Hiperaktif piggyBac Transposase aracılı Germline Dönüşümü Sonbahar Ordu Kurdu, Spodoptera frugiperda

Özet

Sonbahar ordu kurdunda başarılı germline dönüşümü, Spodoptera frugiperda, hiperaktif piggyBac transposase mRNA kullanılarak elde edildi.

Özet

Genetik kargonun transpoze edilebilir elementler kullanılarak böcek genomlarına istikrarlı bir şekilde yerleştirilmesi, fonksiyonel genomik çalışmalar ve genetik haşere yönetim stratejileri geliştirmek için güçlü bir araçtır. Böcek dönüşümünde en çok kullanılan transpoze edilebilir element piggyBacve piggyBactabanlı germline dönüşümü model böceklerde başarıyla gerçekleştirildi. Bununla birlikte, bu teknolojiyi tarım zararlılarını içeren model olmayan böceklerde çalıştırmak hala zordur. Bu makale, hiperaktif piggyBac transposase (hyPBase) kullanılarak küresel bir tarım zararlısının, sonbahar ordu kurdunun (FAW), Spodoptera frugiperda'nıngermline dönüşümini rapor ediyor.

Bu çalışmada hyPBase mRNA embriyo mikroenjeksiyonlarında yardımcı plazmid yerine üretilmiş ve kullanılmıştır. Bu değişiklik, transgenik FAW'ın başarılı bir şekilde üretilmesine yol açtı. Ayrıca transgenik hayvanların taranması, transgene yerleştirmenin PCR tabanlı hızlı tespiti ve entegrasyon sahasının termal asimetrik interlaced PCR (TAIL-PCR) tabanlı belirlenmesi yöntemleri de açıklanmıştır. Bu nedenle, bu makale FAW ve diğer lepidopteran böceklerde domuzbactabanlı transgenez kolaylaştıracak transgenik FAW üretmek için bir protokol sürmektedir.

Giriş

Sonbahar ordu kurdu (FAW), Spodoptera frugiperda, Amerika'nın tropikal ve subtropikal bölgelerine özgüdür. Şu anda, bu dünya çapında 100'den fazla ülkede yıkıcı bir böcek otobur¹. FAW larvaları, bazı önemli temel gıda bitkileri de dahil olmak üzere 350'den fazla konak bitki ile beslenir². FAW yetişkinlerinin güçlü göç yeteneği, Amerika'dan diğer yerlere hızla yayılmasına katkıda bulunur^1,2. Sonuç olarak, bu böcek şimdi uluslararası gıda güvenliğini tehdit ediyor. Yeni teknolojilerin uygulanması FAW'da ileri çalışmaları kolaylaştırabilir ve bu zararlıyı yönetmek için yeni stratejiler sağlayabilir.

Böcek germline dönüşümü gen fonksiyonunu incelemek ve genetik kontrolde kullanılmak üzere transgenik böcekler üretmek için kullanılmıştır^3,4. Böceklerde genetik dönüşümü sağlamak için kullanılan çeşitli yöntemler arasında, piggyBac element tabanlı yöntem en çok kullanılan yöntemdir⁵. Bununla birlikte, düşük transpozisyon oranı nedeniyle, model olmayan böceklerde transgenez yapmak hala zordur. Son zamanlarda, piggyBac transposase 'nin (hyPBase) hiperaktif bir sürümü geliştirildi^6,7. Germline dönüşümü FAW'da yakın zamanda elde edildi⁸Lepidopteran böceklerinde hyPBase'i kullanan ilk rapordur. Bu raporda, transgenik FAW oluşturmada hyPBase mRNA kullanımı hakkında ayrıntılı bilgi açıklanmıştır. Burada açıklanan yöntem, diğer lepidopteran böceklerinin dönüşümini sağlamak için uygulanabilir.

