مفرط piggyBac Transposase بوساطة التحول Germline في دودة الجيش الخريف، Spodoptera frugiperda

Xien Chen; Subba Reddy Palli

doi:10.3791/62714

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

تم تحقيق التحول الجرثومي الناجح في دودة الجيش الخريف، Spodoptera frugiperda، باستخدام مرنا من نقل piggyBac مفرط النشاط.

Abstract

إن الإدراج المستقر للشحن الجيني في جينوم الحشرات باستخدام عناصر قابلة للانتقال هو أداة قوية للدراسات الجينومية الوظيفية ووضع استراتيجيات إدارة الآفات الوراثية. العنصر الأكثر استخداما القابلة للتحويل في تحول الحشرات هو piggyBac، وقد تم إجراء تحويل الجرثومة المستندة إلى piggyBacبنجاح في الحشرات النموذجية. ومع ذلك ، لا يزال من الصعب استخدام هذه التكنولوجيا في الحشرات غير النموذجية التي تشمل الآفات الزراعية. هذه الورقة تقارير عن التحول الجرثومي من الآفات الزراعية العالمية، ودودة الجيش الخريف (FAW)، Spodoptera frugiperda،وذلك باستخدام نقل piggyBac مفرط النشاط (hyPBase).

في هذا العمل، تم إنتاج الحمض النووي الريبي hyPBase واستخدامه بدلا من البلازميد المساعد في عمليات التجريب الدقيق للجنين. وأدى هذا التغيير إلى نجاح جيل من FAW المعدلة وراثيا. وعلاوة على ذلك، فإن أساليب فحص الحيوانات المعدلة وراثيا، والكشف السريع القائم على PCR من إدخال المتحولين جنسيا، وتحديد موقع التكامل القائم على PCR المتشابكة الحرارية (TAIL-PCR). وهكذا، تقدم هذه الورقة بروتوكولا لإنتاج FAW المعدلة وراثيا، والتي سوف تسهل نقل النسل piggyBacالقائم في FAW وغيرها من الحشرات lepidopteran.

Introduction

دودة الجيش الخريف (FAW), Spodoptera frugiperda, هو الأصلي إلى المناطق الاستوائية وشبه الاستوائية في أمريكا. حاليا ، هذا هو عشب الحشرات المدمرة في أكثر من 100 دولة في جميع أنحاء العالم¹. تتغذى يرقات FAW على أكثر من 350 مصنعا مضيفا ، بما في ذلك بعض المحاصيل الغذائية الأساسية الهامة^2. قدرة الهجرة القوية للبالغين FAW يساهم في انتشاره السريع مؤخرا من الأمريكتين إلى أماكن أخرى¹^،². ونتيجة لذلك ، تهدد هذه الحشرة الآن الأمن الغذائي على الصعيد الدولي. وقد ييسر تطبيق التكنولوجيات الجديدة إجراء دراسات متقدمة في FAW ويوفر استراتيجيات جديدة لإدارة هذه الآفة.

وقد استخدم التحول الجرثومي الحشري لدراسة وظيفة الجينات وتوليد الحشرات المعدلة وراثيا لاستخدامها في السيطرة الوراثية³^،⁴. من بين الطرق المختلفة المستخدمة لتحقيق التحول الجيني في الحشرات ، فإن الطريقة المستندة إلى عنصر piggyBac هي الطريقة الأكثر استخداما^5. ومع ذلك ، نظرا لانخفاض معدل النقل ، لا يزال من الصعب إجراء تولد في الحشرات غير النموذجية. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير نسخة مفرطة النشاط من نقل piggyBac (hyPBase)⁶^،⁷. تم تحقيق التحول Germline في FAW مؤخرا⁸، وهو أول تقرير يستخدم hyPBase في الحشرات lepidopteran. في هذا التقرير، يتم وصف معلومات مفصلة عن استخدام الحمض النووي الريبي hyPBase في توليد FAW المعدلة وراثيا. يمكن تطبيق الطريقة الموصوفة هنا لتحقيق تحول الحشرات lepidopteran الأخرى.

Protocol

1. في تركيب المختبر من الحمض النووي الريبي hyPBase

ملاحظة: تم توليف تسلسل الترميز الكامل لتسلسل hyPBase وإدراجه في ناقل pTD1-Cas9 (انظر جدول المواد)لإنتاج بناء pTD1-hyPBase ، والذي يحتوي على كاسيت التعبير عن hyPBase ، T7 المروج: polyhedrin-5 ' UTR: hyPBase: البوليهيدرين-3' UTR: بولي (A). يتم توفير التسلسل الكامل للبناء pTD1-hyPBase في المواد التكميلية.

إعداد القالب لتركيب في المختبر
1. أداء رد فعل PCR لتضخيم كاسيت التعبير عن hyPBase باستخدام التمهيدي إلى الأمام، 5'- atgcggtgtgaagacagcacagatgcg-3'، والتمهيدي العكسي 5'- tagaggccaggtgctag-3'، البوليمرات عالية الدقة، وpTD1-hyPBase plasmid كقالب.
  ملاحظة: يحتوي تفاعل PCR (الحجم النهائي 50 ميكرولتر) على 5.0 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتفاعل 10x، 4.0 ميكرولتر من 10 م ديوكسينوكليوسيد ثلاثي الفوسفات (dNTP)، 1.0 ميكرولتر من البلازميد (50 ميكروغرام/ميكرولتر)، 1.0 ميكرولتر من البوليميراز عالي الدقة، 1.0 ميكرولتر لكل من 10 ميكرومترات إلى الأمام وعكس التمهيديات، و 33 ميكروغرام من المياه الخالية من النيوكليز. وكانت الإعدادات كما يلي: حضانة أولية من 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، تليها 35 دورة من 98 درجة مئوية لمدة 10 ق، و 60 درجة مئوية لمدة 15 s، و 68 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
2. تحقق من منتج PCR على هلام الآغاروز 1٪ في 120 V في الطازجة تريس خلات إيثيلينديامين حمض رباعي الأسيتيك (TAE) العازلة لمدة 30 دقيقة وتنقية المنتج مع عدة استخراج هلام.
  ملاحظة: لا تستخدم مجموعة تنقية المنتج PCR. حتى كمية ضئيلة من pTD1-hyPBase plasmid يقلل بشكل كبير من كفاءة التوليف في المختبر.
في تركيب المختبر من الحمض النووي الريبي hyPBase باستخدام عدة تجارية
1. إذابة الكواشف المجمدة تماما، والحفاظ على الإنزيم و2x NTP / CAP الحل على الجليد، وترك المذاب 10x رد فعل العازلة في درجة حرارة الغرفة.
2. تجميع رد الفعل في درجة حرارة الغرفة بإضافة المكونات التالية: 2x NTP/CAP الحل: 10 ميكرولتر; 10x رد فعل العازلة: 2 ميكرولتر; الحمض النووي القالب: 0.1-0.2 ميكروغرام; مزيج الانزيم: 2 ميكرولتر; مياه خالية من النيوكليز إلى 20 ميكرولتر.
3. خلط الكواشف جيدا عن طريق الأنابيب بلطف الخليط صعودا وهبوطا واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 2-4 ساعة.
استعادة مرنا توليفها من قبل كلوريد الليثيوم هطول الأمطار
1. إضافة 30 ميكرولتر من محلول هطول الأمطار LiCl، مزيج جيدا عن طريق النقر على الأنبوب، ومن ثم تبقى في -20 درجة مئوية لمدة ≥ 30 دقيقة.
2. جهاز الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة بأقصى سرعة، وإزالة supernatant بعناية.
3. غسل بيليه مرة واحدة مع 1 مل من الإيثانول 70٪، وإعادة الطرد المركزي، وإزالة supernatant بعناية.
4. جفف الكريات في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 دقيقة، ثم أعيد إنفاق بيليه مع 20-40 ميكرولتر من المياه الخالية من النيوكليز.
5. تمييع 1 ميكرولتر من محلول مرنا مع 9 ميكرولتر من المياه الخالية من النيوكليز. خذ 2 ميكرولتر لتحديد تركيز مرنا واستخدام 8 ميكرولتر للتحقق من جودة مرنا على هلام الآغاروز 1٪ في 100 V في العازلة TAE الطازجة لمدة 40 دقيقة.
6. Aliquot الحل مرنا وتخزين المجمدة في -70 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة.
  ملاحظة: لا تجف تماما بيليه مرنا; قد يكون من الصعب حله في الماء.

