Transformation germinale hyperactive médiée par la transposase chez la chenille légionnaire d’automne, Spodoptera frugiperda

Résumé

Une transformation germinale réussie chez la légionnaire d’automne, Spodoptera frugiperda,a été obtenue en utilisant l’ARNm de la transposase hyperactive piggyBac.

Résumé

L’insertion stable de cargaisons génétiques dans les génomes d’insectes à l’aide d’éléments transposables est un outil puissant pour les études génomiques fonctionnelles et l’élaboration de stratégies de lutte génétique contre les ravageurs. L’élément transposable le plus utilisé dans la transformation des insectes est piggyBac, et la transformation germinale à base de piggyBaca été menée avec succès chez des insectes modèles. Cependant, il est toujours difficile d’utiliser cette technologie dans des insectes non modèles qui incluent des ravageurs agricoles. Cet article rend compte de la transformation germinale d’un ravageur agricole mondial, la légionnaire d’automne (FAW), Spodoptera frugiperda,en utilisant la transposase hyperactive piggyBac (hyPBase).

Dans ce travail, l’ARNm hyPBase a été produit et utilisé à la place du plasmide auxiliaire dans les microinjections embryonnaires. Ce changement a conduit à la génération réussie de FAW transgénique. En outre, les méthodes de dépistage des animaux transgéniques, la détection rapide de l’insertion de transgènes par PCR et la détermination du site d’intégration par PCR entrelacée asymétrique thermique (TAIL-PCR) sont également décrites. Ainsi, cet article présente un protocole pour produire du FAW transgénique, qui facilitera la transgénèse à base de piggyBacchez le FAW et d’autres insectes lépidoptères.

Introduction

La chenille légionnaire d’automne (FAW), Spodoptera frugiperda,est originaire des régions tropicales et subtropicales d’Amérique. Actuellement, il s’agit d’un insecte herbivore dévastateur dans plus de 100 pays à travers le monde¹. Les larves de FAW se nourrissent de plus de 350 plantes hôtes, y compris d’importantes cultures vivrières de base². La forte capacité de migration des adultes FAW contribue à sa récente propagation rapide des Amériques à d’autres endroits^1,2. En conséquence, cet insecte menace maintenant la sécurité alimentaire à l’échelle internationale. L’application de nouvelles technologies peut faciliter les études avancées sur la FAW et fournir de nouvelles stratégies pour lutter contre ce ravageur.

La transformation de la lignée germinale des insectes a été utilisée pour étudier la fonction des gènes et générer des insectes transgéniques à utiliser dans le contrôle génétique^3,4. Parmi les différentes méthodes utilisées pour réaliser la transformation génétique chez les insectes, la méthode à base d’éléments piggyBac est la méthode la plus utilisée⁵. Cependant, en raison du faible taux de transposition, il est encore difficile de procéder à la transgénèse chez les insectes non modèles. Récemment, une version hyperactive de la transposase piggyBac (hyPBase) a été développée^6,7. La transformation de la lignée germinale a été réalisée dans FAW récemment⁸, qui est le premier rapport qui a utilisé l’hyPBase chez les insectes lépidoptères. Dans ce rapport, des informations détaillées sur l’utilisation de l’ARNm hyPBase dans la génération de FAW transgénique sont décrites. La méthode décrite ici pourrait être appliquée pour réaliser la transformation d’autres insectes lépidoptères.

Protocole

1. Synthèse in vitro de l’ARNm hyPBase

REMARQUE: La séquence de codage complète de la séquence hyPBase a été synthétisée et insérée dans un vecteur pTD1-Cas9 (voir la table des matériaux)pour produire la construction pTD1-hyPBase, qui contient une cassette exprimant hyPBase, promoteur T7: polyhedrin-5' UTR: hyPBase: polyhedrin-3' UTR: poly (A). La séquence complète de la construction pTD1-hyPBase est fournie dans le matériel supplémentaire.