Protokol

1. hyPBase mRNA'nın in vitro sentezi

NOT: HyPBase dizisinin tam kodlama dizisi sentezlendi ve bir pTD1-Cas9 vektörüne eklendi (bkz. Malzeme Tablosu)pTD1-hyPBase yapısı üretmek için, hyPBase ifade kaseti içeren, T7 promotörü: polyhedrin-5' UTR: hyPBase: polihedrin-3' UTR: poli (A). pTD1-hyPBase yapının tam sırası Tamamlayıcı Malzeme'de sağlanmıştır.

1. In vitro sentez için şablonun hazırlanması
   1. İleri astar, 5'- atgcggtgtgaaataccgcagatgcg-3' ve ters astar 5'- tagaggccccaaggttatgctag-3', yüksek kaliteli polimeraz ve şablon olarak pTD1-hyPBase plasmid kullanarak hyPBase ifade kasetini yükseltmek için bir PCR reaksiyonu gerçekleştirin.
      NOT: PCR reaksiyonu (50 μL'lik son hacim) 5,0 μL 10x Reaksiyon tamponu içerir, 4,0 μL 10 mM deoksinükleozit trifosfat (dNTP), 1,0 μL plazmid (50 μg/μL), 1,0 μL yüksek kaliteli polimeraz, 10 μM ileri ve ters astarların her biri 1,0 μL, ve 33 μL çekirdeksiz su. Ayarlar şu şekildeydi: 3 dakika boyunca 95 °C'lik bir başlangıç inkübasyonu, ardından 10 s için 98 °C'lik 35 döngü, 15 s için 60 °C ve 2 dakika için 68 °C.
   2. PCR ürününü taze Tris-asetat-etilenediamin tetraasetik asit (TAE) tamponunda 120 V'ta %1 agarose jel üzerinde 30 dakika boyunca kontrol edin ve jel ekstraksiyon kiti ile ürünü arındırın.
      NOT: PCR ürün arıtma kitini kullanmayın. pTD1-hyPBase plazmidinin bir iz miktarı bile in vitro sentezin verimliliğini önemli ölçüde azaltır.
2. Ticari bir kit kullanarak hyPBase mRNA'nın in vitro sentezi
   1. Donmuş reaktifleri tamamen çözün, enzimi ve 2x NTP/CAP çözeltisini buzda tutun ve çözülmüş 10x Reaksiyon tamponu oda sıcaklığında bırakın.
   2. Aşağıdaki bileşenleri ekleyerek reaksiyonun oda sıcaklığında bir araya getirilmiştir: 2x NTP/CAP çözeltisi: 10 μL; 10x Reaksiyon tamponu: 2 μL; Şablon DNA'sı: 0.1-0.2 μg; Enzim karışımı: 2 μL; 20 μL'ye kadar nükleaz içermeyen su.
   3. Karışımı hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyarak reaktifleri iyice karıştırın ve 2-4 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
3. Sentezlenmiş mRNA'nın lityum klorür çökeltimi ile geri kazanımı
   1. 30 μL LiCl Çökeltme Çözeltisi ekleyin, tüpü hafifçe vurarak iyice karıştırın ve ardından ≥ 30 dakika boyunca -20 ° C'de tutun.
   2. Maksimum hızda 15 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj ve süpernatantı dikkatlice çıkarın.
   3. Peletı bir kez% 70 etanol 1 mL ile yıkayın, yeniden santrifüjlayın ve üstnatantı dikkatlice çıkarın.
   4. Peletin oda sıcaklığında 1-2 dakika kurutun ve ardından peletin 20-40 μL çekirdeksiz su ile yeniden depolayın.
   5. 1 μL mRNA çözeltisi ile 9 μL çekirdeksiz su ile seyreltin. mRNA konsantrasyonu belirlemek için 2 μL alın ve 40 dakika boyunca taze TAE tamponunda 100 V'ta% 1 agarose jel üzerinde mRNA kalitesini kontrol etmek için 8 μL kullanın.
   6. mRNA çözeltisini aliquotlayın ve bir yıla kadar -70 °C'de dondurulmuş olarak saklayın.
      NOT: mRNA peletini tamamen kurutmayın; suda eritmek daha zor olabilir.

