makrofaj Farklılaşması ve Polarizasyonu, İnsan Monosit Benzeri THP-1 Lösemi Hücre Hattı Kullanarak M2 Benzeri Bir Fenotipe Dönüştür

Özet

M2 benzeri tümör ilişkili makrofajlar (TAM) tümör ilerlemesi ve kanserde zayıf prognoz ile ilişkilidir. Bu protokol, THP-1 monosit benzeri hücreleri 14 gün içinde M2 benzeri makrofajlara yeniden ayırt etmek ve polarize etmek için ayrıntılı bir kılavuz görevi görür. Bu model, TAM'ın tümör mikroçevriciliği içindeki antienflamatuar etkilerini araştırmak için temel oluşturur.

Özet

Tümörle ilişkili makrofajlar (TAM) dış uyaranlara göre ekspresyonlarını ve sitokin profillerini değiştirebilir. Bu olağanüstü plastisite, TAM'ın tümör mikroçevriciliği içinde devam eden değişikliklere uyum sağlamasını sağlar. Makrofajlar öncelikle pro-enflamatuar (M1 benzeri) veya antienflamatuar (M2 benzeri) özelliklere sahip olabilir ve bu iki ana durum arasında sürekli geçiş yapabilir. Tümör ortamındaki M2 benzeri makrofajlar, çeşitli kanser türlerinde kanser ilerlemesi ve zayıf prognoz ile ilişkilidir. THP-1 hücrelerinin farklılaşmasını ve polarizasyonunu teşvik etmek için hücresel ve hücreler arası mekanizmaları ve TAM'ın tümörlerin mikroçevrasyonu içindeki etkilerini araştırmak için birçok farklı yöntem kullanılmaktadır. Şu anda, THP-1 hücre hattı kullanılarak M2 benzeri makrofaj polarizasyonu için belirlenmiş bir model yoktur ve bazı in vitro uyaranlara bağlı makrofajların ekspresyon ve sitokin profillerinin sonuçları çalışmalar arasında değişmektedir. Bu protokol, THP-1 monosit benzeri hücreleri M0 makrofajlarına ayırt etmek ve hücreleri 14 gün içinde M2 benzeri bir fenotipe daha da polarize etmek için ayrıntılı rehberlik görevi görür. Işık mikroskopisi kullanarak THP-1 monosit benzeri hücrelerin, farklılaştırılmış makrofajların ve polarize M2 benzeri makrofajların morfolojik değişimlerini gösteriyoruz. Bu model, TAM'ın antienflamatuar etkilerini ve tümör mikroçevresinin diğer hücre popülasyonlarıyla etkileşimlerini araştıran hücre hattı modellerinin temelidir.

Giriş

Tümör ilişkili makrofajlar (TAM) ve kronik inflamasyondaki rolleri, kanserin başlangıcı ve tümör gelişimi son araştırmalarda önemli hedeflerdir^1,2. Gelişmekte olan tümörün doku mikroçevresine alınan periferik kan monositleri makrofajlara farklılık gösteren ve makrofajların iki ana alt tipine polarize edilebilen³. Klasik olarak aktive edilen makrofaj, öncelikle pro-enflamatuar M1 benzeri fenotipi temsil eder ve alternatif olarak aktive edilen M2 benzeri alt tip ağırlıklı olarak antienflamatuar özellikler gösterir⁴. Makrofajlar, hücresel metabolizmalarına bağlı olarak bu iki ana fenotip arasında dinamik olarak geçiş yapabilir, ara alt tipler hem enflamatuar hem de antienflamatuar özelliklere sahiptir⁵. TAM, her iki fenotipin heterojen popülasyonunu temsil eder. Bununla birlikte, farklı kanser türlerinde tümör teşvik edici bir işlev ve zayıf prognoz, özellikle M2 benzeri makrofajlar⁶,^7,8ile ilişkilidir.