1. Préparation du gabarit pour la synthèse in vitro
   1. Effectuez une réaction PCR pour amplifier la cassette exprimant hyPBase à l’aide d’un apprêt avant, 5'- atgcggtgtgaaataccgcacagatgcg-3', et d’un apprêt inverse 5'- tagaggccccaaggggttatgctag-3', polymérase haute fidélité et plasmide pTD1-hyPBase comme modèle.
      REMARQUE: La réaction pcR (volume final de 50 μL) contient 5,0 μL de tampon de réaction 10x, 4,0 μL de triphosphate désoxynucléoside de 10 mM (dNTP), 1,0 μL de plasmide (50 μg / μL), 1,0 μL de polymérase haute fidélité, 1,0 μL chacun de 10 amorces avant et arrière et 33 μL d’eau sans nucléase. Les réglages étaient les suivants : une incubation initiale de 95 °C pendant 3 min, suivie de 35 cycles de 98 °C pendant 10 s, 60 °C pendant 15 s et 68 °C pendant 2 min.
   2. Vérifiez le produit PCR sur un gel d’agarose à 1% à 120 V dans un tampon frais d’acide tétraacétique tris-acétate-éthylènediamine (TAE) pendant 30 min et purifiez le produit avec le kit d’extraction en gel.
      REMARQUE: N’utilisez pas le kit de purification du produit PCR. Même une quantité infime du plasmide pTD1-hyPBase diminue considérablement l’efficacité de la synthèse in vitro.
2. Synthèse in vitro de l’ARNm hyPBase à l’aide d’un kit commercial
   1. Décongelez complètement les réactifs congelés, conservez l’enzyme et 2x solution NTP/CAP sur la glace, et laissez le tampon de réaction 10x décongelé à température ambiante.
   2. Assembler la réaction à température ambiante en ajoutant les composants suivants : 2x solution NTP/CAP : 10 μL ; 10x Tampon de réaction: 2 μL; ADN modèle: 0,1-0,2 μg; Mélange enzymatique: 2 μL; Eau sans nucléase jusqu’à 20 μL.
   3. Bien mélanger les réactifs en pipetant doucement le mélange de haut en bas et incuber à 37 °C pendant 2-4 h.
3. Récupération de l’ARNm synthétisé par précipitation de chlorure de lithium
   1. Ajouter 30 μL de solution de précipitation LiCl, bien mélanger en agitant le tube, puis maintenir à -20 °C pendant ≥ 30 min.
   2. Centrifugez à 4 °C pendant 15 min à la vitesse maximale et retirez soigneusement le surnageant.
   3. Lavez la pastille une fois avec 1 mL d’éthanol à 70 %, recentrifugez et retirez soigneusement le surnageant.
   4. Sécher la pastille à température ambiante pendant 1 à 2 min, puis la remettre en suspension avec 20 à 40 μL d’eau sans nucléase.
   5. Diluer 1 μL de solution d’ARNm avec 9 μL d’eau sans nucléase. Prendre 2 μL pour déterminer la concentration d’ARNm et utiliser 8 μL pour vérifier la qualité de l’ARNm sur un gel d’agarose à 1 % à 100 V dans un tampon TAE frais pendant 40 min.
   6. Aliquoter la solution d’ARNm et conserver congelé à -70 °C jusqu’à un an.
      REMARQUE: Ne pas sécher complètement la pastille d’ARNm; il peut être plus difficile de le dissoudre dans l’eau.

2. Microinjection

1. Collecte d’œufs
   1. Placez 12 nymphes mâles et 12 nymphes femelles dans une boîte de 15 cm x 15 cm x 10 cm. Couvrez la boîte avec une serviette en papier. Placez une solution de saccharose à 10% dans la boîte pour nourrir les adultes.
   2. Le jour 2 après l’éclosion, exposez les adultes à une lumière intense pendant la nuit.
   3. Le jour 3 après l’éclosion, transférez les adultes de l’étape 2.1.2 dans un endroit sombre. Prélever les embryons dans les 2 heures suivant la ponte.
   4. Ajoutez des gouttes d’eau sur le morceau d’une serviette en papier avec des œufs frais conservés dans une boîte de Pétri sur de la glace. Transférez doucement les œufs sur une lame de verre avec une brosse fine et alignez-les un par un sur une lame en verre. Gardez les lames de verre avec les œufs alignés sur la glace avant la microinjection.
2. Configuration de la micro-injection
   1. Injecter un mélange d’un plasmide transgénique exprimant la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) (200 ng/ μL), pBac: hr5ie1-EGFP-SV40, ARNm hyPBase (200 ng / μL) et de l’eau distillée stérile dans les œufs, en utilisant la pression de compensation du micro-injecteur automatisé (voir la table des matériaux).
   2. Conserver les œufs injectés à 27 ± 1 °C, 60 ± 10 % d’humidité relative jusqu’à l’éclosion.
   3. Nourrissez les larves écloses avec un régime artificiel et transférez chaque larve dans une petite tasse au début du stade du^3ème stade (~ 6 mm de longueur et la couleur du corps devient noire).

3. Dépistage par fluorescence et croisement génétique

1. Recueillez les nymphes et placez ~150 nymphes femelles et ~150 nymphes mâles dans une cage de 35 cm x 35 cm x 35 cm. Suspendez plusieurs morceaux d’essuie-tout (~30 cm x 15 cm) dans la cage pour ramasser les œufs.
2. Recueillez les serviettes en papier avec les œufs tous les jours et conservez les œufs à 27 ± 1 ° C, 60 ± 10% d’humidité relative jusqu’à l’éclosion.
3. Gardez les larves de nouveau-nés à 4 °C pendant 5 min pour les immobiliser, puis transférez-les sur une plaque glacée.
4. Dépister les larves de nouveau-nés immobilisés sous un stéréomicroscope à fluorescence. Sélectionnez les nouveau-nés EGFP positifs, élevez-les au stade nymphal en ~ 2 semaines à 27 ± 1 ° C et séparez-les par sexe en fonction des différences de phénotype au niveau des segments ventraux de l’abdomen.
   REMARQUE: La nymphe femelle a une ouverture génitale en forme de fente sur le huitième segment abdominal et les marges céphaliques des neuvième et dixième segments se courbant vers l’ouverture génitale. L’ouverture génitale de la nymphe mâle présente une légère élévation sur le neuvième segment abdominal.
5. Placez les nymphes EGFP positives et les nymphes de type sauvage du sexe opposé dans un rapport mâle/femelle de 1:1 dans une cage. Sib-croiser les adultes exprimant l’EGFP pour produire les générations suivantes.

