인간 단세포와 같은 THP-1 백혈병 세포선을 사용하여 M2와 같은 표현형으로 대식세포 분화 및 편광

요약

M2 와 같은 종양 관련 대식세포 (TAM)는 암에서 종양 진행 및 가난한 예후와 관련이 있습니다. 이 프로토콜은 THP-1 단핵세포와 같은 세포를 14일 이내에 M2와 같은 대식세포로 재현가능하게 분화하고 편광하는 상세한 가이드의 역할을 합니다. 이 모델은 종양 미세 환경 내에서 TAM의 항염증 효과를 조사하는 기초가 된다.

초록

종양 관련 대식세포(TAM)는 외부 자극에 따라 발현 및 사이토카인 프로파일을 전환할 수 있다. 이 놀라운 가소성은 TAM이 종양 미세 환경 내의 지속적인 변화에 적응할 수 있게 합니다. 대식세포는 주로 프로 염증 (M1 같이) 또는 항 염증 (M2 같이) 속성을 가질 수 있으며 이 두 가지 주요 상태 간에 지속적으로 전환 할 수 있습니다. 종양 환경 내의 M2 와 같은 대식세포는 여러 유형의 암에서 암 진행 및 불량 예후와 관련이 있습니다. THP-1 세포의 분화 및 편광을 유도하기 위한 많은 다른 방법은 세포 간 세포 간 메커니즘및 종양의 미세 환경 내의 TAM의 효과를 조사하기 위해 사용됩니다. 현재, THP-1 세포주사용으로 M2유사 대식세포 편광에 대한 확립된 모델은 없으며, 특정 체외 자극으로 인한 대식세포의 발현 및 사이토카인 프로파일의 결과는 연구마다 차이가 있다. 이 프로토콜은 THP-1 단세포와 같은 세포를 M0 대식세포로 분화하고 14일 이내에 세포를 M2와 같은 표현형으로 더 편광하는 상세한 지침의 역할을 합니다. 우리는 빛 현미경 을 사용하여 THP-1 단화 와 같은 세포, 분화 된 대식세포 및 편광 M2 와 같은 대식세포의 형태학적 변화를 보여줍니다. 이 모델은 TAM의 항염증 효과와 종양 미세 환경의 다른 세포 집단과의 상호 작용을 조사하는 세포주 모델의 기초입니다.

서문

종양 관련 대식세포(TAM) 및 만성 염증, 암 발병 및 종양 발달에서의 그들의 역할은 최근 연구^1,2에서중요한 표적이다. 발달 종양의 조직 미세 환경에 모집되는 말초 혈액 단핵구는 대식세포로 분화되고 대식세포^3의2개의 주요 특수형으로 편광될 수 있다. 고전적으로 활성화된 대식세포는 주로 프로염증성 M1유사 표현형을 나타내며 대안적으로 활성화된 M2와 같은 아형은 주로 항염증 특성^4를나타낸다. 대식세포는 세포 대사에 따라 이 두 가지 주요 표현형 사이에 동적으로 전환할 수 있으며, 중간 아류형은 염증 및 항염증 특성^5를모두 갖는다. TAM은 두 표현형의 이기종 집단을 나타낸다. 암의 다른 모형에 있는 종양 촉진 기능 및 가난한 예후는, 그러나, 특히 M2 같이 대식세포^6,7,8와연관됩니다.

대식세포의 기능적 프로파일과 종양 미세 환경 내의 다른 세포와의 상호 작용은 지속적인 종양 발달 중에 지속적으로 변화하는 환경에서 포착하기가 복잡하고 어렵습니다. 세포주는 정된 세포 간 기계장치를 보여주는 과정을 용이하게 할 수 있는 배양에서 안정한 생존성을 가진 동질적인 세포 인구를 제공할 수 있습니다. 단핵구와 같은 THP-1 세포주는 1차 인간 단핵구^9에대한 합법적인 모델 시스템이다. 이 자발적으로 불멸한 세포주급성 단세포 백혈병을 가진 1세 유아의 말초 혈액으로부터^9,10을얻었다. THP-1 세포의 분화 및 편광은 여러 연구에의해 보고되었으며^{11,12,13,14의}여러 가지 방법으로 수행되었다. 따라서, M1과 같은 표현형으로 대식세포의 편광은 보상항염증리바운드 메커니즘을 선행하여 인터류킨 6(IL-6) 또는 이타코네이트^15,16과같은 염증성 대식세포에 의해 생성된 사이토카인을 통해 M2와 같은 표현형을 촉진한다. 이것은 세포 활성화⁽¹⁷⁾다음 과다 촬영 염증 반응을 감쇠시키는 휴식 메커니즘으로 작용할 수 있다. 항염증M2와 같은 표현형으로 단세포및 THP-1 단세포와 같은 세포를 분화하고 편광하는 과정은 그 자체도 극복해야 하는 프로 염증 자극을 동반한다. 염증성 사이토카인 반응은 세포를 재공급하는 매체를 변경하거나, phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)와 같은 THP-1 세포를 분화하기 위해 화학 화합물을 첨가하고, 종양 괴사 인자 α(TNFα), 인터류킨 1β(IL-1β) 또는 IL-69에 의해 유발될 수 있다. PMA에 대한 응답으로 이러한 변경된 사이토카인 식 프로파일은 후속 대식세포^{편광(20)에}영향을 미치고 예방할 수 있다. PMA 치료 후 전에 보고된 적절한 휴식 기간은 이러한 염증 반응을 감소시키고 세포 편광을 별개의 M2 와 같은^{표현형(21)으로}용이하게 할 수 있도록 한다.