2. الميكرويكشن

جمع البيض
1. ضع 12 جروا ذكرا و12 جروة أنثى في صندوق 15 سم × 15 سم × 10 سم. غطي الصندوق بمنشفة ورقية. ضع محلول السكروز بنسبة 10٪ في الصندوق لإطعام البالغين.
2. في اليوم 2 بعد انهيار، يعرض البالغين للضوء الشديد بين عشية وضحاها.
3. في اليوم الثالث بعد الانفجار، قم بنقل البالغين من الخطوة 2.1.2 إلى مكان مظلم. جمع الأجنة في غضون 2 ساعة بعد oviposition.
4. أضف قطرات من الماء إلى قطعة من منشفة ورقية مع البيض الطازج المحفوظة في طبق بيتري على الجليد. نقل البيض بلطف إلى شريحة زجاجية مع فرشاة ناعمة ومحاذاتها واحدا تلو الآخر على شريحة زجاجية. الحفاظ على الشرائح الزجاجية مع البيض المنحازة على الجليد قبل microinjection.
إعداد الميكرويكشن
1. حقن خليط من البروتين الفلوري الأخضر المحسن المعدلة وراثيا (EGFP) - التعبير عن البلازميد (200 نانوغرام / ميكرولتر) ، pBac: hr5ie1 - EGFP - SV40 ، hyPBase mRNA (200 نانوغرام / ميكرولتر) ، والماء المقطر العقيم في البيض ، وذلك باستخدام ضغط التعويض من microinjector الآلي (انظر جدول المواد).
2. حافظي على البيض المحقون عند 27 ± 1 درجة مئوية، 60 ± رطوبة نسبية بنسبة 10٪ حتى الفقس.
3. تغذية اليرقات فقست على نظام غذائي اصطناعي، ونقل كل يرقة إلى كوب واحد صغير في مرحلة 3 في وقت مبكر^{من نجمة (~} 6 ملم في الطول، ولون الجسم يتحول الأسود).

3. فحص الفلورسينس وعبور الجينية

جمع الخوادر ومكان ~ 150 أنثى الخوادر و ~ 150 جروا الذكور في قفص 35 سم × 35 سم × 35 سم. شنق عدة قطع من المناشف الورقية (~ 30 سم × 15 سم) في القفص لجمع البيض.
جمع المناشف الورقية مع البيض يوميا، والحفاظ على البيض في 27 ± 1 درجة مئوية، 60 ± 10٪ الرطوبة النسبية حتى الفقس.
احتفظ بيرقات الولدان عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق لشل حركتها ، ثم نقلها إلى صفيحة باردة الجليد.
فحص يرقات حديثي الولادة المشلول تحت منظار مجسم مفلور. حدد الأطفال حديثي الولادة الإيجابية EGFP، ورفعها إلى مرحلة pupal في ~ 2 أسابيع في 27 ± 1 درجة مئوية، وفصلها حسب الجنس وفقا للاختلافات النمط الظاهري في شرائح البطن البطني.
ملاحظة: تحتوي الجراء الأنثوية على فتحة تناسلية تشبه الشق على الجزء الثامن من البطن والهوامش الدماغية للجزأين التاسع والعاشر المنحني نحو فتحة الأعضاء التناسلية. الفتحة التناسلية للجرو الذكر لديها ارتفاع طفيف على الجزء البطني التاسع.
ضع الخوادر الإيجابية ل EGFP والجرو البري من الجنس الآخر في الذكور: نسبة الإناث من 1:1 في القفص. سيب عبر الكبار التعبير عن EGFP لإنتاج الأجيال التالية.

4. PCR الكشف عن الإدراج المعدلة وراثيا

استخراج الحمض النووي الجينومي من النوع البري واليرقات الفردية الإيجابية EGFP باستخدام أي مجموعة استخراج الحمض النووي الجينومي التجاري وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
إجراء تفاعل PCR باستخدام الحمض النووي الجينومي كقالب؛ التمهيدي إلى الأمام، 5'- acgtacgctcctcgtgttccgttc-3'يقع في منطقة المروج ie1؛ و التمهيدي العكسي، 5'- aagcactgcacgccgtaggtcag-3' الموجود في منطقة EGFP من متجه التحول.
إعداد كل تفاعل PCR (الحجم النهائي من 40 ميكرولتر) لاحتواء 20 ميكرولتر من خليط البوليميراز، 1.0 ميكرولتر من الحمض النووي الجينومي (40 ميكروغرام/ ميكرولتر)، 1.0 ميكرولتر لكل من 10 ميكرومتر إلى الأمام وعكس التمهيديات، و 17 ميكروغرام من المياه الخالية من النيوكليز. استخدم الإعدادات التالية: حضانة أولية تبلغ 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، تليها 35 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 20 s، و 56 درجة مئوية لمدة 20 s، و 68 درجة مئوية لإعدادات 40 s.
تحقق من منتجات PCR على هلام agarose 1٪ في 120 V لمدة 30 دقيقة.

5. تحديد موقع الإدراج المعدل وراثيا

قم بإجراء TAIL-PCR عالي الكفاءة باستخدام الحمض النووي الجينومي كنموذج لتحديد موقع تكامل إدخال المتحولين جنسيا في الحشرات الإيجابية ل EGFP.
1. تنفيذ ردود الفعل PCR باتباع الخطوات الموضحة في مكان آخر⁹.
  1. استخدام ثلاثة التمهيديات، P1: 5'-atcagtgacacttaccgcgacagcc-3'، P2: 5'-tcacgggagctccagcggcgactg-3'، وP3: 5'-atgtcctaagcgcgcgacggggcgct-3'، والتي هي محددة لنقل piggyBac، في 3 جولات من رد فعل PCR، على التوالي.
تسلسل منتجات PCR النهائي لتحديد موقع التكامل.

النتائج

بناء للتعبير عن المروج T7 التي تحتوي على hyPBase: بوليهيدرين-5'UTR: hyPBase: بوليهيدرين-3'UTR: بولي (A) تم إنشاءإشارة (الشكل 1A)وتضخيمها على أنها جزء PCR ~ 2.2 kb لتجميع الحمض النووي الريبي hyPBase في المختبر (الشكل 1B). ثم، تم إنتاج الحمض النووي الريبي hyPBase وتعرض لكهروفورسيس هلا?...

Discussion

يحد المعدل المنخفض للتحويل وصعوبة توصيل المكونات المعدلة وراثيا إلى أجنة جديدة من نجاح التحول الجرثومي في العديد من الحشرات غير النموذجية ، وخاصة تلك الموجودة من أجل ، Lepidoptera. لزيادة معدل التحول الجرثومي، تم تطوير نسخة مفرطة النشاط من نقل piggyBac الأكثر استخداما (hyPBase)⁷^،

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

ويدعم البحث المبلغ عنه المؤسسة الوطنية للعلوم I/UCRC، مركز تقنيات إدارة المفصليات، تحت المنحة رقم IIP-1821936 ومن قبل شركاء الصناعة، منحة تنافسية لمبادرة الزراعة والبحوث الغذائية رقم 2019-67013-29351 والمعهد الوطني للأغذية والزراعة، وزارة الزراعة الأمريكية (2019-67013-29351 2353057000).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5" Dental Cotton Rolls	PlastCare USA	8542025591	REARING
1 oz Souffle Cup Lids	DART	PL1N
1 oz Souffle Cups	DART	P100N	REARING
48 oz Plastic Deli Containers	Genpack	AD48	REARING
Add-on Filter Set (Green)	NightSea LLC	SFA-BLFS-GR	SCREENING
Borosilicate Glass	Sutter Instruments	BF100-50-10	INJECTION
Borosilicate Glass	SUTTER INSTRUMENT	BF-100-50-10
Dissecting Scope	Nikon	SMZ745T	SCREENING
Featherweight Forceps	BioQuip	4750	REARING
Gutter Guard	ThermWell Products	VX620	REARING
Inverted Microscope	Olympus	IX71	INJECTION
Microinjector	Narishige	IM-300	INJECTION
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-1000	INJECTION
Microscope Slides	VWR	16004-22	INJECTION
NightSea Full System	NightSea LLC	SFA-RB-DIM	SCREENING
Nitrogen Gas	AWG/Scott-Gross	NI 225	INJECTION
Paper Towels	Bounty	43217-45074	REARING
Spodoptera frugiperda Artificial Diet	Southland Products, Inc	N/A [Request Species/Quantity]	REARING
Spodoptera frugiperda Eggs	Benzon Research, Inc	N/A [Request Species/Quantity]	REARING
Taq MasterMix			polymerase mixture

References

Gui, F., et al. Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda. Protein Cell. , (2020).
Montezano, D. G., et al. Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas. African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).
Li, Z., et al. Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513 (2015).
Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).
Gregory, M., Alphey, L., Morrison, N. I., Shimeld, S. M. Insect transformation with piggyBac: getting the number of injections just right. Insect Molecular Biology. 25 (3), 259-271 (2016).
Otte, M., et al. Improving genetic transformation rates in honeybees. Scientific Reports. 8 (1), 16534 (2018).
Eckermann, K. N., et al. Hyperactive piggyBac transposase improves transformation efficiency in diverse insect species. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 98, 16-24 (2018).
Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner. RNA Biology. , 1-9 (2020).
Liu, Y. G., Chen, Y. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences. Biotechniques. 43 (5), 649-650 (2007).
Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
Xu, H., O'Brochta, D. A. Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487 (2015).
Wu, S. C. -. Y., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).
Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).
Handler, A. M., Harrell, R. A. Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector. Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).
Dreyfus, M., Régnier, P. The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria. Cell. 111 (5), 611-613 (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

175 piggyBac Spodoptera frugiperda

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: