l’incubateur.
   REMARQUE: Les macrophages de type M2 sont maintenant prêts à être utilisés pour des expériences (Figure 2). Immédiatement avant de traiter les cellules dans le cadre d’autres expériences, envisagez un changement de milieu avec RPMI uniquement(Table des matériaux),car les suppléments de milieu de croissance peuvent causer des interférences.

4. Détachement et récolte des macrophages pour la cytométrie en flux

REMARQUE: Utilisez une méthode mécanique combinant le choc à froid et le grattage cellulaire pour détacher et récolter les macrophages polarisés des plaques pour la cytométrie en flux.

1. Retirez le milieu cellulaire chaud et remplacez-le par un mélange de PBS glacé (sans calcium ni magnésium) et de sérum bovin fœtal à 5 %, soit 1 mL par puits. Immédiatement après, placez la plaque cellulaire sur de la glace pendant 45 min. Ne placez pas la plaque cellulaire sur de la glace avant que le milieu cellulaire chaud ne soit retiré, car cela diminuera considérablement la viabilité cellulaire. Gardez les cellules sur la glace seulement après avoir induit un choc froid avec un mélange PBS glacé / FBS à 5%.
2. Après 45 min sur glace, grattez les cellules à l’aide de mini grattoirs à cellules (Table des matériaux). Transférer doucement les macrophages détachés dans du PBS froid/5% FBS dans un tube de 15 mL. Gardez le tube sur la glace en tout temps jusqu’à ce que les cellules soient colorées.
   REMARQUE: Mettre en commun huit puits de cellules pour atteindre un nombre adéquat de cellules pour la coloration.

Résultats

Des macrophages de type M2 ont été caractérisés et la polarisation M2 a été validée à l’aide de la cytométrie en flux pour les marqueurs de type Cluster of Differentiation (CD) CD14, CD11b, CD80 (marqueur de type M1) et CD206 (marqueur de type M2). La coloration par cytométrie en flux a été effectuée conformément aux instructions du fabricant. Les macrophages ont été lavés avec du PBS/FBS à 5 % et incubés avec le bloc récepteur Fcγ pour éviter toute liaison non spécifique. Les cellules ont ensuit...

Discussion

Ce protocole sur la différenciation et la polarisation des cellules monocytaires THP-1 dans les 14 jours fournit une méthode pour obtenir des macrophages avec un phénotype distinct de type M2 en raison d’une longue incubation de cellules avec des périodes de repos adéquates entre les étapes.

Certaines étapes sont essentielles à ce protocole. Le temps de doublement des monocytes THP-1 est d’environ 26 h. Les cellules peuvent être divisées à une densité cellulaire de 9 x 10^5...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% trypan blue	VWR, Radnor, USA	152-5061
1.5 mL microcentrifuge tube	USA Scientific, Ocala, USA	1615-5510
10 mL serological pipet	VWR, Radnor, USA	89130-898
1000 μL TipOne pipet tips	USA Scientific, Ocala, USA	1111-2821
15 mL  Centrifuge tube	VWR, Radnor, USA	89039-664
20 μL TipOne pipet tips	USA Scientific, Ocala, USA	1120-1810
200 μL TipOne pipet tips	USA Scientific, Ocala, USA	1120-8810
25 mL serological pipet	VWR, Radnor, USA	89130-900
5 mL serological pipet	VWR, Radnor, USA	89130-896
50 mL Centrifuge tube	VWR, Radnor, USA	89039-662
Accutase solution 500 mL	Sigma, St. Louis, USA	A6964
Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized	Sigma, St. Louis, USA	A5955-100 mL	with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Binder CO2 Incubator	VWR, Radnor, USA	C170-ULE3
CytoOne T-75cm flask with filter cap	USA Scientific, Ocala, USA	CC7682-4875
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma, St. Louis, USA	D8537-500 mL	PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization
Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated)	Eppendorf, Enfield, USA	-
Ethyl alcohol (70%)	-	-
FACSCalibur flow cytometer	BD Biosciences, San Diego, USA	-	The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences)
Falcon 24-well plate	VWR, Radnor, USA	353504
Fetal Bovine Serum (FBS)	ATCC, Manassas, USA	30-2020
FITC Mouse Anti-Human CD14	BD Biosciences, San Diego, USA	555397	Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)
FITC Mouse Anti-Human CD80	BD Pharmingen, San Diego, USA	557226	Flow cytometry, M1 marker (100 tests)
FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD Pharmingen, San Diego, USA	555748	Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests)
FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control	BD Biosciences, San Diego, USA	553456	Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests)
Human BD Fc Block	BD Biosciences, San Diego, USA	564220	Flow cytometry, Fc block (0.25 mg)
Human interleukin 13 (IL-13)	R&D, Minneapolis, USA	IL-771-10 μg
Human interleukin 4 (IL-4)	R&D, Minneapolis, USA	SRP3093-20 μg
Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213)	Labconco, Kansas City, USA	-
L-Glutamine Solution, 200 mM	ATCC, Manassas, USA	30-2214
Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4	Sigma, St. Louis, USA	L2630-100 mg
Mini Cell Scrapers	Biotium, Fremont, USA	22003
Neubauer hemocytometer	Fisher Scientific, Waltham, USA	02-671-5
Nikon Eclipse inverted microscope TS100	Nikon, Melville, USA	-
Nuclease-free water	Invitrogen, Carlsbad, USA	AM9937
Olympus Light Microscope RH-2	Microscope Central, Feasterville, USA	40888
P10 variable pipet- Gilson	VWR, Radnor, USA	76180-014
P1000 variable pipet-Gilson	VWR, Radnor, USA	76177-990
P200 variable pipet- Gilson	VWR, Radnor, USA	76177-988
PE Mouse Anti-Human CD11b	BD Biosciences, San Diego, USA	555388	Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences, San Diego, USA	555749	Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests)
PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206	BD Pharmingen, San Diego, USA	551136	Flow cytometry, M2 marker (100 tests)
PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD Pharmingen, San Diego, USA	555750	Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests)
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, St. Louis, USA	P8139
Powerpette Plus pipettor	VWR, Radnor, USA	75856-448
Precision Water bath (model 183)	Precision Scientific, Chicago, USA	66551
RPMI-1640 Medium	ATCC, Manassas, USA	30-2001
THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC, Manassas, USA	TIB-202