이 프로토콜은 14일 이내에 THP-1 단화세포와 같은 세포를 M2와 같은 표현형으로 분화하고 편광하는 방법을 보여 준다.

프로토콜

참고: 이 프로토콜에 설명된 단계에 대한 개요는 그림 1에표시됩니다. 인간 단세포종 백혈병 세포주 THP-1을 구입했다. THP-1 세포주 인증을 위해 짧은 탠덤 반복 분석이 수행되었다. 멸균 조건에서 모든 단계를 수행합니다. THP-1 단낭세포선은 현탁액에서 자라며 세포 배양 표면에 부착하지 않습니다. 준수는 예를 들어, 기계적 응력 또는 PMA를 통한 특정 처리를 통해 대식세포와 같은 세포로 단핵구를 분화시킴으로써 유도될 수있다.

1. THP-1 단세포와 같은 세포의 배양 및 유지 보수

1. 타이머를 150s로 설정합니다. 액체 질소로부터 THP-1세포주(재료표)를함유한 냉동 유리알을 제거하고 깨끗한 수조(37°C)에서 즉시 해동한다. 바이알을 수조에 넣으면마자 타이머를 시작합니다. 해동 공정으로 인해 쌓이는 압력을 방출하기 위해 캡을 풀지만 튜브 개구부가 물에 닿지 않도록 하여 오염을 방지합니다. 세포를 해동하기위한 최적의 기간은 120-150 s 사이입니다. 약 4mm 크기의 얼음 칩이 유리병 내에 남아있을 때까지 셀 서스펜션을 계속 해동; 그런 다음 즉시 다음 단계로 진행하십시오.
2. 세포 현탁액의 액체 상을 따뜻한 (37 °C) 성장 매체(재료표)의9 mL을 포함하는 15 mL 튜브로 전송합니다. 이어서, 따뜻한 중간세포 현탁액의 1mL를 THP-1 바이알로 다시 15mL 튜브로 이송하여 남은 얼음 칩을 녹이고 유리병을 플러시하여 세포가 남지 않도록 한다.
3. 1000 μL 파이펫으로 위아래로 피펫을 하여 서스펜션을 부드럽게 섞습니다. 작은 샘플(약 10μL)을 제거하여 셀을 셀에 계산하여 실행 가능성을 계산합니다(제외를 위해 트라이팬 블루를 사용). 37°C에서 7분 동안 200 x g의 따뜻한 셀 서스펜션을 회전시.
4. 상체를 완전히 제거하고 5 x 10 5/mL의 세포 밀도를 달성하기위해 특정 양의 따뜻한 성장 매체로 재축한다. 서스펜션을 부드럽게 혼합하고 22mL의 부피를 T-75 세포 배양 플라스크(재료표)로옮기다. 37°C의 인큐베이터에 5%의_{이산화탄소(CO2)}농도를 저장하는 플라스크를 저장합니다. 성장 미디어를 3-4일마다 교환합니다.

