Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

M2 benzeri tümör ilişkili makrofajlar (TAM) tümör ilerlemesi ve kanserde zayıf prognoz ile ilişkilidir. Bu protokol, THP-1 monosit benzeri hücreleri 14 gün içinde M2 benzeri makrofajlara yeniden ayırt etmek ve polarize etmek için ayrıntılı bir kılavuz görevi görür. Bu model, TAM'ın tümör mikroçevriciliği içindeki antienflamatuar etkilerini araştırmak için temel oluşturur.

Özet

Tümörle ilişkili makrofajlar (TAM) dış uyaranlara göre ekspresyonlarını ve sitokin profillerini değiştirebilir. Bu olağanüstü plastisite, TAM'ın tümör mikroçevriciliği içinde devam eden değişikliklere uyum sağlamasını sağlar. Makrofajlar öncelikle pro-enflamatuar (M1 benzeri) veya antienflamatuar (M2 benzeri) özelliklere sahip olabilir ve bu iki ana durum arasında sürekli geçiş yapabilir. Tümör ortamındaki M2 benzeri makrofajlar, çeşitli kanser türlerinde kanser ilerlemesi ve zayıf prognoz ile ilişkilidir. THP-1 hücrelerinin farklılaşmasını ve polarizasyonunu teşvik etmek için hücresel ve hücreler arası mekanizmaları ve TAM'ın tümörlerin mikroçevrasyonu içindeki etkilerini araştırmak için birçok farklı yöntem kullanılmaktadır. Şu anda, THP-1 hücre hattı kullanılarak M2 benzeri makrofaj polarizasyonu için belirlenmiş bir model yoktur ve bazı in vitro uyaranlara bağlı makrofajların ekspresyon ve sitokin profillerinin sonuçları çalışmalar arasında değişmektedir. Bu protokol, THP-1 monosit benzeri hücreleri M0 makrofajlarına ayırt etmek ve hücreleri 14 gün içinde M2 benzeri bir fenotipe daha da polarize etmek için ayrıntılı rehberlik görevi görür. Işık mikroskopisi kullanarak THP-1 monosit benzeri hücrelerin, farklılaştırılmış makrofajların ve polarize M2 benzeri makrofajların morfolojik değişimlerini gösteriyoruz. Bu model, TAM'ın antienflamatuar etkilerini ve tümör mikroçevresinin diğer hücre popülasyonlarıyla etkileşimlerini araştıran hücre hattı modellerinin temelidir.

Giriş

Tümör ilişkili makrofajlar (TAM) ve kronik inflamasyondaki rolleri, kanserin başlangıcı ve tümör gelişimi son araştırmalarda önemli hedeflerdir1,2. Gelişmekte olan tümörün doku mikroçevresine alınan periferik kan monositleri makrofajlara farklılık gösteren ve makrofajların iki ana alt tipine polarize edilebilen3. Klasik olarak aktive edilen makrofaj, öncelikle pro-enflamatuar M1 benzeri fenotipi temsil eder ve alternatif olarak aktive edilen M2 benzeri alt tip ağırlıklı olarak antienflamatuar özellikler gösterir4. Makrofajlar, hücresel metabolizmalarına bağlı ola....

Protokol

NOT: Bu iletişim kuralında açıklanan adımlara genel bakış Şekil 1'de gösterilmiştir. İnsan monosit benzeri lösemi hücre hattı THP-1 satın alındı. THP-1 hücre hattının kimliğini doğrulamak için kısa tandem tekrar analizi yapıldı. Tüm adımları steril koşullar altında gerçekleştirin. THP-1 monositik hücre hattı süspansiyonda büyür ve hücre kültürü yüzeylerine bağlanmaz. Bağlılık, monositlerin makrofaj benzeri hücrelere ayırt edilmesiyle, örneğin mekanik stres veya PMA ile spesifik tedavi yoluyla indüklenebilir.

1. THP-1 monosit benzeri hücrelerin kültleme ve bakımı

  1. 150 sn için bir zamanlayıcı ay....

Sonuçlar

M2 benzeri makrofajlar karakterize edildi ve M2 polarizasyonu, Farklılaşma İşaretçileri Kümesi (CD) CD14, CD11b, CD80 (M1 benzeri işaretleyici) ve CD206 (M2 benzeri işaretleyici) için akış sitometrisi kullanılarak doğrulandı. Akış sitometrisi boyama işlemi üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirildi. Makrofajlar PBS/%5 FBS ile yıkandı ve spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için Fcφ-reseptör bloğu ile inkübe edildi. Hücreler daha sonra FITC konjuge fare anti-insan CD14 ve CD80 antikorla.......

Tartışmalar

THP-1 monosit benzeri hücrelerin 14 gün içinde ayırt edilmesi ve polarize edilmesi ile ilgili bu protokol, adımlar arasında yeterli dinlenme sürelerine sahip hücrelerin uzun tedavi inkübasyonu nedeniyle M2 benzeri belirgin bir fenotip ile makrofaj elde etmek için bir yöntem sağlar.