2. Mikroenjeksiyon

1. Yumurta koleksiyonu
   1. 15 cm x 15 cm x 10 cm'lik bir kutuya 12 erkek pupa ve 12 dişi pupa yerleştirin. Kutuyu kağıt havluyla kaplayın. Yetişkinleri beslemek için kutuya% 10 sakkaroz çözeltisi yerleştirin.
   2. 2. gün eklosyon sonrası, yetişkinleri bir gecede yoğun ışığa maruz bırakın.
   3. 3. gün eklosyon sonrası, yetişkinleri adım 2.1.2'den karanlık bir yere aktarın. Yumurtlamadan sonra embriyoları 2 saat içinde toplayın.
   4. Buz üzerinde bir Petri kabında tutulan taze yumurtalarla kağıt havlu parçasına damla su ekleyin. Yumurtaları ince bir fırça ile hafifçe cam bir kaydırağa aktarın ve cam bir kaydırağa tek tek hizalayın. Mikroenjeksiyondan önce cam slaytları hizalanmış yumurtalarla buz üzerinde tutun.
2. Mikroenjeksiyon kurulumu
   1. Transgenik gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) ifade edici plazmid (200 ng/μL), pBac: hr5ie1-EGFP-SV40, hyPBase mRNA (200 ng/μL) karışımı enjekte edin ve otomatik mikroenjektörün kompanzasyon basıncını kullanarak yumurtalara steril damıtılmış su enjekte edin (bkz. Malzeme Tablosu).
   2. Enjekte edilen yumurtaları yumurtadan çıkana kadar 27 ± 1 °C, 60 ± % 10 bağıl nemde tutun.
   3. Yumurtadan çıkan larvaları yapay bir diyetle besleyin ve her larvayı erken 3^rd başlangıç aşamasında (~ 6 mm uzunluğunda ve vücut rengi siyaha döner) küçük bir kaba aktarın.

3. Floresan tarama ve genetik geçiş

1. Pupaları toplayın ve ~150 dişi pupa ve ~150 erkek pupayı 35 cm x 35 cm x 35 cm kafese yerleştirin. Yumurtaları toplamak için kafese birkaç parça kağıt havlu (~30 cm x 15 cm) asın.
2. Kağıt havluları günlük yumurtalarla toplayın ve yumurtaları yumurtadan çıkana kadar 27 ± 1 °C, 60 ±% 10 bağıl nemde tutun.
3. Yenidoğan larvalarını hareketsiz hale getirmek için 5 dakika boyunca 4 °C'de tutun ve ardından buz gibi bir tabağa aktarın.
4. Hareketsiz yenidoğan larvalarını floresan stereomikroskop altında tarayın. EGFP pozitif yenidoğanları seçin, 27 ± 1 ° C'de ~ 2 hafta içinde pupal aşamasına yükseltin ve ventral karın segmentlerindeki fenotip farklılıklarına göre cinsiyete göre ayırın.
   NOT: Dişi pupa sekizinci karın segmentinde yarık benzeri bir genital açıklığa ve dokuzuncu ve onuncu segmentlerin sefalik kenar boşlukları genital açıklığa doğru kıvrılır. Erkek pupanın genital açıklığı dokuzuncu karın segmentinde hafif bir yüksekliğe sahiptir.
5. EGFP pozitif pupaları ve karşı cinsin vahşi tip pupalarını bir erkeğe yerleştirin: bir kafese 1:1 kadın oranı. Sib- sonraki nesilleri üretmek için EGFP ifade yetişkinleri çapraz.