Makrofajların fonksiyonel profilleri ve tümör mikroçevrİmİ içindeki diğer hücrelerle etkileşimleri, devam eden tümör gelişimi sırasında sürekli değişen bir ortamda yakalanması karmaşık ve zordur. Hücre hatları, tanımlanmış hücresel ve hücreler arası mekanizmaları gösterme sürecini kolaylaştırabilen, kültürde istikrarlı canlılığa sahip homojen bir hücre popülasyonu sağlayabilir. Monosit benzeri THP-1 hücre hattı, birincil insan monositleri⁹için meşru bir model sistemidir. Kendiliğinden ölümsüzleşen bu hücre hattı, akut monositik lösemi^9,10olan bir yaşındaki bir bebeğin periferik kanından elde edilmiştir. THP-1 hücrelerinin farklılaşması ve polarizasyonu çeşitli çalışmalarla rapor edilmiş ve birden fazla farklı şekilde gerçekleştİrilmiştir^11,12,13,14. Aktivasyon ve bu nedenle, makrofajların M1 benzeri bir fenotipe polarizasyonunu, interleukin 6 (IL-6) veya itaconate^15,16gibi enflamatuar makrofajlar tarafından üretilen sitokinler yoluyla M2 benzeri bir fenotip teşvik eden telafi edici bir anti-enflamatuar ribaund mekanizması izler. Bu, hücre aktivasyonundan sonra aşırı çekim enflamatuar yanıtı zayıflamak için bir kesme mekanizması olarak hizmet edebilir¹⁷. Monositleri ve THP-1 monosit benzeri hücreleri anti-enflamatuar M2 benzeri bir fenotipe ayırma ve polarize etme sürecine, üstesinden gelinmesi gereken pro-enflamatuar uyaranlar da eşlik eder. Enflamatuar sitokin yanıtı mekanik stresten kaynaklanabilir¹⁸Hücreleri yeniden beslenmek için ortam değiştirmek gibi, veya phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) gibi THP-1 hücrelerini ayırt etmek için kimyasal bileşikler eklemek ve tümör nekroz faktörü α (TNFα), interlökin 1β (IL-1β) veya IL-6¹⁹üretimine neden olmak. PMA'ya yanıt olarak bu değiştirilmiş sitokin ekspresyon profili, sonraki makrofaj polarizasyonunu etkileyebilir ve önleyebilir²⁰. PMA tedavisinden önce bildirildiği gibi yeterli istirahat süreleri, bu enflamatuar yanıtların azalmasına izin verir ve hücre polarizasyonunu farklı bir M2 benzeri fenotip^21'ekolaylaştırır.

Bu protokol, THP-1 monosit benzeri hücreleri 14 gün içinde makrofajların M2 benzeri bir fenotipine ayırt etmek ve polarize etmek için bir yöntem göstermektedir.

Protokol

NOT: Bu iletişim kuralında açıklanan adımlara genel bakış Şekil 1'de gösterilmiştir. İnsan monosit benzeri lösemi hücre hattı THP-1 satın alındı. THP-1 hücre hattının kimliğini doğrulamak için kısa tandem tekrar analizi yapıldı. Tüm adımları steril koşullar altında gerçekleştirin. THP-1 monositik hücre hattı süspansiyonda büyür ve hücre kültürü yüzeylerine bağlanmaz. Bağlılık, monositlerin makrofaj benzeri hücrelere ayırt edilmesiyle, örneğin mekanik stres veya PMA ile spesifik tedavi yoluyla indüklenebilir.

1. THP-1 monosit benzeri hücrelerin kültleme ve bakımı

1. 150 sn için bir zamanlayıcı ayarlayın. THP-1 hücre hattını(Malzeme Masası)içeren donmuş şişeyi sıvı azottan çıkarın ve temiz bir su banyosunda (37 °C) hemen çözün. Şişe su banyosuna konur konulmaz zamanlayıcıyı başlatın. Çözülme işlemi nedeniyle biriken basıncı serbest bırakmak için kapağı gevşetin, ancak kirlenmeyi önlemek için tüp açıklığın suya temas etmediğinden emin olun. Hücrelerin çözülmesi için en uygun zaman dilimi 120-150 s arasındadır. Şişenin içinde yaklaşık 4 mm büyüklüğünde bir buz parçası kalana kadar hücre süspansiyonunun çözülmesine devam edin; ardından, hemen bir sonraki adıma geçin.
2. Hücre süspansiyonunun sıvı fazını 9 mL sıcak (37 °C) büyüme ortamı (Malzeme Tablosu) içeren 15 mL'lik birtüpe aktarın. Daha sonra, sıcak orta hücre süspansiyonunun 1 mL'lik kısmını THP-1 şişesine aktarın ve kalan buz çipini eritmek ve geride hücre kalmamasını sağlamak için şişeyi yıkamak için 15 mL'lik tüpe geri aktarın.
3. Süspansiyonu 1000 μL pipetle yukarı ve aşağı pipetle yukarı ve aşağı borulayarak hafifçe karıştırın. Hücreleri canlılık için saymak için küçük bir örnek (yaklaşık 10 μL) çıkarın (dışlama için trippan mavisi kullanarak) döndürülürken. 200 x g'daki sıcak hücre süspansiyonu 37 °C'de 7 dakika boyunca aşağı çevirin.
4. 5 x 10⁵/mL hücre yoğunluğu elde etmek için süpernatant tamamen çıkarın ve belirli bir hacimde sıcak büyüme ortamı ile yeniden dirilin. Süspansiyonu hafifçe karıştırın ve 22 mL hacmi T-75 hücre kültürü şişelerine(Malzeme Masası) aktarın. Şişeleri % 5 karbondioksit (CO₂₎konsantrasyonu ile 37 °C'de bir inkübatörde dik olarak saklayın. Büyüme medyasını her 3-4 günde bir değiştirin.

2. THP-1 hücrelerinin tohumlanması ve M0 makrofajlarına farklılaştırılması

1. İlgili hücre yoğunluğuna sahip büyüme ortamını içeren hücreyi 3 x 10⁵/mL/well yoğunluğunda tohum hücrelerine 24 kuyu hücre kültürü plakalarınahazırlayın( Malzeme Tablosu ). Ortayı hafifçe karıştırın ve her biri 50 mL'lik bir tüpe konulan 26 mL'lik aliquots hazırlayın. Hücreleri ilgili bir tabağa tohumlamak için her 26 mL aliquot kullanın.
2. Hücre içeren ortamın 1 mL'lik kısmını 24 kuyulu bir plakanın her kuyusuna aktarın. Aktarımlar arasında yukarı ve aşağı pipetleme yaparak ortamı hafifçe karıştırın.
3. Bir PMA stok çözeltisi hazırlayın (100 μL Dimetil Sülfit (DMSO) = DMSO'da ~16 mM PMA çözeltisinde 1 mg PMA çözün) ve hücre tedavisinden hemen önce 10 ng/μL'lik son çalışma konsantrasyonuna kadar soğuk Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ileseyreltin. Çözeltiyi buzda tutun ve hemen kullanın. Tekrar donma. Kuyu başına 100 ng PMA ekleyin. Her hücre plakasının 72 saat boyunca başka bir tedaviye yer vermeden inkübatörde oturmasına izin verin.
4. 72 saat sonra, büyüme ortamını çıkarın ve 1 mL taze büyüme ortamı ile değiştirin. Pipet uçları ile kuyuların dibine dokunmayın. Hücrelerin inkübatörde 96 saat daha dinlenmesine izin verin.
5. 96 saat sonra, 2.4 adımını (ortam değişikliği) tekrarlayın ve hücrelerin 24 saat daha dinlenmesine izin verin.
   NOT: M0 makrofajları artık denemeler için kullanılmaya hazırdır (Şekil 2). Hücrelerin diğer deneylerin bir parçası olarak ele alınmasından hemen önce, büyüme ortamı takviyeleri hücre tedavisi için eklenen reaktiflerle parazite neden olabileceğinden, yalnızca RPMI (Malzeme Tablosu)ile bir medya değişikliği düşünün. M2 benzeri makrofajlara ihtiyaç duyulması durumunda bölüm 3'e geçin.

