Diferenciação e polarização do macrófago em um fenótipo semelhante a M2 usando uma linha celular de leucemia THP-1 semelhante ao monocito humano

Resumo

Macrófagos associados ao tumor M2 (TAM) estão associados à progressão do tumor e ao prognóstico ruim no câncer. Este protocolo serve como um guia detalhado para reproduzir e polarizar células semelhantes a monócitos THP-1 em macrófagos semelhantes a M2 dentro de 14 dias. Este modelo é a base para investigar os efeitos anti-inflamatórios da TAM dentro do microambiente tumoral.

Resumo

Os macrófagos associados ao tumor (TAM) podem mudar sua expressão e perfil de citocina de acordo com estímulos externos. Essa notável plasticidade permite que a TAM se adapte às mudanças contínuas dentro do microambiente tumoral. Os macrófagos podem ter atributos principalmente pró-inflamatórios (semelhantes a M1) ou anti-inflamatórios (semelhantes a M2) e podem alternar continuamente entre esses dois estados principais. Macrófagos semelhantes a M2 no ambiente tumoral estão associados à progressão do câncer e ao prognóstico ruim em vários tipos de câncer. Muitos métodos diferentes para induzir diferenciação e polarização das células THP-1 são usados para investigar mecanismos celulares e intercelulares e os efeitos da TAM dentro do microambiente dos tumores. Atualmente, não há um modelo estabelecido para a polarização macrófago semelhante a M2 usando a linha celular THP-1, e os resultados de perfis de expressão e citocina de macrófagos devido a certos estímulos in vitro variam entre estudos. Este protocolo serve como orientação detalhada para diferenciar células semelhantes ao monócito THP-1 em macrófagos M0 e para polarizar ainda mais as células em um fenótipo semelhante a M2 dentro de 14 dias. Demonstramos as alterações morfológicas das células moncidas THP-1, macrófagos diferenciados e macrófagos polarizados semelhantes a M2 usando microscopia leve. Este modelo é a base para modelos de linha celular que investigam os efeitos anti-inflamatórios da TAM e suas interações com outras populações celulares do microambiente tumoral.

Introdução

Macrófagos associados ao tumor (TAM) e seu papel na inflamação crônica, o aparecimento do câncer e o desenvolvimento de tumores são alvos importantes em pesquisas recentes^1,2. Monócitos sanguíneos periféricos que são recrutados para o microambiente tecidual do tumor em desenvolvimento se diferenciam em macrófagos e podem ser polarizados em dois subtipos principais de macrófagos³. O macrófago ativado clássicamente representa o fenótipo m1 principalmente pró-inflamatório e o subtipo alternativo ativado como M2 mostra características predominantemente anti-inflamatórias⁴. Os macrófagos podem alternar dinamicamente entre esses dois fenótipos principais dependendo do metabolismo celular, com subtipos intermediários com atributos inflamatórios e anti-inflamatórios⁵. A TAM representa uma população heterogênea de ambos os fenótipos. Uma função promotora de tumores e um prognóstico ruim em diferentes tipos de cânceres está, no entanto, particularmente associado aos macrófagos semelhantes a M2^6,7,8.

Os perfis funcionais de macrófagos e sua interação com outras células dentro do microambiente tumoral são complexos e desafiadores de capturar em um ambiente em constante mudança durante o desenvolvimento contínuo do tumor. As linhas celulares podem proporcionar uma população celular homogênea com viabilidade estável na cultura, o que pode facilitar o processo de demonstração de mecanismos celulares e intercelulares definidos. A linha celular THP-1 semelhante a monócitos é um sistema modelo legítimo para monócitos humanos primários⁹. Esta linha celular espontaneamente imortalizada foi obtida a partir do sangue periférico de uma criança de um ano de idade com leucemia monocítica aguda^9,10. A diferenciação e polarização das células THP-1 têm sido relatadas por diversos estudos e têm sido realizadas de várias formas diferentes^11,12,13,14. Ativação e, portanto, a polarização dos macrófagos em um fenótipo semelhante a M1 é seguida por um mecanismo de recuperação anti-inflamatória compensatória, promovendo um fenótipo semelhante a M2 através de citocinas produzidas por macrófagos inflamatórios, como a interleucina 6 (IL-6) ou a itacina^15,16. Isso pode servir como um mecanismo de ruptura para atenuar uma resposta inflamatória exagerada após a ativação^{celular 17}. O processo de diferenciação e polarização de monócitos e células monocitos THP-1 em um fenótipo anti-inflamatório semelhante a M2 é também acompanhado por estímulos pró-inflamatórios que devem ser superados. Uma resposta inflamatória de citocinas pode ser causada por estresse mecânico^18,como a mudança de mídia para realimentar as células, ou adicionar compostos químicos para diferenciar células THP-1, como phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA), e induzir a produção de fator de necrose tumoral α (TNFα), interleucina 1β (IL-1β) ou IL-6¹⁹. Esse perfil de expressão de citocina alterado como resposta ao PMA pode afetar e prevenir a polarização do macrófago subsequente²⁰. Períodos de descanso adequados, como relatado antes após o tratamento da PMA, permitem que essas respostas inflamatórias diminuam e facilitem a polarização celular em um fenótipo²¹distinto semelhante a M2 .

