makrofaj Farklılaşması ve Polarizasyonu, İnsan Monosit Benzeri THP-1 Lösemi Hücre Hattı Kullanarak M2 Benzeri Bir Fenotipe Dönüştür

Özet

M2 benzeri tümör ilişkili makrofajlar (TAM) tümör ilerlemesi ve kanserde zayıf prognoz ile ilişkilidir. Bu protokol, THP-1 monosit benzeri hücreleri 14 gün içinde M2 benzeri makrofajlara yeniden ayırt etmek ve polarize etmek için ayrıntılı bir kılavuz görevi görür. Bu model, TAM'ın tümör mikroçevriciliği içindeki antienflamatuar etkilerini araştırmak için temel oluşturur.

Özet

Tümörle ilişkili makrofajlar (TAM) dış uyaranlara göre ekspresyonlarını ve sitokin profillerini değiştirebilir. Bu olağanüstü plastisite, TAM'ın tümör mikroçevriciliği içinde devam eden değişikliklere uyum sağlamasını sağlar. Makrofajlar öncelikle pro-enflamatuar (M1 benzeri) veya antienflamatuar (M2 benzeri) özelliklere sahip olabilir ve bu iki ana durum arasında sürekli geçiş yapabilir. Tümör ortamındaki M2 benzeri makrofajlar, çeşitli kanser türlerinde kanser ilerlemesi ve zayıf prognoz ile ilişkilidir. THP-1 hücrelerinin farklılaşmasını ve polarizasyonunu teşvik etmek için hücresel ve hücreler arası mekanizmaları ve TAM'ın tümörlerin mikroçevrasyonu içindeki etkilerini araştırmak için birçok farklı yöntem kullanılmaktadır. Şu anda, THP-1 hücre hattı kullanılarak M2 benzeri makrofaj polarizasyonu için belirlenmiş bir model yoktur ve bazı in vitro uyaranlara bağlı makrofajların ekspresyon ve sitokin profillerinin sonuçları çalışmalar arasında değişmektedir. Bu protokol, THP-1 monosit benzeri hücreleri M0 makrofajlarına ayırt etmek ve hücreleri 14 gün içinde M2 benzeri bir fenotipe daha da polarize etmek için ayrıntılı rehberlik görevi görür. Işık mikroskopisi kullanarak THP-1 monosit benzeri hücrelerin, farklılaştırılmış makrofajların ve polarize M2 benzeri makrofajların morfolojik değişimlerini gösteriyoruz. Bu model, TAM'ın antienflamatuar etkilerini ve tümör mikroçevresinin diğer hücre popülasyonlarıyla etkileşimlerini araştıran hücre hattı modellerinin temelidir.

Giriş

Tümör ilişkili makrofajlar (TAM) ve kronik inflamasyondaki rolleri, kanserin başlangıcı ve tümör gelişimi son araştırmalarda önemli hedeflerdir^1,2. Gelişmekte olan tümörün doku mikroçevresine alınan periferik kan monositleri makrofajlara farklılık gösteren ve makrofajların iki ana alt tipine polarize edilebilen³. Klasik olarak aktive edilen makrofaj, öncelikle pro-enflamatuar M1 benzeri fenotipi temsil eder ve alternatif olarak aktive edilen M2 benzeri alt tip ağırlıklı olarak antienflamatuar özellikler gösterir⁴. Makrofajlar, hücresel metabolizmalarına bağlı ola....

Protokol

NOT: Bu iletişim kuralında açıklanan adımlara genel bakış Şekil 1'de gösterilmiştir. İnsan monosit benzeri lösemi hücre hattı THP-1 satın alındı. THP-1 hücre hattının kimliğini doğrulamak için kısa tandem tekrar analizi yapıldı. Tüm adımları steril koşullar altında gerçekleştirin. THP-1 monositik hücre hattı süspansiyonda büyür ve hücre kültürü yüzeylerine bağlanmaz. Bağlılık, monositlerin makrofaj benzeri hücrelere ayırt edilmesiyle, örneğin mekanik stres veya PMA ile spesifik tedavi yoluyla indüklenebilir.

1. THP-1 monosit benzeri hücrelerin kültleme ve bakımı

1. 150 sn için bir zamanlayıcı ay....

Sonuçlar

M2 benzeri makrofajlar karakterize edildi ve M2 polarizasyonu, Farklılaşma İşaretçileri Kümesi (CD) CD14, CD11b, CD80 (M1 benzeri işaretleyici) ve CD206 (M2 benzeri işaretleyici) için akış sitometrisi kullanılarak doğrulandı. Akış sitometrisi boyama işlemi üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirildi. Makrofajlar PBS/%5 FBS ile yıkandı ve spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için Fcφ-reseptör bloğu ile inkübe edildi. Hücreler daha sonra FITC konjuge fare anti-insan CD14 ve CD80 antikorla.......

Tartışmalar

THP-1 monosit benzeri hücrelerin 14 gün içinde ayırt edilmesi ve polarize edilmesi ile ilgili bu protokol, adımlar arasında yeterli dinlenme sürelerine sahip hücrelerin uzun tedavi inkübasyonu nedeniyle M2 benzeri belirgin bir fenotip ile makrofaj elde etmek için bir yöntem sağlar.

Bazı adımlar bu protokol için kritik öneme sahiptir. THP-1 monositlerinin iki katına çıkması yaklaşık 26 saattir. Hücreler 9 x 10⁵/mL hücre yoğunluğunda bölünebilir ve her böl.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% trypan blue	VWR, Radnor, USA	152-5061
1.5 mL microcentrifuge tube	USA Scientific, Ocala, USA	1615-5510
10 mL serological pipet	VWR, Radnor, USA	89130-898
1000 μL TipOne pipet tips	USA Scientific, Ocala, USA	1111-2821
15 mL  Centrifuge tube	VWR, Radnor, USA	89039-664
20 μL TipOne pipet tips	USA Scientific, Ocala, USA	1120-1810
200 μL TipOne pipet tips	USA Scientific, Ocala, USA	1120-8810
25 mL serological pipet	VWR, Radnor, USA	89130-900
5 mL serological pipet	VWR, Radnor, USA	89130-896
50 mL Centrifuge tube	VWR, Radnor, USA	89039-662
Accutase solution 500 mL	Sigma, St. Louis, USA	A6964
Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized	Sigma, St. Louis, USA	A5955-100 mL	with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Binder CO2 Incubator	VWR, Radnor, USA	C170-ULE3
CytoOne T-75cm flask with filter cap	USA Scientific, Ocala, USA	CC7682-4875
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma, St. Louis, USA	D8537-500 mL	PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization
Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated)	Eppendorf, Enfield, USA	-
Ethyl alcohol (70%)	-	-
FACSCalibur flow cytometer	BD Biosciences, San Diego, USA	-	The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences)
Falcon 24-well plate	VWR, Radnor, USA	353504
Fetal Bovine Serum (FBS)	ATCC, Manassas, USA	30-2020
FITC Mouse Anti-Human CD14	BD Biosciences, San Diego, USA	555397	Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)
FITC Mouse Anti-Human CD80	BD Pharmingen, San Diego, USA	557226	Flow cytometry, M1 marker (100 tests)
FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD Pharmingen, San Diego, USA	555748	Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests)
FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control	BD Biosciences, San Diego, USA	553456	Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests)
Human BD Fc Block	BD Biosciences, San Diego, USA	564220	Flow cytometry, Fc block (0.25 mg)
Human interleukin 13 (IL-13)	R&D, Minneapolis, USA	IL-771-10 μg
Human interleukin 4 (IL-4)	R&D, Minneapolis, USA	SRP3093-20 μg
Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213)	Labconco, Kansas City, USA	-
L-Glutamine Solution, 200 mM	ATCC, Manassas, USA	30-2214
Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4	Sigma, St. Louis, USA	L2630-100 mg
Mini Cell Scrapers	Biotium, Fremont, USA	22003
Neubauer hemocytometer	Fisher Scientific, Waltham, USA	02-671-5
Nikon Eclipse inverted microscope TS100	Nikon, Melville, USA	-
Nuclease-free water	Invitrogen, Carlsbad, USA	AM9937
Olympus Light Microscope RH-2	Microscope Central, Feasterville, USA	40888
P10 variable pipet- Gilson	VWR, Radnor, USA	76180-014
P1000 variable pipet-Gilson	VWR, Radnor, USA	76177-990
P200 variable pipet- Gilson	VWR, Radnor, USA	76177-988
PE Mouse Anti-Human CD11b	BD Biosciences, San Diego, USA	555388	Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences, San Diego, USA	555749	Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests)
PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206	BD Pharmingen, San Diego, USA	551136	Flow cytometry, M2 marker (100 tests)
PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD Pharmingen, San Diego, USA	555750	Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests)
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, St. Louis, USA	P8139
Powerpette Plus pipettor	VWR, Radnor, USA	75856-448
Precision Water bath (model 183)	Precision Scientific, Chicago, USA	66551
RPMI-1640 Medium	ATCC, Manassas, USA	30-2001
THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC, Manassas, USA	TIB-202