Bazı adımlar bu protokol için kritik öneme sahiptir. THP-1 monositlerinin iki katına çıkması yaklaşık 26 saattir. Hücreler 9 x 105/mL hücre yoğunluğunda bölünebilir ve her böl.......

Açıklamalar

Yazarlar potansiyel çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

Louisville Üniversitesi Cerrahi Araştırma Fiyat Enstitüsü, John W. Price ve Barbara Thruston Atwood Price Trust tarafından finansal olarak desteklenmektedir. Fon kaynaklarının çalışmanın tasarımında ve yürütülmesinde ve verilerin toplanmasında, yönetiminde, analizinde ve yorumlanmasında hiçbir rolü yoktu.

....

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.4% trypan blueVWR, Radnor, USA152-5061
1.5 mL microcentrifuge tubeUSA Scientific, Ocala, USA1615-5510
10 mL serological pipetVWR, Radnor, USA 89130-898
1000 μL TipOne pipet tipsUSA Scientific, Ocala, USA1111-2821
15 mL  Centrifuge tubeVWR, Radnor, USA89039-664
20 μL TipOne pipet tipsUSA Scientific, Ocala, USA1120-1810
200 μL TipOne pipet tipsUSA Scientific, Ocala, USA1120-8810
25 mL serological pipetVWR, Radnor, USA 89130-900
5 mL serological pipetVWR, Radnor, USA 89130-896
50 mL Centrifuge tubeVWR, Radnor, USA89039-662
Accutase solution 500 mLSigma, St. Louis, USAA6964
Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilizedSigma, St. Louis, USAA5955-100 mLwith 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Binder CO2 IncubatorVWR, Radnor, USAC170-ULE3
CytoOne T-75cm flask with filter capUSA Scientific, Ocala, USACC7682-4875
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)Sigma, St. Louis, USAD8537-500 mLPBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization
Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated)Eppendorf, Enfield, USA-
Ethyl alcohol (70%)--
FACSCalibur flow cytometerBD Biosciences, San Diego, USA-The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences)
Falcon 24-well plateVWR, Radnor, USA353504
Fetal Bovine Serum (FBS)ATCC, Manassas, USA30-2020
FITC Mouse Anti-Human CD14BD Biosciences, San Diego, USA555397Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)
FITC Mouse Anti-Human CD80BD Pharmingen, San Diego, USA557226Flow cytometry, M1 marker (100 tests)
FITC Mouse IgG1 κ Isotype ControlBD Pharmingen, San Diego, USA555748Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests)
FITC Mouse IgG2a, κ Isotype ControlBD Biosciences, San Diego, USA553456Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests)
Human BD Fc BlockBD Biosciences, San Diego, USA564220Flow cytometry, Fc block (0.25 mg)
Human interleukin 13 (IL-13)R&D, Minneapolis, USAIL-771-10 μg
Human interleukin 4 (IL-4)R&D, Minneapolis, USASRP3093-20 μg
Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213)Labconco, Kansas City, USA-
L-Glutamine Solution, 200 mMATCC, Manassas, USA30-2214
Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4Sigma, St. Louis, USAL2630-100 mg
Mini Cell ScrapersBiotium, Fremont, USA22003
Neubauer hemocytometerFisher Scientific, Waltham, USA02-671-5
Nikon Eclipse inverted microscope TS100Nikon, Melville, USA-
Nuclease-free waterInvitrogen, Carlsbad, USAAM9937
Olympus Light Microscope RH-2Microscope Central, Feasterville, USA40888
P10 variable pipet- GilsonVWR, Radnor, USA76180-014
P1000 variable pipet-GilsonVWR, Radnor, USA76177-990
P200 variable pipet- GilsonVWR, Radnor, USA76177-988
PE Mouse Anti-Human CD11bBD Biosciences, San Diego, USA555388Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests)
PE Mouse IgG1, κ Isotype ControlBD Biosciences, San Diego, USA555749Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests)
PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206BD Pharmingen, San Diego, USA551136Flow cytometry, M2 marker (100 tests)
PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype ControlBD Pharmingen, San Diego, USA555750Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests)
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)Sigma, St. Louis, USAP8139
Powerpette Plus pipettorVWR, Radnor, USA75856-448
Precision Water bath (model 183)Precision Scientific, Chicago, USA66551
RPMI-1640 MediumATCC, Manassas, USA30-2001
THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC)ATCC, Manassas, USATIB-202

Referanslar

  1. Zhang, R., et al. Cancer-associated fibroblasts enhance tumor-associated macrophages enrichment and suppress NK cells function in colorectal cancer. Cell Death and Disease. 10 (4), 273 (2019).
  2. Wang, J., Li, D., Cang, H., Guo, B.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 174

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Araştırma

Eğitim

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır