ヒト単球様THP-1白血病細胞株を用いたM2様表現型へのマクロファージ分化と分極化

要約

M2様腫瘍関連マクロファージ(TAM)は、がんにおける腫瘍の進行および予後不良に関連している。このプロトコルは、14日以内にTHP-1単球様細胞をM2様マクロファージに再現的に分化し、偏光するための詳細なガイドとして機能します。このモデルは、腫瘍微小環境内におけるTAMの抗炎症効果を調べる基礎となる。

要約

腫瘍関連マクロファージ(TAM)は、外部刺激に応じてそれらの発現およびサイトカインプロファイルを切り替えることができる。この顕著な可塑性はTAMが腫瘍の微小環境の中で進行中の変化に適応することを可能にする。マクロファージは、主に炎症促進(M1様)または抗炎症(M2様)の属性を有し、これら2つの主要な状態を継続的に切り替えることができる。腫瘍環境内のM2様マクロファージは、いくつかのタイプの癌における癌の進行および予後不良に関連している。THP-1細胞の分化と分極化を誘導するための多くの異なる方法は、細胞および細胞間のメカニズムと腫瘍の微小環境におけるTAMの影響を調べるのに使用される。現在、THP-1細胞株を用いたM2様マクロファージ偏極のモデルは確立されていないが、一定のインビトロ刺激によるマクロファージの発現およびサイトカインプロファイルの結果は研究によって異なる。このプロトコルは、THP-1単球様細胞をM0マクロファージに分化し、14日以内に細胞をさらにM2様表現型に分光するための詳細なガイダンスとして機能します。軽顕微鏡を用いて、THP-1単球様細胞、分化マクロファージ、偏光M2様マクロファージの形態変化を実証する。このモデルは、TAMの抗炎症効果と腫瘍微小環境の他の細胞集団との相互作用を調査する細胞株モデルの基礎となる。

概要

腫瘍関連マクロファージ(TAM)と慢性炎症におけるそれらの役割、癌の発症、および腫瘍の発達は、最近の研究^1,2において重要な標的である。現像腫瘍の組織微小環境にリクルートされた末梢血単球はマクロファージに分化し、マクロファージ³の2つの主要なサブタイプに分極することができる。古典的に活性化されたマクロファージは、主に炎症促進性M1様表現型を表し、代わりに活性化されたM2様サブタイプは主に抗炎症特性⁴を示す。マクロファージは、細胞代謝に応じてこれら2つの主要なフェノタイプ間で動的に切り替えることができ、中間サブタイプは炎症性および抗炎症属性の両方を有^する5。TAMは、両方の表現型の不均一な集団を表す。異なるタイプの癌における腫瘍促進機能と予後不良は、しかし、特にM2様マクロファージ^6、7、8と関連している。

マクロファージの機能的プロファイルと腫瘍微小環境内の他の細胞との相互作用は複雑で、進行中の腫瘍の開発中に絶えず変化する環境で捕獲することは困難です。細胞株は、培養中の安定した生存率を有する均質な細胞集団を提供することができ、定義された細胞および細胞間メカニズムを実証するプロセスを容易にすることができる。単球様THP-1細胞株は、ヒト一次単球⁹の正当なモデルシステムである。この自発的に不死化した細胞株は、急性単球性白血病^9,10を有する1歳児の末梢血から得られた。THP-1細胞の分化と分極化は、いくつかの研究によって報告されており、複数の異なる方法で行われてきた^11,12,13,14.したがって、M1様表現型へのマクロファージの分極化は、代償性抗炎症反発機構を続け、インターロイキン6(IL-6)またはイタ^コナーテリンなどの炎症性マクロファージによって産生されるサイトカインを介してM2様表現型を促進^する。これは、細胞活性化¹⁷に続く過多の炎症反応を減衰させるブレークメカニズムとして役立つ可能性がある。単球とTHP-1単球様細胞を抗炎症性M2様表現型に分化・偏光するプロセスは、それ自体が克服しなければならない炎症促進刺激を伴う。炎症サイトカイン応答^は、細胞を再送する培地を変えたり、ファルボル12-ミリステアテン酸塩(PMA)などのTHP-1細胞を分化する化学化合物を添加したり、腫瘍壊死因子α(TNFα)、インターロイキン1β(IL-1β)または^IL-699などの機械的ストレスによって引き起こされ得る。PMAに対する応答としてこの変化したサイトカイン発現プロファイルは、マクロファージの後の分極²⁰に影響を及ぼし、また防止することができる。PMA治療後に報告された適切な休止期間は、これらの炎症反応が減少し、細胞分極化を明確なM2様表現型²¹に促進することを可能にする。

このプロトコルは、THP-1単球様細胞を14日以内にM2様のマクロファージに分化し、分極する方法を示す。

プロトコル

注: このプロトコルで説明されている手順の概要を図 1に示します。ヒト単球様白血病細胞株THP-1を購入した。THP-1細胞株を認証するために短いタンデム反復分析を行った。滅菌条件下ですべてのステップを実行します。THP-1単球細胞株は懸濁液で成長し、細胞培養表面に付着しない。付着は、PMAを用いた機械的ストレスまたは特異的治療を介して、単球をマクロファージ様細胞に分化することによって誘導され得る。

1. THP-1単球様細胞の培養と維持

1. 150 s のタイマーを設定します。液体窒素からTHP-1細胞株(材料表)を含む冷凍バイアルを取り出し、すぐにきれいな水浴(37°C)で解凍します。バイアルが水浴に入れるとすぐにタイマーを開始します。キャップを緩めて、解凍プロセスによって蓄積される圧力を解放しますが、チューブ開口部が水に接触しないようにして、汚染を避けます。細胞を解凍するための最適な期間は120-150 sの間にあります。約4mmの大きさのアイスチップがバイアル内に残るまで、細胞懸濁液を解凍し続けます。その後、すぐに次のステップに進みます。
2. 細胞懸濁液の液相を、9 mLの温暖(37°C)成長培地(材料表)を含む15 mLチューブに移す。次に、温かいミディアムセル懸濁液の1mLをTHP-1バイアルに移し、15mLチューブに戻して残りのアイスチップを溶融し、バイアルをフラッシュして細胞が残らないようにします。
3. 1000 μL ピペットで上下にピペットを使用して、サスペンションを軽く混ぜます。小さなサンプル(約10 μL)を取り除き、細胞がスピンしている間に細胞の生存率を数えます(除外のためにトリパンブルーを使用)。37°Cで7分間、200 x g でウォームセルサスペンションをスピンダウンします。
4. 上清を完全に取り除き、1定量の温成長培地で再中断して、5 x 10⁵/mLの細胞密度を達成します。サスペンションを軽く混ぜ、22mLの体積をT-75細胞培養フラスコに移す(材料表)。フラスコを37°Cのインキュベーターに直立させて、5%の二酸化炭素_(CO2)濃度で保存します。3~4日ごとに成長メディアを交換します。

2. THP-1細胞の播種とM0マクロファージへの分化

1. 3 x 10⁵/mL/wellの密度で細胞を24ウェル細胞培養プレートに播種するために、それぞれの細胞密度を有する成長培地を含む細胞を準備する(材料表)。培地を軽く混ぜ、26mLのアリコートを準備し、それぞれ50mLチューブに入れます。各26 mLアリコートを使用して、それぞれのプレートに細胞を播種します。
2. 24ウェルプレートの各ウェルに細胞含有培地1mLを移す。転送の間に上下にピペットを介して、メディアを穏やかに混ぜます。
3. PMAのストック溶液を調製し(1mgのPMAを100μLのジメチルスルホキシド(DMSO)=DMSO中のPMAの16mM溶液に溶解し、冷たいリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞処理の直前に10ng/μLの最終作業濃度に希釈する(材料表)。氷の上にソリューションを維持し、すぐにそれを使用してください。再凍結しないでください。井戸あたり100 ngのPMAを追加します。各細胞プレートを72時間のさらなる処理をせずにインキュベーターに座らせます。
4. 72時間後、成長培地を取り出し、1mLの新鮮な成長培地に交換します。ピペットチップで井戸の底部に触れないでください。細胞をインキュベーターでさらに96時間休ませます。
5. 96時間後、ステップ2.4(メディアチェンジ)を繰り返し、セルをさらに24時間休ませます。
   メモ:M0マクロファージは実験に使用する準備ができました(図2)。細胞をさらなる実験の一部として処理する直前に、成長培地サプリメントが細胞処理のために添加される試薬に干渉を引き起こす可能性があるため、RPMIのみ(表)でのメディア変更を検討してください。M2様マクロファージが必要な場合は、セクション3に進みます。

M0マクロファージをM2様マクロファージに分極

1. IL-4およびIL-13のストック溶液(ヌクレアーゼを含まない水の200μLで20μgのIL-4またはIL-13を溶解)し、細胞処理の直前にPBSで2ng/μLの最終作業濃度に希釈します。氷の上にソリューションを維持し、すぐにそれを使用してください。再凍結しないでください。
2. 成長培地を取り出し、1mLの新鮮な成長培地に置き換えます。インターロイキン4(IL-4)の20 ngとインターロイキン13(IL-13)の20 ngを追加します。細胞をインキュベーターで48時間休ませます。
3. 48時間後、ステップ3.2を繰り返します。細胞をインキュベーターでさらに48時間休ませます。
4. 成長培地を取り出し、1mLの新鮮な成長培地に置き換えます。細胞をインキュベーターで48時間休ませます。
   注: M2 のようなマクロファージは実験に使用する準備ができました (図 2)。さらなる実験の一部として細胞を処理する直前に、成長培地サプリメントが干渉を引き起こす可能性があるため、RPMIのみ(表)でメディアの変更を検討してください。

4. フローサイトメトリー用のマクロファージの取り外しと収穫

注:冷たい衝撃と細胞の掻き取りを組み合わせた機械的な方法を使用して、偏光マクロファージをプレートから取り外して収穫し、フローサイトメトリーを行います。

1. 温かい細胞培地を取り出し、氷冷PBS(カルシウムとマグネシウムなし)と5%のウシ血清(FBS)を1 mLの混合物に置き換えます。その直後に、細胞板を氷の上に45分間置きます。これは、細胞の生存率を大幅に低下させるので、暖かい細胞培地が除去される前に、氷の上に細胞プレートを置かないでください。氷冷PBS/5%FBS混合物でコールドショックを誘発した後にのみ、細胞を氷上に保ちます。
2. 氷上で45分を過ぎると、ミニセルスクレーパー(材料表)を使用して細胞を削り取ります。取り外したマクロファージを冷たいPBS/5%FBSで15 mLチューブに静かに移します。細胞が染色されるまで、チューブを常に氷の上に置いてください。
   注:染色のための適切なセル数に到達するためにセルの8つのウェルをプールします。

結果

M2様マクロファージを特徴とし、分化マーカー群(CD)CD14、CD11b、CD80(M1様マーカー)、CD206(M2様マーカー)のフローサイトメトリーを用いてM2偏光を検証した。フローサイトメトリー染色は、メーカーの指示に従って行った。マクロファージをPBS/5%FBSで洗浄し、非特異的結合を避けるためにFcγ受容体ブロックでインキュベートした。次に、FITC結合マウス抗ヒトCD14およびCD80抗体、PE結合マウス抗ヒト...

ディスカッション

このプロトコルは、14日以内にTHP-1単球様細胞の分化および偏光に関する方法を提供し、ステップ間の十分な休止期間を有する細胞の長い治療インキュベーションによる、明確なM2様表現型を有するマクロファージを得る方法を提供する。

このプロトコルには、特定の手順が不可欠です。THP-1単球の倍加時間は約26時間です。セルは、9 x 10⁵/mL のセル密度で分割でき...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% trypan blue	VWR, Radnor, USA	152-5061
1.5 mL microcentrifuge tube	USA Scientific, Ocala, USA	1615-5510
10 mL serological pipet	VWR, Radnor, USA	89130-898
1000 μL TipOne pipet tips	USA Scientific, Ocala, USA	1111-2821
15 mL  Centrifuge tube	VWR, Radnor, USA	89039-664
20 μL TipOne pipet tips	USA Scientific, Ocala, USA	1120-1810
200 μL TipOne pipet tips	USA Scientific, Ocala, USA	1120-8810
25 mL serological pipet	VWR, Radnor, USA	89130-900
5 mL serological pipet	VWR, Radnor, USA	89130-896
50 mL Centrifuge tube	VWR, Radnor, USA	89039-662
Accutase solution 500 mL	Sigma, St. Louis, USA	A6964
Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized	Sigma, St. Louis, USA	A5955-100 mL	with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Binder CO2 Incubator	VWR, Radnor, USA	C170-ULE3
CytoOne T-75cm flask with filter cap	USA Scientific, Ocala, USA	CC7682-4875
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma, St. Louis, USA	D8537-500 mL	PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization
Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated)	Eppendorf, Enfield, USA	-
Ethyl alcohol (70%)	-	-
FACSCalibur flow cytometer	BD Biosciences, San Diego, USA	-	The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences)
Falcon 24-well plate	VWR, Radnor, USA	353504
Fetal Bovine Serum (FBS)	ATCC, Manassas, USA	30-2020
FITC Mouse Anti-Human CD14	BD Biosciences, San Diego, USA	555397	Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)
FITC Mouse Anti-Human CD80	BD Pharmingen, San Diego, USA	557226	Flow cytometry, M1 marker (100 tests)
FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD Pharmingen, San Diego, USA	555748	Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests)
FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control	BD Biosciences, San Diego, USA	553456	Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests)
Human BD Fc Block	BD Biosciences, San Diego, USA	564220	Flow cytometry, Fc block (0.25 mg)
Human interleukin 13 (IL-13)	R&D, Minneapolis, USA	IL-771-10 μg
Human interleukin 4 (IL-4)	R&D, Minneapolis, USA	SRP3093-20 μg
Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213)	Labconco, Kansas City, USA	-
L-Glutamine Solution, 200 mM	ATCC, Manassas, USA	30-2214
Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4	Sigma, St. Louis, USA	L2630-100 mg
Mini Cell Scrapers	Biotium, Fremont, USA	22003
Neubauer hemocytometer	Fisher Scientific, Waltham, USA	02-671-5
Nikon Eclipse inverted microscope TS100	Nikon, Melville, USA	-
Nuclease-free water	Invitrogen, Carlsbad, USA	AM9937
Olympus Light Microscope RH-2	Microscope Central, Feasterville, USA	40888
P10 variable pipet- Gilson	VWR, Radnor, USA	76180-014
P1000 variable pipet-Gilson	VWR, Radnor, USA	76177-990
P200 variable pipet- Gilson	VWR, Radnor, USA	76177-988
PE Mouse Anti-Human CD11b	BD Biosciences, San Diego, USA	555388	Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences, San Diego, USA	555749	Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests)
PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206	BD Pharmingen, San Diego, USA	551136	Flow cytometry, M2 marker (100 tests)
PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD Pharmingen, San Diego, USA	555750	Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests)
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, St. Louis, USA	P8139
Powerpette Plus pipettor	VWR, Radnor, USA	75856-448
Precision Water bath (model 183)	Precision Scientific, Chicago, USA	66551
RPMI-1640 Medium	ATCC, Manassas, USA	30-2001
THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC, Manassas, USA	TIB-202