4. Détection par PCR de l’insertion transgénique

1. Extraire l’ADN génomique des larves individuelles de type sauvage et EGFP positif à l’aide de tout kit commercial d’extraction d’ADN génomique en suivant les instructions du fabricant.
2. Effectuer une réaction de PCR en utilisant l’ADN génomique comme modèle; un amorce avant, 5'- acgtacgctcctcgtgttccgttctc-3' situé dans la région promotrice ie1; et un amorce inverse, 5'- aagcactgcacgccgtaggtcag-3' situé dans la région EGFP du vecteur de transformation.
3. Configurez chaque réaction de PCR (volume final de 40 μL) pour contenir 20 μL du mélange de polymérase, 1,0 μL d’ADN génomique (40 μg/μL), 1,0 μL chacun des amorces avant et arrière de 10 μM et 17 μL d’eau sans nucléase. Utilisez les réglages suivants : une incubation initiale de 95 °C pendant 3 min, suivie de 35 cycles de 95 °C pendant 20 s, 56 °C pendant 20 s et 68 °C pendant 40 s.
4. Vérifiez les produits PCR sur un gel d’agarose à 1% à 120 V pendant 30 min.

5. Détermination du site d’insertion transgénique

1. Effectuer une PCR TAIL à haute efficacité en utilisant l’ADN génomique comme modèle pour déterminer le site d’intégration de l’insertion du transgène chez les insectes EGFP positifs.
   1. Effectuer les réactions PCR en suivant les étapes décrites ailleurs⁹.
      1. Utilisez trois amorces, P1: 5'-atcagtgacacttaccgcattgacaagcacgcc-3', P2: 5'-tcacgggagctccaagcggcgactg-3', et P3: 5'-atgtcctaaatgcacagcgacggattcgcgcgct-3', qui sont spécifiques au vecteur piggyBac, dans les 3 cycles de réaction PCR, respectivement.
2. Séquencez les produits PCR finaux pour déterminer le site d’intégration.

Résultats

Une construction pour l’expression du promoteur T7 contenant de l’hyPBase : polyhédrine-5'UTR : hyPBase : polyhédrine-3'UTR : le signal poly(A) a été généré (Figure 1A) et amplifié sous forme de fragment de PCR d’environ 2,2 kb pour synthétiser l’ARNm hyPBase in vitro (Figure 1B). Ensuite, l’ARNm hyPBase a été produit et soumis à l’électrophorèse sur gel d’agarose. L’ARNm de la taille attendue (bande d’environ 1,1 kb) a ?...

Discussion

Le faible taux de transposition et la difficulté d’administrer des composants transgéniques dans des embryons frais limitent le succès de la transformation de la lignée germinale chez de nombreux insectes non modèles, en particulier ceux de l’ordre, les lépidoptères. Pour augmenter le taux de transformation de la lignée germinale, une version hyperactive de la transposase piggyBac la plus utilisée (hyPBase) a été développée^7,10. À ce jo...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5" Dental Cotton Rolls	PlastCare USA	8542025591	REARING
1 oz Souffle Cup Lids	DART	PL1N
1 oz Souffle Cups	DART	P100N	REARING
48 oz Plastic Deli Containers	Genpack	AD48	REARING
Add-on Filter Set (Green)	NightSea LLC	SFA-BLFS-GR	SCREENING
Borosilicate Glass	Sutter Instruments	BF100-50-10	INJECTION
Borosilicate Glass	SUTTER INSTRUMENT	BF-100-50-10
Dissecting Scope	Nikon	SMZ745T	SCREENING
Featherweight Forceps	BioQuip	4750	REARING
Gutter Guard	ThermWell Products	VX620	REARING
Inverted Microscope	Olympus	IX71	INJECTION
Microinjector	Narishige	IM-300	INJECTION
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-1000	INJECTION
Microscope Slides	VWR	16004-22	INJECTION
NightSea Full System	NightSea LLC	SFA-RB-DIM	SCREENING
Nitrogen Gas	AWG/Scott-Gross	NI 225	INJECTION
Paper Towels	Bounty	43217-45074	REARING
Spodoptera frugiperda Artificial Diet	Southland Products, Inc	N/A [Request Species/Quantity]	REARING
Spodoptera frugiperda Eggs	Benzon Research, Inc	N/A [Request Species/Quantity]	REARING
Taq MasterMix			polymerase mixture