2. THP-1 세포의 파종 및 M0 대식세포로 분화

1. 3 x 10 5/mL/웰의 밀도에서 종자 세포에각각의 세포 밀도를 함유한 성장 배지를 함유하는 세포를 24웰 세포 배양플레이트(재료표)로준비한다. 매체를 부드럽게 섞고 26mL의 알리쿼트를 준비하여 각각 50mL 튜브에 넣습니다. 각 26mL 알리쿼트에서 세포를 각 플레이트로 시드한다.
2. 24웰 플레이트의 각 웰에 세포 함유 배지의 1mL를 전달한다. 전송 사이에 위아래로 파이프를 하여 미디어를 부드럽게 섞습니다.
3. PMA의 재고 용액(디메틸 설플산화물 100μl에 PMA 1 mg을 용해하여 디메틸 설플산화물(DMSO)= DMSOPMA의 ~16mMM 솔루션) 및 감기 인산완충식칼린(PBS)으로 희석하여 세포 처리 직전 10ng/μL의 최종 작동농도(재료표)로희석한다. 얼음에 용액을 유지하고 즉시 사용하십시오. 다시 고정하지 마십시오. 잘 당 PMA의 100 ng를 추가합니다. 각 세포판이 72h에 대한 추가 치료없이 인큐베이터에 앉게하십시오.
4. 72h 후, 성장 매체를 제거하고 신선한 성장 매체의 1 mL로 대체합니다. 파이펫 팁으로 우물 바닥을 만지지 마십시오. 세포가 인큐베이터에서 또 다른 96 h를 위해 쉬게하십시오.
5. 96h 후, 2.4단계(미디어 변경)를 반복하고 세포가 다른 24시간 동안 쉬게 한다.
   참고: M0 대식세포는 이제 실험에 사용할 준비가되었습니다(그림 2). 추가 실험의 일환으로 세포를 치료하기 직전에 성장 미디어 보충제는 세포치료를 위해 첨가되는 시약과의 간섭을 일으킬 수 있기 때문에 RPMI(재료 표)만으로 미디어 변화를 고려하십시오. M2와 같은 대식세포가 필요한 경우 3절을 진행하십시오.

3. M0 대식세포의 편광을 M2와 같은 대식세포로 편광

1. IL-4 및 IL-13의 재고 용액을 준비(IL-4 또는 IL-13의 200μL에 뉴클레아제없는물의 200 μL)를 준비하고 세포 처리 직전에 PBS로 2 ng/μL의 최종 작동 농도로 희석한다. 얼음에 용액을 유지하고 즉시 사용하십시오. 다시 고정하지 마십시오.
2. 성장 매체를 제거하고 신선한 성장 매체의 1 mL로 대체하십시오. 인터류신 4(IL-4)의 20ng과 인터류빈 13(IL-13)의 20ng를 잘 넣습니다. 세포가 인큐베이터에서 48h 동안 쉬게 하십시오.
3. 48h 후, 3.2 단계를 반복합니다. 세포가 인큐베이터에서 또 다른 48 h를 위해 쉬게하십시오.
4. 성장 매체를 제거하고 신선한 성장 매체의 1 mL로 대체하십시오. 세포가 인큐베이터에서 48h 동안 쉬게 하십시오.
   참고: M2와 같은 대식세포는 이제 실험에 사용할 준비가되었습니다(그림 2). 추가 실험의 일환으로 세포를 치료하기 직전에 성장 미디어 보충제가 간섭을 일으킬 수 있으므로 RPMI(재료표)만으로미디어 변경을 고려하십시오.

4. 유동 세포측정을 위한 대식세포 분리 및 수확

참고: 차가운 충격과 세포 스크래핑을 결합하여 유동 세포측정을 위해 플레이트에서 편광 된 대식세포를 분리하고 수확하는 기계적 방법을 사용합니다.

1. 따뜻한 세포 매체를 제거하고 얼음 차가운 PBS (칼슘과 마그네슘제외)와 5 % 태아 소 혈청 (FBS), 우물 당 1 mL의 혼합물로 대체하십시오. 이 직후, 45 분 동안 얼음에 세포 판을 놓습니다. 이 세포 생존을 크게 감소하기 때문에, 따뜻한 세포 매체가 제거되기 전에 얼음에 세포 판을 배치하지 마십시오. 얼음 차가운 PBS / 5 % FBS 혼합물로 차가운 충격을 유도 한 후에만 세포를 얼음에 보관하십시오.
2. 얼음에 45 분 후, 미니 셀 스크레이퍼(재료의 표)를사용하여 세포를 긁어. 차가운 PBS/5% FBS에서 분리된 대식세포를 15mL 튜브로 부드럽게 전송합니다. 세포가 얼룩될 때까지 항상 튜브를 얼음 에 보관하십시오.
   참고: 염색에 적합한 세포 수에 도달하기 위해 8개의 우물을 풀링합니다.

결과

M2와 같은 대식세포는 특징이 었으며, M2 편광은 차별화 마커(CD) CD14, CD11b, CD80(M1 형 마커) 및 CD206(M2 와 같은 마커)의 클러스터를 위한 유동 세포측정을 사용하여 검증되었다. 흐름 세포분석 염색은 제조업체의 지시에 따라 수행되었다. 대식세포는 PBS/5% FBS로 세척하고 특이하지 않은 결합을 피하기 위해 Fcγ 수용체 블록으로 배양되었습니다. 세포는 FITC-컨쥬게이드 마우스 항인간 CD14 및 CD80 항체, PE-?...

토론

14일 이내에 THP-1 단세포와 같은 세포를 분화하고 편광하는 이 프로토콜은 단계 사이에 적절한 휴식 기간을 가진 세포의 긴 치료 배양으로 인해 뚜렷한 M2 와 같은 표현형으로 대식세포를 얻는 방법을 제공한다.

특정 단계는 이 프로토콜에 매우 중요합니다. THP-1 단핵구의 두 배 시간은 약 26h입니다. 세포는 9 x 10 5/mL의 세포 밀도로 분할될 수 있으며 모든 분할 동안 3 x 10^5/mL의...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% trypan blue	VWR, Radnor, USA	152-5061
1.5 mL microcentrifuge tube	USA Scientific, Ocala, USA	1615-5510
10 mL serological pipet	VWR, Radnor, USA	89130-898
1000 μL TipOne pipet tips	USA Scientific, Ocala, USA	1111-2821
15 mL  Centrifuge tube	VWR, Radnor, USA	89039-664
20 μL TipOne pipet tips	USA Scientific, Ocala, USA	1120-1810
200 μL TipOne pipet tips	USA Scientific, Ocala, USA	1120-8810
25 mL serological pipet	VWR, Radnor, USA	89130-900
5 mL serological pipet	VWR, Radnor, USA	89130-896
50 mL Centrifuge tube	VWR, Radnor, USA	89039-662
Accutase solution 500 mL	Sigma, St. Louis, USA	A6964
Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized	Sigma, St. Louis, USA	A5955-100 mL	with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Binder CO2 Incubator	VWR, Radnor, USA	C170-ULE3
CytoOne T-75cm flask with filter cap	USA Scientific, Ocala, USA	CC7682-4875
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma, St. Louis, USA	D8537-500 mL	PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization
Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated)	Eppendorf, Enfield, USA	-
Ethyl alcohol (70%)	-	-
FACSCalibur flow cytometer	BD Biosciences, San Diego, USA	-	The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences)
Falcon 24-well plate	VWR, Radnor, USA	353504
Fetal Bovine Serum (FBS)	ATCC, Manassas, USA	30-2020
FITC Mouse Anti-Human CD14	BD Biosciences, San Diego, USA	555397	Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)
FITC Mouse Anti-Human CD80	BD Pharmingen, San Diego, USA	557226	Flow cytometry, M1 marker (100 tests)
FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD Pharmingen, San Diego, USA	555748	Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests)
FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control	BD Biosciences, San Diego, USA	553456	Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests)
Human BD Fc Block	BD Biosciences, San Diego, USA	564220	Flow cytometry, Fc block (0.25 mg)
Human interleukin 13 (IL-13)	R&D, Minneapolis, USA	IL-771-10 μg
Human interleukin 4 (IL-4)	R&D, Minneapolis, USA	SRP3093-20 μg
Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213)	Labconco, Kansas City, USA	-
L-Glutamine Solution, 200 mM	ATCC, Manassas, USA	30-2214
Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4	Sigma, St. Louis, USA	L2630-100 mg
Mini Cell Scrapers	Biotium, Fremont, USA	22003
Neubauer hemocytometer	Fisher Scientific, Waltham, USA	02-671-5
Nikon Eclipse inverted microscope TS100	Nikon, Melville, USA	-
Nuclease-free water	Invitrogen, Carlsbad, USA	AM9937
Olympus Light Microscope RH-2	Microscope Central, Feasterville, USA	40888
P10 variable pipet- Gilson	VWR, Radnor, USA	76180-014
P1000 variable pipet-Gilson	VWR, Radnor, USA	76177-990
P200 variable pipet- Gilson	VWR, Radnor, USA	76177-988
PE Mouse Anti-Human CD11b	BD Biosciences, San Diego, USA	555388	Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences, San Diego, USA	555749	Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests)
PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206	BD Pharmingen, San Diego, USA	551136	Flow cytometry, M2 marker (100 tests)
PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD Pharmingen, San Diego, USA	555750	Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests)
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, St. Louis, USA	P8139
Powerpette Plus pipettor	VWR, Radnor, USA	75856-448
Precision Water bath (model 183)	Precision Scientific, Chicago, USA	66551
RPMI-1640 Medium	ATCC, Manassas, USA	30-2001
THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC, Manassas, USA	TIB-202