4. Transgenik yerleştirmenin PCR tespiti

1. Üreticinin talimatlarını takip eden herhangi bir ticari genomik DNA ekstraksiyon kiti kullanarak vahşi tip ve EGFP pozitif bireysel larvalardan genomik DNA çıkarın.
2. Genomik DNA'yı şablon olarak kullanarak pcr reaksiyoni gerçekleştirin; ie1 organizatör bölgesinde bulunan 5'- acgtacgctcctcggttccgttcc-3' ileri astar; ve dönüşüm vektörün EGFP bölgesinde bulunan 5'- aagcactgcacgccgtaggtcag-3' ters astar.
3. Her PCR reaksiyonu (40 μL'lik son hacim) 20 μL polimeraz karışımı, 1,0 μL genomik DNA (40 μg/μL), 10 μM ileri ve ters astarın her biri 1,0 μL ve 17 μL çekirdeksiz su içerecek şekilde ayarlayın. Aşağıdaki ayarları kullanın: 3 dakika boyunca 95 °C'lik bir başlangıç inkübasyonu, ardından 20 s için 95 °C,20 s için 56 °C ve 40 s ayar için 68 °C'lik 35 döngü.
4. PCR ürünlerini 30 dakika boyunca 120 V'te% 1 agarose jel üzerinde kontrol edin.

5. Transgenik ekleme bölgesinin belirlenmesi

1. EGFP pozitif böceklerde transgene eklemenin entegrasyon alanını belirlemek için şablon olarak genomik DNA kullanarak yüksek verimli TAIL-PCR gerçekleştirin.
   1. PCR reaksiyonlarını başka bir yerde açıklanan adımları izleyerek^{gerçekleştirin 9}.
      1. Üç astar kullanın, P1: 5'-atcagtgacacttaccgcattgacaagcacgcc-3', P2: 5'-tcacgggagctccaagcggcgactg-3', ve P3: 5'-atgtcctaaatgcagcgacggattcgcgct-3', piggyBac vektörüne özgü, 3 tur PCR reaksiyonunda.
2. Tümleştirme sitesini belirlemek için son PCR ürünlerini sıralayın.

Sonuçlar

HyPBase içeren T7 promotörünün ifadesi için bir yapı: polihedrin-5'UTR: hyPBase: polihedrin-3'UTR: poli (A) sinyali oluşturuldu (Şekil 1A) ve hyPBase mRNA in vitro sentezlemek için ~2.2 kb PCR parçası olarak yükseltildi (Şekil 1B). Daha sonra hyPBase mRNA üretildi ve agarose jel elektroforezise tabi tutuldu. Beklenen boyuttaki mRNA (~1,1 kb bant) %1 agarose jel üzerinde tespit edildi (Şekil 1C).

Tartışmalar

Transpozisyon oranının düşük olması ve transgenik bileşenleri taze embriyolara ulaştırmanın zorluğu, özellikle sipariş olan Lepidoptera'dan gelen birçok model olmayan böcekte germline dönüşümünün başarısını sınırlar. Germline dönüşüm oranını artırmak için, en yaygın kullanılan piggyBac transposase'nin (hyPBase) hiperaktif bir sürümü geliştirildi^7,10. Bugüne kadar, lepidopteran böceklerde başarılı germline dö...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5" Dental Cotton Rolls	PlastCare USA	8542025591	REARING
1 oz Souffle Cup Lids	DART	PL1N
1 oz Souffle Cups	DART	P100N	REARING
48 oz Plastic Deli Containers	Genpack	AD48	REARING
Add-on Filter Set (Green)	NightSea LLC	SFA-BLFS-GR	SCREENING
Borosilicate Glass	Sutter Instruments	BF100-50-10	INJECTION
Borosilicate Glass	SUTTER INSTRUMENT	BF-100-50-10
Dissecting Scope	Nikon	SMZ745T	SCREENING
Featherweight Forceps	BioQuip	4750	REARING
Gutter Guard	ThermWell Products	VX620	REARING
Inverted Microscope	Olympus	IX71	INJECTION
Microinjector	Narishige	IM-300	INJECTION
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-1000	INJECTION
Microscope Slides	VWR	16004-22	INJECTION
NightSea Full System	NightSea LLC	SFA-RB-DIM	SCREENING
Nitrogen Gas	AWG/Scott-Gross	NI 225	INJECTION
Paper Towels	Bounty	43217-45074	REARING
Spodoptera frugiperda Artificial Diet	Southland Products, Inc	N/A [Request Species/Quantity]	REARING
Spodoptera frugiperda Eggs	Benzon Research, Inc	N/A [Request Species/Quantity]	REARING
Taq MasterMix			polymerase mixture