3. M0 makrofajlarının M2 benzeri makrofajlara polarizasyonu

1. IL-4 ve IL-13 stok çözeltisi hazırlayın (200 μL çekirdeksiz suda 20 μg IL-4 veya IL-13 çözün) ve hücre tedavisinden hemen önce PBS ile 2 ng/μL'lik son çalışma konsantrasyonuna seyreltin. Çözeltiyi buzda tutun ve hemen kullanın. Tekrar donma.
2. Büyüme ortamını çıkarın ve 1 mL taze büyüme ortamı ile değiştirin. Kuyu başına 20 ng interleukin 4 (IL-4) ve 20 ng interleukin 13 (IL-13) ekleyin. Hücrelerin inkübatörde 48 saat dinlenmesine izin verin.
3. 48 saat sonra, 3.2 adımlarını yineleyin. Hücrelerin inkübatörde 48 saat daha dinlenmesine izin verin.
4. Büyüme ortamını çıkarın ve 1 mL taze büyüme ortamı ile değiştirin. Hücrelerin inkübatörde 48 saat dinlenmesine izin verin.
   NOT: M2 benzeri makrofajlar artık denemeler için kullanılmaya hazırdır (Şekil 2). Hücrelerin diğer deneylerin bir parçası olarak ele alınmasından hemen önce, büyüme ortamı takviyeleri parazite neden olabileceğinden, yalnızca RPMI (Malzeme Tablosu) ile bir medya değişikliği düşünün.

4. Akış sitometrisi için makrofajların derli ve hasat

NOT: Akış sitometrisi için polarize makrofajları plakalardan ayırmak ve toplamak için soğuk şoklama ve hücre kazıma birleştirmek için mekanik bir yöntem kullanın.

1. Ilık hücre ortamını çıkarın ve buz gibi PBS (kalsiyum ve magnezyum olmadan) ve% 5 fetal sığır serumu (FBS), kuyu başına 1 mL karışımı ile değiştirin. Bundan hemen sonra, hücre plakasını 45 dakika boyunca buza yerleştirin. Sıcak hücre ortamı çıkarılmadan önce hücre plakasını buza yerleştirmeyin, çünkü bu hücre canlılığını önemli ölçüde azaltacaktır. Hücreleri sadece buz gibi PBS/%5 FBS karışımı ile soğuk şoka neden olduktan sonra buzda tutun.
2. Buzda 45 dakika sonra, mini hücre sıyırıcıları (Malzeme Masası) kullanarak hücrelerikazıyın. Soğuk PBS/%5 FBS'deki ayrılmış makrofajları 15 mL'lik bir tüpe hafifçe aktarın. Hücreler lekelenene kadar tüpü her zaman buzda tutun.
   NOT: Boyama için yeterli hücre sayısına ulaşmak için sekiz hücre kuyularını bir kenara ayırın.

Sonuçlar

M2 benzeri makrofajlar karakterize edildi ve M2 polarizasyonu, Farklılaşma İşaretçileri Kümesi (CD) CD14, CD11b, CD80 (M1 benzeri işaretleyici) ve CD206 (M2 benzeri işaretleyici) için akış sitometrisi kullanılarak doğrulandı. Akış sitometrisi boyama işlemi üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirildi. Makrofajlar PBS/%5 FBS ile yıkandı ve spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için Fcφ-reseptör bloğu ile inkübe edildi. Hücreler daha sonra FITC konjuge fare anti-insan CD14 ve CD80 antikorla...

Tartışmalar

THP-1 monosit benzeri hücrelerin 14 gün içinde ayırt edilmesi ve polarize edilmesi ile ilgili bu protokol, adımlar arasında yeterli dinlenme sürelerine sahip hücrelerin uzun tedavi inkübasyonu nedeniyle M2 benzeri belirgin bir fenotip ile makrofaj elde etmek için bir yöntem sağlar.

Bazı adımlar bu protokol için kritik öneme sahiptir. THP-1 monositlerinin iki katına çıkması yaklaşık 26 saattir. Hücreler 9 x 10⁵/mL hücre yoğunluğunda bölünebilir ve her böl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% trypan blue	VWR, Radnor, USA	152-5061
1.5 mL microcentrifuge tube	USA Scientific, Ocala, USA	1615-5510
10 mL serological pipet	VWR, Radnor, USA	89130-898
1000 μL TipOne pipet tips	USA Scientific, Ocala, USA	1111-2821
15 mL  Centrifuge tube	VWR, Radnor, USA	89039-664
20 μL TipOne pipet tips	USA Scientific, Ocala, USA	1120-1810
200 μL TipOne pipet tips	USA Scientific, Ocala, USA	1120-8810
25 mL serological pipet	VWR, Radnor, USA	89130-900
5 mL serological pipet	VWR, Radnor, USA	89130-896
50 mL Centrifuge tube	VWR, Radnor, USA	89039-662
Accutase solution 500 mL	Sigma, St. Louis, USA	A6964
Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized	Sigma, St. Louis, USA	A5955-100 mL	with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Binder CO2 Incubator	VWR, Radnor, USA	C170-ULE3
CytoOne T-75cm flask with filter cap	USA Scientific, Ocala, USA	CC7682-4875
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma, St. Louis, USA	D8537-500 mL	PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization
Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated)	Eppendorf, Enfield, USA	-
Ethyl alcohol (70%)	-	-
FACSCalibur flow cytometer	BD Biosciences, San Diego, USA	-	The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences)
Falcon 24-well plate	VWR, Radnor, USA	353504
Fetal Bovine Serum (FBS)	ATCC, Manassas, USA	30-2020
FITC Mouse Anti-Human CD14	BD Biosciences, San Diego, USA	555397	Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)
FITC Mouse Anti-Human CD80	BD Pharmingen, San Diego, USA	557226	Flow cytometry, M1 marker (100 tests)
FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD Pharmingen, San Diego, USA	555748	Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests)
FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control	BD Biosciences, San Diego, USA	553456	Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests)
Human BD Fc Block	BD Biosciences, San Diego, USA	564220	Flow cytometry, Fc block (0.25 mg)
Human interleukin 13 (IL-13)	R&D, Minneapolis, USA	IL-771-10 μg
Human interleukin 4 (IL-4)	R&D, Minneapolis, USA	SRP3093-20 μg
Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213)	Labconco, Kansas City, USA	-
L-Glutamine Solution, 200 mM	ATCC, Manassas, USA	30-2214
Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4	Sigma, St. Louis, USA	L2630-100 mg
Mini Cell Scrapers	Biotium, Fremont, USA	22003
Neubauer hemocytometer	Fisher Scientific, Waltham, USA	02-671-5
Nikon Eclipse inverted microscope TS100	Nikon, Melville, USA	-
Nuclease-free water	Invitrogen, Carlsbad, USA	AM9937
Olympus Light Microscope RH-2	Microscope Central, Feasterville, USA	40888
P10 variable pipet- Gilson	VWR, Radnor, USA	76180-014
P1000 variable pipet-Gilson	VWR, Radnor, USA	76177-990
P200 variable pipet- Gilson	VWR, Radnor, USA	76177-988
PE Mouse Anti-Human CD11b	BD Biosciences, San Diego, USA	555388	Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences, San Diego, USA	555749	Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests)
PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206	BD Pharmingen, San Diego, USA	551136	Flow cytometry, M2 marker (100 tests)
PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD Pharmingen, San Diego, USA	555750	Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests)
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, St. Louis, USA	P8139
Powerpette Plus pipettor	VWR, Radnor, USA	75856-448
Precision Water bath (model 183)	Precision Scientific, Chicago, USA	66551
RPMI-1640 Medium	ATCC, Manassas, USA	30-2001
THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC, Manassas, USA	TIB-202