Este protocolo demonstra um método para diferenciar e polarizar células semelhantes ao monócito THP-1 em um fenótipo semelhante a M2 de macrófagos dentro de 14 dias.

Protocolo

NOTA: Uma visão geral das etapas descritas neste protocolo é mostrada na Figura 1. A linha celular de leucemia semelhante a monócitos humanos THP-1 foi comprada. A análise de repetição em tandem curto foi realizada para autenticar a linha celular THP-1. Realize todas as etapas em condições estéreis. A linha de células monocíticas THP-1 cresce em suspensão e não se prende a superfícies de cultura celular. A adesão pode ser induzida pela diferenciação de monócitos em células semelhantes a macrófagos através, por exemplo, estresse mecânico ou tratamento específico com PMA.

1. Culturação e manutenção de células semelhantes a monícitos THP-1

1. Estabeleça um temporizador para 150 s. Remova o frasco congelado contendo a linha celular THP-1(Tabela de Materiais) do nitrogênio líquido e descongele-o imediatamente em um banho de água limpa (37 °C). Inicie o temporizador assim que o frasco for colocado no banho de água. Solte a tampa para liberar a pressão que está aumentando devido ao processo de descongelamento, mas certifique-se de que a abertura do tubo não entre em contato com a água, para evitar contaminação. O período ideal para descongelar as células está entre 120-150 s. Continue descongelando a suspensão da célula até que um chip de gelo do tamanho de cerca de 4 mm seja deixado dentro do frasco; em seguida, prossiga para o próximo passo imediatamente.
2. Transfira a fase líquida da suspensão celular para um tubo de 15 mL contendo 9 mL de mídia de crescimento quente (37 °C)(Tabela de Materiais). Em seguida, transfira 1 mL da suspensão de células médias quentes para o frasco THP-1 e volte para o tubo de 15 mL para derreter o chip de gelo restante e lavar o frasco para garantir que nenhuma célula seja deixada para trás.
3. Misture a suspensão suavemente por pipetar para cima e para baixo com uma pipeta de 1000 μL. Remova uma pequena amostra (aproximadamente 10 μL) para contar as células para viabilidade (usando azul trypan para exclusão) enquanto elas são giradas. Gire a suspensão da célula quente a 200 x g por 7 min a 37 °C.
4. Remova o supernatante completamente e resuspend com um certo volume de meio de crescimento quente para alcançar uma densidade celular de 5 x 10⁵/mL. Misture a suspensão suavemente e transfira 22 mL de volume em frascos de cultura celular T-75(Tabela de Materiais). Armazene frascos eretos em uma incubadora a 37 °C com concentração de 5% de dióxido de carbono (CO_2). Troque a mídia de crescimento a cada 3-4 dias.

2. Semeadura de células THP-1 e diferenciação em macrófagos M0

1. Prepare a célula contendo meio de crescimento com a respectiva densidade celular para células de sementes a uma densidade de 3 x 10⁵/mL/bem em placas de cultura celular de 24 poços(Tabela de Materiais). Misture o meio suavemente e prepare alíquotas de 26 mL, cada uma colocada em um tubo de 50 mL. Use cada alíquota de 26 mL para semear as células em uma respectiva placa.
2. Transfira 1 mL do meio contendo células em cada poço de uma placa de 24 poços. Misture a mídia suavemente, encanar para cima e para baixo entre as transferências.
3. Prepare uma solução de estoque de PMA (dissolver 1 mg de PMA em 100 μL de Sulfóxido de Dimetila (DMSO) = ~16 mM solução de PMA em DMSO) e dilui-lo com salina tampão fosfato frio (PBS) para uma concentração final de trabalho de 10 ng/μL logo antes do tratamento celular(Tabela de Materiais). Mantenha a solução no gelo e use-a imediatamente. Não congele novamente. Adicione 100 ng de PMA por poço. Deixe cada placa de célula sentar na incubadora sem qualquer tratamento adicional por 72 h.
4. Após 72 h, remova o meio de crescimento e substitua-o por 1 mL de meio de crescimento fresco. Não toque na parte inferior dos poços com pontas de pipeta. Deixe as células descansarem por mais 96 h na incubadora.
5. Depois de 96 horas, repita o passo 2.4 (mudança de mídia) e deixe as células descansarem por mais 24h.
   NOTA: Os macrófagos M0 estão agora prontos para serem usados para experimentos(Figura 2). Imediatamente antes de tratar as células como parte de outros experimentos, considere uma mudança de mídia apenas com RPMI(Tabela de Materiais),uma vez que suplementos de mídia de crescimento podem causar interferência com reagentes que são adicionados para tratamento celular. No caso de macrófagos semelhantes a M2 serem necessários, proceda com a seção 3.

3. Polarização de macrófagos M0 em macrófagos semelhantes a M2

1. Prepare uma solução de estoque de IL-4 e IL-13 (dissolver 20 μg de IL-4 ou IL-13 em 200 μL de água sem nuclease) e dilui-a a uma concentração final de trabalho de 2 ng/μL com PBS imediatamente antes do tratamento celular. Mantenha a solução no gelo e use-a imediatamente. Não congele novamente.
2. Remova o meio de crescimento e substitua-o por 1 mL de meio de crescimento fresco. Adicione 20 ng de interleucina 4 (IL-4) e 20 ng de interleucina 13 (IL-13) por poço. Deixe as células descansarem por 48 h na incubadora.
3. Depois das 48h, repita o passo 3.2. Deixe as células descansarem por mais 48 h na incubadora.
4. Remova o meio de crescimento e substitua-o por 1 mL de meio de crescimento fresco. Deixe as células descansarem por 48 h na incubadora.
   NOTA: Macrófagos semelhantes a M2 estão agora prontos para serem usados para experimentos(Figura 2). Imediatamente antes de tratar as células como parte de outros experimentos, considere uma mudança de mídia apenas com RPMI(Tabela de Materiais),uma vez que suplementos de mídia de crescimento podem causar interferência.

4. Desapegar e colher macrófagos para citometria de fluxo

NOTA: Use um método mecânico que combine a queima de células e raspagem de células para se desprender e colher os macrófagos polarizados das placas para citometria de fluxo.

1. Retire o meio da célula quente e substitua-o por uma mistura de PBS gelado (sem cálcio e magnésio) e 5% de soro bovino fetal (FBS), 1 mL por poço. Imediatamente depois disso, coloque a placa de célula no gelo por 45 minutos. Não coloque a placa celular no gelo antes que o meio da célula quente seja removido, uma vez que isso diminuirá significativamente a viabilidade celular. Mantenha as células no gelo somente depois de induzir choque frio com mistura de PBS/5% FBS gelada.
2. Após 45 min no gelo, raspe as células usando mini raspadores de células(Tabela de Materiais). Transfira suavemente os macrófagos separados em PBS frio/5% FBS em um tubo de 15 mL. Mantenha o tubo no gelo o tempo todo até que as células estejam manchadas.
   NOTA: Poça oito poços de células para atingir a contagem adequada de células para coloração.

Resultados

Macrófagos semelhantes a M2 foram caracterizados, e a polarização M2 foi validada usando citometria de fluxo para marcadores de cluster de diferenciação CD14, CD11b, CD80 (marcador semelhante a M1) e CD206 (marcador semelhante a M2). A coloração da citometria de fluxo foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. Os macrófagos foram lavados com PBS/5% FBS e incubados com bloco de receptor de Fcγ para evitar ligação inespecífica. As células foram então manchadas com anticorpos anti-humanos de ca...

Discussão

Este protocolo de diferenciação e polarização de células monocitos THP-1 dentro de 14 dias fornece um método para obter macrófagos com um fenótipo distinto semelhante a M2 devido à longa incubação de células com períodos de descanso adequados entre as etapas.

Certos passos são fundamentais para este protocolo. O tempo de duplicação dos monócitos THP-1 é de aproximadamente 26 h. As células podem ser divididas a uma densidade celular de 9 x 10⁵/mL e devem ser semead...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% trypan blue	VWR, Radnor, USA	152-5061
1.5 mL microcentrifuge tube	USA Scientific, Ocala, USA	1615-5510
10 mL serological pipet	VWR, Radnor, USA	89130-898
1000 μL TipOne pipet tips	USA Scientific, Ocala, USA	1111-2821
15 mL  Centrifuge tube	VWR, Radnor, USA	89039-664
20 μL TipOne pipet tips	USA Scientific, Ocala, USA	1120-1810
200 μL TipOne pipet tips	USA Scientific, Ocala, USA	1120-8810
25 mL serological pipet	VWR, Radnor, USA	89130-900
5 mL serological pipet	VWR, Radnor, USA	89130-896
50 mL Centrifuge tube	VWR, Radnor, USA	89039-662
Accutase solution 500 mL	Sigma, St. Louis, USA	A6964
Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized	Sigma, St. Louis, USA	A5955-100 mL	with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Binder CO2 Incubator	VWR, Radnor, USA	C170-ULE3
CytoOne T-75cm flask with filter cap	USA Scientific, Ocala, USA	CC7682-4875
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma, St. Louis, USA	D8537-500 mL	PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization
Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated)	Eppendorf, Enfield, USA	-
Ethyl alcohol (70%)	-	-
FACSCalibur flow cytometer	BD Biosciences, San Diego, USA	-	The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences)
Falcon 24-well plate	VWR, Radnor, USA	353504
Fetal Bovine Serum (FBS)	ATCC, Manassas, USA	30-2020
FITC Mouse Anti-Human CD14	BD Biosciences, San Diego, USA	555397	Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)
FITC Mouse Anti-Human CD80	BD Pharmingen, San Diego, USA	557226	Flow cytometry, M1 marker (100 tests)
FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD Pharmingen, San Diego, USA	555748	Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests)
FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control	BD Biosciences, San Diego, USA	553456	Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests)
Human BD Fc Block	BD Biosciences, San Diego, USA	564220	Flow cytometry, Fc block (0.25 mg)
Human interleukin 13 (IL-13)	R&D, Minneapolis, USA	IL-771-10 μg
Human interleukin 4 (IL-4)	R&D, Minneapolis, USA	SRP3093-20 μg
Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213)	Labconco, Kansas City, USA	-
L-Glutamine Solution, 200 mM	ATCC, Manassas, USA	30-2214
Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4	Sigma, St. Louis, USA	L2630-100 mg
Mini Cell Scrapers	Biotium, Fremont, USA	22003
Neubauer hemocytometer	Fisher Scientific, Waltham, USA	02-671-5
Nikon Eclipse inverted microscope TS100	Nikon, Melville, USA	-
Nuclease-free water	Invitrogen, Carlsbad, USA	AM9937
Olympus Light Microscope RH-2	Microscope Central, Feasterville, USA	40888
P10 variable pipet- Gilson	VWR, Radnor, USA	76180-014
P1000 variable pipet-Gilson	VWR, Radnor, USA	76177-990
P200 variable pipet- Gilson	VWR, Radnor, USA	76177-988
PE Mouse Anti-Human CD11b	BD Biosciences, San Diego, USA	555388	Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences, San Diego, USA	555749	Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests)
PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206	BD Pharmingen, San Diego, USA	551136	Flow cytometry, M2 marker (100 tests)
PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD Pharmingen, San Diego, USA	555750	Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests)
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, St. Louis, USA	P8139
Powerpette Plus pipettor	VWR, Radnor, USA	75856-448
Precision Water bath (model 183)	Precision Scientific, Chicago, USA	66551
RPMI-1640 Medium	ATCC, Manassas, USA	30-2001
THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC, Manassas, USA	TIB-202